Les projets approuvés

Un groupe de rats reçoit vingt-quatre injections intrapéritonéales, un autre six, en plus d'une injection intraveineuse de vecteur viral et de cinq prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. 92 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît une douleur légère à modérée dont l'intensité varie selon la fréquence des injections, tout en affirmant que le prélèvement sanguin terminal dans la veine cave "n'engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux". Tous seront tués à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés constituent des outils de choix. Une seule injection d'un virus adéno-associés permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de nombreux succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur et/ou le produit du transgène. En effet, les réponses immunes dirigées contre le vecteur et/ou le gène thérapeutiques ont été décrites comme pouvant être responsables d’une inefficacité du transfert de gène à long terme, d’effets indésirables ou encore empêcher l’administration du vecteur en cas d’immunité préexistante. Contrôler cette immunotoxicité est aujourd’hui un défi majeur pour le succès en clinique de la thérapie génique. A ce jour, l’une des molécules que nous allons injecter est utilisée comme traitement préventif en transplantation, est utilisée comme immunosuppresseur dans les protocoles de thérapie génique chez le patient. Bien que ce traitement permette, dans la majorité des cas, de maintenir une expression du transgène thérapeutique, il ne permet pas la réadministration du vecteur. L’autre molécule est utilisée dans le traitement de maladies auto-immunes. Une étude préliminaire réalisée chez la souris a montré que ce traitement pouvait moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur et permettre sa ré-administration. Ce projet vise à évaluer l’effet d'un immunosuppresseur sur l’initiation d’une réponse anti-vecteur et anti-transgène dans un modèle de rat qui, contrairement à la souris, présente ces deux réponses après injection d'un virus adéno-associés par voie intraveineuse .

Bénéfices attendus

Le projet devrait permettre de prévenir la réponse immunitaire après injection de vecteur de virus adéno associés dans le but de développer des stratégies de thérapie génique plus sûres et plus efficaces pour le patient.

Procédures

Les 92 rats subiront une injection par intraveineuse de vecteur ou de sérum physiologique et 5 prélèvements sanguins. Des protocoles d'anesthésie et d’analgésie seront mis en place selon la procédure. Les injections et les prélèvements sanguins se dérouleront sous anesthésie gazeuse de courte durée (environ 5 à 10min). Les rats du groupe 3 recevront 6 injections d’une molécule en intrapéritonéale. Les rats du groupe 4 recevront 24 injections d’une autre molécule en intrapéritonéale. Une injection en intrapéritonéale se réalise en moins de 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse, due à la pénétration de l’aiguille. Les animaux ressentiront également une douleur légère à modérée, dont l’intensité pourra varier selon le groupe expérimental et la fréquence des injections, en raison de l’insertion de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales .

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapies géniques développés à l’aide des virus adéno-associés consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes. Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-virus adéno associés et anti-transgène ainsi qu’une hépatotoxicité similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’Homme, l’apparition et l’intensité d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire chez des rats. Le nombre de 10 animaux par groupe a été déterminé. Pour comparer la réponse immunitaire entre les différents groupes de l’étude, nous utiliserons une méthode statistique permettant d’identifier d’éventuelles différences entre eux. Les analyses sont conçues pour détecter de manière fiable des effets importants, tout en limitant le risque de conclure à tort qu’une différence existe. Ce choix repose sur des résultats préliminaires montrant une forte réaction immunitaire dans le foie ainsi que sur l’efficacité déjà observée d'un immunosuppresseur pour moduler la réponse immunitaire chez la souris.

