Les projets approuvés

Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.

Objectifs

Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).

Réduction

Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.

Raffinement

Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.

288 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue, pour étudier le rôle du microbiote dans une forme de rhumatisme inflammatoire. Chaque animal reçoit six administrations orales de composés bactériens puis est suivi six mois, développant diarrhée, arthrites des pattes arrière et, spontanément, une inflammation des testicules. Le modèle transgénique est présenté comme le "seul" à reproduire l'ensemble des atteintes de la maladie. Le porteur juge son usage "indispensable" pour disséquer les mécanismes, en vue d'une application chez l'humain.

Objectifs

La Spondylarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de la maladie et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car c’est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat surexprimant le gène d’intérêt constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA.: une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une un ensemble normal des microbes (bactéries surtout) vivant naturellement dans un organisme (par exemple dans l’intestin), ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène de ces microbes et de leurs constituants pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des ces microbes à des rats puis à évaluer l’activation des cellules du système immunitaire et s’ils sont capables d’induire la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de révéler les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La spondylarthrite (SpA) est une maladie complexe qui résulte à la fois de facteurs héréditaires et de l’environnement. Elle provoque une inflammation anormale dans l’organisme, entraînant des douleurs importantes et un handicap, souvent chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, seulement des traitements pour en atténuer les symptômes. Mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les micro‑organismes vivant naturellement dans l’intestin (le microbiote) pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation d’un modèle animal chez le rat est indispensable pour étudier ces mécanismes en détail et analyser des tissus touchés par la maladie, comme les articulations, qui ne peuvent pas être prélevés régulièrement chez l’être humain. De plus, les études visant à modifier le microbiote doivent d’abord être réalisées chez l’animal avant toute application chez l’Homme. De telles recherches ont déjà permis, par le passé, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dont certaines sont aujourd’hui utilisées avec succès en pratique clinique.

Procédures

Lors de la procédure, les rats recevront 6 administrations de composés bactériens par voie orale (durée 15 secondes). Les animaux seront suivis ensuite pendant 6 mois pour le développement de la SpA. Des prélèvements de selles fraîches seront effectuées au cours de l’expérimentation à raison de 1 fois toutes les 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée une inflammation testiculaire en conditions stériles. À la suite de la colonisation par des bactéries les rats peuvent développer une SpA. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée qui sera accompagnée par des arthrites (inflammation au niveau des articulations) aux pattes arrière. Ces arthrites évoluent au cours du temps et certaines se résorbent complètement (environ 20% des cas). Les administrations par voie orale et la collection des selles présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

Tous les animaux issus de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure. Les organes et tissus seront ensuite collectés pour des analyses biologiques et histologies et ajoutés dès que possible à une biobanque limitant des ajouts futurs d’animaux

Remplacement

Les cultures cellulaires in vitro ne sont pas adaptées pour étudier l’interaction hôte–microbiote dans ce contexte, car la maladie étudiée est complexe et implique plusieurs organes (intestin et articulations). Ces modèles simplifiés risquent de ne pas reproduire les mécanismes biologiques pertinents et ne permettent pas de maintenir les conditions anaérobies nécessaires au microbiote. Il est donc nécessaire de recourir à un organisme vivant. Des tests in vitro sont néanmoins réalisés en amont pour vérifier l’absence de toxicité des substances testées.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant que les conclusions tirées d’une étude sont fiables et peuvent être considérées avec confiance afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs tests statistiques préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet réel, fiable et peu probable d’être dû au hasard. Des tests pour déterminer l’effet sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (6 animaux par groupe) Ce projet s’inscrit dans une thématique importante avec des projets similaires menés dans d’autres établissements. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est présente. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. L'administration d'un médicament analgésique est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA. En cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant la SpA. Les rats surexprimant le gène d’intérêt permettent ainsi d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats surexprimant le gène d’intérêt est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage chez le rat : période de colonisation bactérienne) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle des composant du microbiote lors du développement de la SpA du rat.

Pour étudier les mécanismes inflammatoires d'une arthrite provoquée dans deux modèles, 898 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Réparties sur trois établissements, elles subissent jusqu'à vingt et une injections, une irradiation de quatre minutes, des prélèvements sanguins et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur affirme que l'animal entier est "indispensable" car la réponse inflammatoire résulte d'interactions complexes entre organes. La majorité est tuée pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, une partie conservée pour l'élevage des lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Mises à mort pour la plupart afin de prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée pour étudier deux formes d'arthrite provoquée. Elles reçoivent jusqu'à vingt-et-une injections, une irradiation de quatre minutes, cinq prélèvements sanguins et six séances d'imagerie sous anesthésie, réparties entre trois établissements. Le développement de l'arthrite provoque des douleurs articulaires et une perte de mobilité, et le transport entre sites ajoute une source de stress. Une partie des animaux d'élevage porteurs du bon génotype est conservée pour entretenir les lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

Soumises à une irradiation de quatre minutes puis à des injections répétées, jusqu'à vingt-et-une par animal, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée. Ce volet d'un projet mené sur trois établissements provoque deux formes d'arthrite pour en étudier les mécanismes inflammatoires. Les atteintes attendues sont des douleurs articulaires, une baisse de mobilité et un stress lié aux manipulations, à l'imagerie et aux transports entre sites. La plupart des souris sont tuées pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, quelques reproducteurs au bon génotype étant gardés pour les lignées.