Raffinement

Toutes les interventions sur les animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux.Pour l'euthanasie, le prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave n’engendrera pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement des tunnels en carton et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Nous utilisons un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire après injection de fortes doses d'un virus adéno associés. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection d'un virus adéno associés à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

Une injection dans le cerveau sous anesthésie, une heure d'intervention, puis vingt-neuf jours avant la mise à mort, neuf macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois vecteurs de thérapie génique contre la maladie de Huntington sont testés, à raison de trois animaux par vecteur, l'enjeu déclaré étant de déterminer lequel atteint le mieux sa cible dans le cerveau. Le porteur indique que l'administration intracérébrale peut provoquer un saignement dans le cerveau et des troubles de la locomotion, et les neuf animaux sont tués à l'issue pour prélever leurs organes. Il justifie l'emploi de jeunes adultes par la volonté d'écarter les anomalies liées au vieillissement, et écrit que les similitudes entre cerveaux de macaques et cerveaux humains rendent cet emploi "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le suivi dans le corps de candidats médicaments innovants développés pour le traitement de la maladie d’Huntington après administration dans le cerveau. Huntington est une maladie qui affecte les fonctions motrices et entraine une détérioration physique et mentale chez l'Homme. Il n'existe actuellement aucun traitement sur le marché permettant de la soigner, de retarder son apparition ou de ralentir sa progression. Les candidats médicaments testés visent à corriger la cause sous-jacente de la maladie et non traiter ses symptômes. Cette étude permettra de sélectionner le médicament qui atteignera le mieux sa cible après administration.

Bénéfices attendus

En cas de succès, l’administration unique de ce médicament, au plus proche de sa cible (directement dans le cerveau) permettra d’induire un ralentissement significatif de la progression de la maladie.

Procédures

Après plus de trois semaines d’acclimatation et d’habitation, les 9 animaux inclus dans le projet recevront une injection du candidat médicament dans le cerveau sous anesthésie et analgésie (après mise à jeun inférieure à 16h). L’intervention durera environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile (3 prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur une période de 29 jours). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 5 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids, température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée par semaine par animal sera réalisée. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x/jour le jour de l’administration et 1x/jour durant 3 jours après l’administration. Le projet prendra fin 29 jours après l’administration du candidat médicament et les 9 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration dans le cerveau pourra provoquer une douleur modérée avec des risques neurologiques (saignement dans le cerveau, trouble de la locomotion…) et/ou l'apparition de réactions locales au niveau de la plaie chirurgicale (du type hématome, gonflement, saignement léger, infection par exemple). Durant les administrations, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress ou une sensation d’inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d’induction (contention, administration, perte de conscience…) ou lié au réveil de l’animal (risque de vomissement, perte d’équilibre…). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome léger). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 9 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des candidats médicaments testés.

Remplacement

Les études permettant de déterminer le suivi des candidats médicaments dans le corps sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer sa localisation dans les différents tissus après administration. Cette étude dépend d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant et complexe (ex : échanges entre les tissus, barrières biologiques…). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Ceci ne pourrait être obtenu en culture cellulaire et justifie le recours à des animaux.

Réduction

9 primates répartis en 3 groupes seront utilisés dans ce projet. 3 médicaments seront testées, chacun sur 3 animaux. 3 animaux seront utilisés par groupes car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel, de la litière pour leur permettre de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent, des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs). De la musique d'ambiance/des documentaires/dessins animés seront diffusés pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plus de 3 semaines sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif. Elle permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, pesée, prises de sang). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l’étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un suivi spécifique neurologique sera également mis en place. Pour limiter le stress et l’ennui lié aux actes techniques, le personnel veillera à interagir avec les animaux en gardant une interaction quotidienne avec chaque animal. L'administration des médicaments dans le cerveau sera réalisée sous anesthésie et anti-douleurs. Des antibiotiques et des anti-inflammatoires seront également utilisés pour le confort des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile afin d’éviter les modifications physiologiques de l’animal et le stress, engendrés par une anesthésie, ainsi qu’un risque plus important pour l’animal que la procédure elle-même. Des points limites seront mis en place afin de détecter précocement tout signe de stress ou de douleur. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’état de l’animal se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates constituent un modèle animal de référence pour déterminer le suivi de candidats médicaments dans le système nerveux avant les essais cliniques chez l’Homme. En effet, il est admis que les primates présentent de nombreuses similitudes avec l’Homme que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie d'ADN, de grandes similitudes entre les cerveaux de primates et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de rongeurs. Cette espèce apporte donc les meilleures données transposables à l’Homme. L’ensemble de ces similitudes avec l’Homme rend son emploi indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes animaux seront utilisés dans ce projet. Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux, ce qui pourrait interférer avec les résultats scientifiques de l’étude et la qualité des échantillons prélevés. Leur organisme a atteint la maturité mais ne subit pas encore les variations liées au vieillissement. Il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge.

Dix macaques à longue queue subissent une même opération de quatre heures combinant une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une par voie intraveineuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous seront tués pour analyser où se distribuent les vecteurs viraux testés. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie du vitré, de décollement de rétine et de troubles de l'audition et de l'équilibre. Il justifie le recours au primate par l'échec fréquent, chez le singe, des vecteurs sélectionnés sur la souris.

Objectifs

Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.

Bénéfices attendus

Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h. Un isolement physique pendant la durée d'observation (7 à 15 jours) après les administrations est possible, si aucun animal compatible socialement et scientifiquement n'est disponible.

Impact sur les animaux

Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.

Devenir

Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.

Réduction

L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité. Pour l'isolement des animaux, celui ci ne serait que physique, et l'ajout d'enrichissements spécifique sera mis en place dès la phase de réveil.

Choix des espèces

Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.

Ponctionnées chaque semaine à la jugulaire sous anesthésie pendant dix à quatorze semaines, 440 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral, des cellules immunitaires humaines, puis des injections répétées de lipopolysaccharide et d'interleukine pour moduler la réponse immunitaire. Le résumé ne décrit comme atteinte qu'une "légère douleur" au point de piqûre, sans mention des effets des produits inflammatoires injectés. Les animaux sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire anti-AAV semble être dépendante de nombreux facteurs et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. Le profil immunologique du patient peut également être un facteur déterminant dans l’initiation de la réponse immune anti-AAVr. Le modèle ainsi développé va nous permettre de déterminer une signature immunologique pouvant déclencher un rejet du traitement et de développer des stratégies d’immunomodulation ciblée. Ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, différentes signatures immunitaires identifiées chez des donneurs sains et de développer une stratégie pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de mieux comprendre les réponses immunitaires responsables du rejet du traitement et de développer une stratégie pour moduler cette réponse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les cellules immunitaires responsables du rejet du transgène et de développer une stratégie dans le but de prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur. In fine, ce projet permettra de développer des traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr, plus sûrs et plus efficaces.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 10 semaines pour les animaux inclus dans la caractérisation de la réponse immunitaire et 14 semaines pour ceux inclus dans la stratégie d’immunomodulation. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale en vigile. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 3 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide à J+1, J+2, J+3 après l’injection en intraveineuse du vecteur. Une injection en intra-péritonéale se fait en moins d’une minute. Des injections en intra-péritonéale d’interleukine-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 10 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la stratégie d’immunomodulation anti-CD45RC, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse (isoflurane : induction 5% puis 2%)

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins, les animaux seront sous anesthésies gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin due à la pénétration de l’aiguille. Pour les injections en intraveineuse et en Intra péritonéale, les souris seront maintenues en contention pour effectuer l’administration. Les animaux ressentiront une légère douleur au point d’administration due à la pénétration de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de développer un modèle pertinent mimant cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains par stratégie . Au maximum, 440 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autres alternatives). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans les études de thérapie génique et d’immunologie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, en particulier des mammifères, afin d’obtenir des résultats pertinents pour l’humain. La souris est très utilisée, notamment parce qu’il existe des modèles dits « humanisés » qui reproduisent en partie le système immunitaire humain. De plus, il est facile de constituer des groupes suffisamment nombreux pour réaliser des analyses statistiques fiables. Ce modèle est particulièrement adapté au transfert de cellules humaines (appelé transfert adoptif), car ces cellules peuvent survivre et fonctionner correctement chez la souris. Cependant, pour que ces cellules reconnaissent correctement leur environnement, il est indispensable que la souris exprime une molécule spécifique du système immunitaire humain : HLA-A2.1. En effet, les cellules humaines utilisées sont capables de reconnaître uniquement cet allèle. Enfin, comme une réponse immunitaire préexistante contre les vecteurs AAV a déjà été démontrée dans ce modèle de souris NSG HLA-A2, celui-ci est particulièrement pertinent pour tester et développer de nouvelles stratégies visant à moduler ou contrôler la réponse immunitaire. Les souris seront injectées entre 8 et 14 semaines d’âge. A ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie des cellules adoptives transférées sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

Des prélèvements sanguins tous les deux jours pendant une semaine, jusqu'à trois injections intraveineuses dont deux à trente minutes d'intervalle sur deux sites distincts : 197 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre molécules capables de dégrader les anticorps circulants sont testées à trois doses chacune, pour rendre possible une seconde administration de vecteurs AAV chez des personnes déjà immunisées. Le porteur situe le bénéfice au stade de la preuve de principe, qui "ouvrira la porte" à d'autres études avant tout passage en clinique. Il justifie le choix de la souris C57BL/6 par la disponibilité de données précliniques et par une petite taille qui limite les volumes biologiques requis.

Objectifs

Les vecteurs adéno‑associés (AAV) sont des virus naturellement inoffensifs que l’on vide de leur contenu pour en faire de petits transporteurs capables d’apporter un gène thérapeutique. Ils permettent ainsi de traiter certaines maladies génétiques dépourvues de traitement curatif, grâce aux avancées de la thérapie génique. Cependant, comme ces virus circulent largement dans la population, beaucoup de personnes ont déjà été exposées et possèdent des anticorps capables de les reconnaître et de les neutraliser. Le système immunitaire garde en mémoire ces anticorps : en cas de nouvelle exposition, il réagit rapidement et massivement. Cette protection naturelle peut devenir un obstacle pour la thérapie génique, car les anticorps anti‑AAV peuvent empêcher le traitement d’agir. Certaines personnes ne peuvent donc pas recevoir un traitement par AAV, et celles qui en ont déjà reçu un développent ensuite des anticorps rendant une seconde administration difficile. Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour contourner cette limite. Il repose sur l’utilisation de molécules capables de réduire temporairement la quantité d’anticorps circulants, y compris ceux dirigés contre les AAV. Contrairement aux immunosuppresseurs classiques, qui affaiblissent globalement le système immunitaire, ces molécules agissent de façon plus ciblée, plus rapide et pour une durée limitée, ce qui réduit le risque d’effets secondaires. Quatre molécules ayant déjà montré leur efficacité sur des cellules en laboratoire seront testées chez la souris, chacune à trois doses différentes. L’objectif est d’identifier la dose la plus efficace pour diminuer les anticorps dans le sang et déterminer la durée de cet effet. À cette dose, on vérifiera ensuite si chaque molécule permet l’administration d’un vecteur AAV même en présence d’anticorps préexistants. Enfin, la molécule la plus prometteuse sera évaluée dans un protocole simulant une réadministration, étape essentielle pour permettre des traitements durables en thérapie génique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de définir un immunomodulateur efficace à dégrader les immunoglobulines in vivo et de faire la preuve de principe qu’il est possible en l’utilisant de réaliser un transfert de gène médié par l’AAV efficace voire de réaliser une réadministration AAV. Ces démonstrations ouvriront la porte à d’autres études visant à amener cette stratégie en clinique.

Procédures

Dans ce projet, les traitements, qu’il s’agisse des AAV, des immunoglobulines ou des immunomodulateurs seront administrés soit sur animal anesthésié, en moins de 3 min., soit sur animal vigile, en moins de 2 min. Sur une durée expérimentale de 21 à 49 jours, les animaux recevront au cours des protocoles au maximum 3 injections par voie intraveineuses espacées de 24h à plusieurs jours. Cependant, une seule fois, deux injections seront réalisées à trente minutes d’intervalles à deux sites bien distincts. Des prélèvements sanguins sont effectués régulièrement pour le suivi biologique à raison d’une fois par semaine, sauf après l’injection des composés immunomodulateurs, où la fréquence passera à tous les deux jours pendant 7 jours. Ils seront réalisés sur animal vigile (très courte durée

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur et stress) attendues sur les animaux sont estimées de degré de gravité de légère à modérée. Elles sont liées à la nature des différents actes réalisés. Les actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisées sous anesthésie gazeuse (classe légère). Une des nuisances est liée à la douleur de l’injection lors de l’administration des molécules ou lors des prélèvements sanguins (classe légère). Une nuisance liée à l’acte d’anesthésie est que celle-ci peut entrainer une sécheresse oculaire (classe légère). Une seule fois dans l’étude, deux injections sont à réaliser dans une fenêtre de 30 minutes et sont donc faites à deux sites distincts, l’une sur animal vigile et l’autre avec anesthésie (classe modérée). Dans une partie de l’étude, des prélèvements sanguins seront réalisés une fois tous les 2 jours sur une courte période de 7 jours (classe modérée).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.

Remplacement

Avant d’envisager un traitement chez l’animal, nous réalisons d’abord des tests en laboratoire sur des cellules (tests dits in vitro). Cela nous permet d’éliminer les approches qui ne sont pas efficaces et de mieux comprendre comment certains composés agissent. Ces premières études ont déjà montré que certains immunomodulateurs peuvent réduire les anticorps qui empêchent les vecteurs AAV d’agir correctement, et ainsi améliorer leur efficacité sur les cellules. Toutefois, les expériences sur cellules ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du système immunitaire dans un organisme vivant. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal, en l’occurrence la souris, dont le système immunitaire présente des similarités importantes avec celui des autres mammifères. Ce modèle nous aidera à vérifier si les traitements sont bien tolérés et efficaces dans un organisme complet, avant d’envisager des applications chez l’humain.

Réduction

Ce projet a été conçu pour limiter au strict minimum le recours aux animaux, en ne réalisant que les expériences jugées indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques. La sélection méticuleuse sur des cellules (in vitro) des immunomodulateurs les plus pertinents permet de réduire au mieux le nombre d’animaux nécessaires aux approches expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour déterminer le nombre de souris par groupe, afin de garantir des résultats fiables, tout en évitant l’usage excessif d’animaux. Les mêmes souris témoins seront utilisées dans plusieurs expériences, en tant que groupes contrôles pour différentes conditions expérimentales.

Raffinement

Les interventions potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie appropriée, précédée d’un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang seront effectués avec une méthode rapide (moins de 2 minutes) et bien tolérée, avec un faible volume et une alternance des deux côtés pour limiter les effets locaux. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Une attention particulière est également portée au risque d'infection, notamment durant les phases de vulnérabilité immunitaire induites par certains traitements, avec des mesures barrières renforcées pour limiter toute exposition.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour sa pertinence scientifique, sa compatibilité avec les vecteurs AAV et la disponibilité de données précliniques robustes. Cette souche présente une réponse immunitaire bien caractérisée et répertoriée dans de nombreuses publications, permettant une évaluation précise des effets des immunomodulateurs sur la neutralisation des vecteurs viraux. Elle est largement utilisée dans les études de thérapie génique, notamment pour la validation de stratégies de transduction et de réadministration d’AAV, facilitant ainsi la comparaison avec les données existantes. Sa petite taille permet de limiter les volumes biologiques requis tout en assurant une puissance statistique suffisante avec un nombre réduit d’animaux. L’utilisation de ce modèle s’inscrit pleinement dans le respect des principes des 3R, en particulier la réduction, grâce à l’optimisation des conditions expérimentales et à l’exploitation des résultats obtenu. Les souris de génotype sauvage sont réceptionnées au stade jeune adulte, pour une période d’acclimatation avant leur utilisation expérimentale entre 4 à 12 semaines d’âge. À ce stade, le système immunitaire est mature. De plus, leur condition physique est optimale pour les études de thérapie génique, notamment celles ciblant le tissu musculaire, car l’efficacité du transfert de gène rapporteur et son expression sont significativement plus élevées chez les jeunes adultes comparé aux animaux plus âgés. Ce choix d’âge garantit ainsi la robustesse des résultats.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse unique d'un mélange de vecteurs viraux, puis quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, douze pesées et sept prises de température rectale, parfois en chaise de contention. La mise à mort sert à prélever le cœur, le foie, le muscle et le cerveau pour y mesurer la diffusion des vecteurs. Le porteur affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" au développement des thérapies géniques et que seul le primate fournit des données transposables à l'humain.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAV) sont devenus la référence pour le transfert génique, en raison de leur efficacité, de leur sécurité favorable, de la capacité de production à grande échelle et de leur capacité à assurer une réponse durable. Cependant, certains défis, tels que le coût élevé de fabrication, parfois une faible spécificité pour la cible d’intérêt et les barrières immunitaires, continuent de limiter l’accessibilité, l’efficacité et la sécurité des traitements. De plus, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV, les empêchant d’être efficaces. La présence de ces anticorps excluent une grande partie des patients des thérapies géniques actuellement disponibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer la biodistribution de plusieurs vecteurs AAV conçus pour éviter la réponse immunitaire chez des animaux séronégatifs ou faiblement séropositifs pour les AAV ciblés. En évaluant la transduction dans différents organes d’intérêt (muscle, le cœur, le foie, le cerveau, etc.), et en combinant ces données avec celles obtenues précédemment (non publiées) sur les capacités de production, l’efficacité de transduction et l’évitement des anticorps in vitro, le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble de ces propriétés. Si les résultats s’avèrent concluants, ces vecteurs pourraient constituer une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des maladies génétiques notamment les troubles musculosquelettiques, avec des améliorations significatives en termes d’accessibilité, de sécurité, de spécificité et d’efficacité.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques et notamment celles liées aux troubles musculosquelettiques. Le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble des proriétés évaluées (ten particulier la transduction dans les tissus cibles).

Procédures

Tous les animaux du projet auront la même procédure. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant plus d’un mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) d'environ 2 semaines avant le début du projet. Les animaux vigiles recevront une administration unique du pool de vecteurs par voie IV (moins de 1 minutes si bolus ou moins de 30 min si IV lente sur siège). Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de moins de 3 ml, pour un volume total prélevé de 12 ml sur 4 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Le suivi des poids (12 fois) et de la température corporelle (7 fois) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance.

Impact sur les animaux

La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux pourront être placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les pesées (12 fois) ainsi que les mesures de température rectale (7 fois) peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et de mesurer la transduction des transgènes dans différents organes

Remplacement

Les études de biodistribution chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique ainsi que le taux de transduction. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme notamment concernant la transduction avec les vecteurs AAV et l’évitement de la réponse immunitaire. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates répartis en 2 lots (1 lot séronégatif et un lot légèrement séropositif). Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le choix d’inclure deux animaux par groupe nous permettra d’apprécier la variabilité interindividuelle tout en gardant le statut préliminaire de l’étude. L’utilisation de deux animaux par groupe permet également de distinguer un effet lié au traitement d’un événement isolé ou accidentel, limitant ainsi le risque de devoir refaire l’étude et, in fine, à l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet d’environ 40 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention si besoin). Durant les administrations, les animaux pourront être assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

Les singes cynomolgus constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes par les vecteurs viraux avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, la proximité anatomique, physiologique et immunologique des primates avec l’être humain signifie que les profils de biodistribution, de tropisme des tissus, de réponse immunologique aux capsides AAV et d’efficacité de transduction sont plus prédictifs de ce qui pourrait être observé chez l’humain, comparés aux modèles rongeurs. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux. Aussi l’utilisation d’animaux jeunes est justifiée par une probabilité plus élevée de séronégativité ou faible séropositivité vis-à-vis des virus adéno-associés (AAV). En effet, l’exposition naturelle aux AAV et le développement d’anticorps neutralisants augmentent avec l’âge, ce qui rend les animaux plus âgés plus susceptibles d’être séropositifs.

Pour mettre au point une thérapie génique contre la dégénérescence maculaire liée à l'âge, 584 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin de chaque procédure. La maladie leur est provoquée aux deux yeux au laser sous anesthésie, après une injection du vecteur directement dans l'œil, puis les vaisseaux sont observés par angiographie jusqu'à cinq fois. Le porteur indique que ces injections et la photocoagulation induisent une douleur modérée, couverte selon lui par l'anesthésie générale et un anesthésique local. Il écrit ensuite qu'aucune procédure de la demande ne doit provoquer douleur, perte de poids ou de mobilité, ni modifier le comportement.

Objectifs

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) concerne plus d’un million de personnes en France, sa fréquence d'apparition augmente avec l’âge ; elle est ainsi la première cause de cécité des personnes de plus de 50 ans. L’objectif de ce projet est de développer un meilleur traitement pour traiter la dégénérescence maculaire lie à l'âge (DMLA). Aujourd'hui, les traitements consistent en des injections intraoculaires de médicaments, chez les patients, qui doivent être renouveler, entre douze et 6 fois par ans, et ceci à perpétuité. Cette régularité et consistance de traitement est essentiel pour conserver le bénéfice du traitement et d'éviter la perte de vision qui est progressive chez ces patients. Dans les faits, la plupart des patients arrêtent ces traitements après 2 à 5 ans, et perdent le bénéfice en termes de vision. En plus d'être douloureuses pour les patients, ces injections intra oculaire présentent un risque mineur de complication à chacune de ces interventions. Chez ces patients qui sont généralement âgée de plus de 65 ans, il est aussi plus complexe logistiquement d'organise ces suivis répétés, pour une population qui est en croissance et déjà forte de plusieurs millions rien qu'en France. Nous souhaitons développer une thérapie génique qui permettrait en une seule injection chez le patient, de traiter la cause de la DMLA. Cette approche permettrait à l'œil de produire directement et en continue, les molécules thérapeutiques qui empêchent la progression de la DMLA. Ainsi, nous espérons améliorer la vision des patients a long terme, faciliter le traitement pour les patients, leurs aidants, ainsi que pour les services de santé. L'objectif de notre projet est donc d’évaluer l’efficacité de candidats thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de la DMLA humide sont administrés par injection intravitréenne tous les 1-2 mois afin de maintenir des niveaux efficaces du médicament dans l’œil. Néanmoins, le poids de ce type de traitement pour les patients, leurs familles et les organismes de soins est tel que la fréquence des injections nécessaires pour contrôler efficacement la maladie n’est souvent pas respectée. Le projet proposé vise à développer une approche thérapeutique nécessitant une injection oculaire unique chez les patients, qui pourront eux même produire les molécules thérapeutiques à un niveau optimal et sur le long terme. Cela a pour objectifs, une meilleure prise en charge clinique des patients et de leurs maladies, ainsi qu’une amélioration de leur qualité de vie.

Procédures

Pour recréer la maladie dans la rétine, nous utiliserons un laser pendant que l'animal est profondément endormi. Cette opération est réalisée une seule fois sur les deux yeux et dure 10 minutes au total. L'administration du traitement est faite en amont par une piqûre directement dans l'œil, toujours pendant que l'animal dort et ne ressent pas de douleur. Ce geste est également effectué une seule fois, dans les deux yeux, et ne prend que 5 à 10 minutes par animal. L'observation des vaisseaux sanguins (angiographie) se fera également pendant que l'animal dort. Cet examen sera réalisé sur les deux yeux (entre 1 et 5 fois maximum) et dure 15 minutes au total.

Impact sur les animaux

Toutes les procédures ont lieu sous anesthésie générale de l’animal. Dès l’injection de l’anesthésique, les animaux seront placés dans une cage séparée sur tapis chauffant en attendant la suite de la procédure pour un endormissement paisible de l’animal. Une application de gel ophtalmique sera réalisée afin d’éviter la sécheresse oculaire. Les différentes procédures sur l’œil telle que les injections intravitréennes (IVT), injections sous rétiniennes (SRI) ou la photo coagulation laser induisent une douleur modérée. L’anesthésie générale et l’analgésie suffisent à éviter la douleur. De plus, une anesthésie locale du globe sera réalisée. Elles seront également réalisées sur tapis chauffant pour éviter toute diminution de température de l’animal. A l'issue de ces étapes, une pommade ophtalmique sera appliquée afin de prévenir toute réaction inflammatoire ou infection de l'œil. La procédure d’angiographie est une technique d'imagerie exploratoire non invasive. Elle ne génère aucune douleur et l’anesthésie générale est utilisée pour éviter le stress de la contention et permettre un examen plus rapide en immobilisant l’animal. Pour leur réveil, les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant, chaque animal recevra un bolus de sérum physiologique en sous cutanée avant le réveil pour éviter toute déshydratation. Les animaux seront contrôlés jusqu’aux premiers signes de réveil (mouvements de tête par ex.) puis replacés dans leur cage. Aucune procédure de cette demande d’autorisation ne doit provoquer douleur, perte de poids ou de mobilité, ni modifier le comportement. Tout est mis en œuvre afin d’éviter ces nuisances ou effets indésirables

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de mesurer la performance des molécules testées, et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Afin de réduire le nombre de candidats thérapeutiques évalués in vivo, un criblage et une validation a d’abord été réalisée in vitro. Cela a permis de sélectionner parmi plusieurs dizaines de candidats thérapeutiques, ceux dont l’expression et l’activité biologique étaient la meilleure. En bref, ce criblage a été réalisé sur lignées cellulaires humaines, puis sur explants de rétine porcine. Cela nous a aussi permis d’optimiser les séquences des candidats. Par ailleurs, il n'existe pas de modèle in vitro représentatif de la DMLA exsudative, c’est pourquoi, avoir recours à un œil sur animal vivant est indispensable afin d’évaluer l’effet thérapeutique de nos candidats optimisés sur un organisme entier et fonctionnel.

Réduction

Des études pilotes sont prévues afin de standardiser au mieux les différentes procédures expérimentales et réduire de façon importante le nombre d'animaux à utiliser et obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les études longitudinales d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux utilisés en gardant le même animal pour plusieurs temps après l’induction de la maladie.

Raffinement

Les rats seront par ailleurs stabulés 2 par cage avec un environnement enrichi afin de réduire le stress. Les animaux seront anesthésiés et analgésie lors des procédures, afin de limiter le stress de la manipulation et de la contention ainsi qu'une douleur éventuelle. En cas d’observation de signes de douleurs, au moment des procédures, une administration supplémentaire d'anesthésiques et/ou d’analgésique, sera réalisée. En complément, un analgésique sera instillé localement, dans le sac conjonctival inférieur pour éviter toute douleur au niveau du globe. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué pendant chaque anesthésie pour éviter la sécheresse oculaire. Afin de limiter le risque d’hypothermie, les animaux seront endormis dans une cage séparée sur tapis chauffant, conserve sur celui-ci lors des procédures d’injection oculaire et lors du réveil. Afin de limiter le risque de déshydratation, chaque animal recevra un bolus de sérum physiologique en sous cutanée avant le réveil. En cas de blessure ou de souffrance non liées à la procédure (type blessures corporelles), un avis vétérinaire sera demandé afin de définir le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très largement utilise et reconnu pour l’évaluation et le développement préclinique de nouveaux médicaments contre la DMLA. Les conditions d'inductions du modèle sont largement décrites dans la littérature, la mise en place du modèle a donc nécessité l'utilisation d'un nombre réduit d'animaux. En l’absence de modèle in vitro, c’est le modèle animal le plus adapté pour notre développement pré-clinique, afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de notre approche thérapeutique.