Objectifs

La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite. Ce projet se déroulera dans 3 EU différents.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

4 648 rats porteurs du gène humain HLA-B27, qui développent spontanément une spondylarthrite, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. La majorité sert à l'élevage des lignées, les autres subissent un stress par immobilisation deux heures par jour pendant deux semaines, des administrations de composés bactériens ou des injections de cellules immunitaires. Le porteur indique que ces rats développent colite, inflammation articulaire et atteintes de la peau, avec un antalgique prévu au-delà d'un score articulaire de 8 sur 16. Il affirme que ce modèle est le seul à reproduire toutes les atteintes de la maladie et le juge "indispensable".

Objectifs

La Spondyloarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de SpA et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car la SpA est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques lors de la SpA car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat transgénique pour ce gène constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA et est considéré comme le modèle le plus pertinent d’étude. Dans ce modèle surviennent spontanément toutes les manifestations de la SpA : une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une flore microbienne conventionnelle, ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène des composants du microbiote et des cellules immunitaires pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des composants du microbiote à des rats ainsi qu’à des rats contrôles puis à évaluer l’activation des cellules immunitaires et la sévérité de la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de disséquer les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

La SpA est une maladie multifactorielle impliquant des facteurs génétiques et environnementaux menant à une dérégulation inflammatoire. La SpA est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes et il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires liés aux constituants du microbiote permettra de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’utilisation de ce modèle est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques et de pouvoir accéder aux tissus d’intérêt de la SpA, car l’accès en routine aux biopsies humaines (notamment de ganglions lymphatiques, de moelle osseuse ou de tissu synovial d’articulations inflammées) n’est pas envisageable. Par ailleurs, les expérimentations de modifications du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Enfin, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles qu’un médiateur soluble produit par les cellules immunitaires aujourd’hui utilisé en clinique.

Procédures

Les différentes lignées de rats seront élevées et maintenues lors de la procédure 1(3 600 animaux). Le projet s’articule ensuite selon 4 procédures indépendantes avec un animal n’étant impliqué que dans une seule de ces 4 procédures. Lors de la procédure 2, les animaux seront soumis à un stress contrôlé par immobilisation 2 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 2 semaines. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 144 animaux. Lors de la procédure 3, les animaux recevront plusieurs administrations de composés bactériens, 5 fois par semaines pendant 3 semaines par voie orale. En cas d’échec de la voie oral, les animaux seront soumis à deux administrations de composés bactériens en 1 seul jour par voie sous-cutanée ou intradermiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 360 animaux. Lors de la procédure 4, les animaux seront soumis à une injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 384 animaux. Enfin, lors de la procédure 5, les animaux seront administrés avec des agents biologiques et chimiques (candidats thérapeutiques) par infusion continue en utilisant des pompes osmotiques. Le nombre d’animaux pour cette procédure est de 160 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée les symptômes de la SpA à partir de 3-4 semaines d’âge. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une colite qui sera accompagnée dans 15% des cas par des atteintes articulaires. Ces inflammations articulaires varient au cours du temps et certaines se résorbent sur le temps (environ 20% des cas). Les animaux seront suivis pour le développement de ces symptômes à l’aide d’une grille d’évaluation (annexe 2) utilisée dans plusieurs laboratoires permettant de quantifier la sévérité de la maladie et la nécessite si la maladie est très sévère d’mettre à mort l’animal. Depuis plus de 20 ans d’utilisation de ce modèle un nombre presque nul d’animaux a atteint ce stade de sévérité. La procédure de stress (procédure 2) vise à augmenter l’incidence d’arthrite chez ces animaux mais de nombreuses études montrent que ce stress induit est seulement temporaire. Enfin les administrations par voie orale sous-cutanée ou intradermiques présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.

Devenir

A l'issue des procédures 1 à 5, les animaux seront euthanaisés.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de la SpA, une pathologie qui est responsable de douleurs invalidantes et d’un handicap fonctionnel chez des jeunes adultes. De manière importante, Il n’existe aucun traitement curatif. De plus, l’étiologie de la SpA est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs composantes (microbiote intestinal et cellules immunitaires). Les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire cette complexité. Ainsi, l’étude de l’interaction entre ces différentes composantes impliquées nécessite un modèle animal. Dans ce contexte, plusieurs modèles précliniques de SpA ont été développés. Parmi eux, le rat B27 est le modèle le plus pertinent pour étudier cette pathologie associée à l’expression de l’allèle de susceptibilité majeur de la SpA : le HLA-B27. Ce modèle, particulièrement utilisé, est indispensable pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et une application chez l’homme. En outre, de telles expérimentations ont permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques telles que l’IL-17 (maintenant utilisé en clinique) et plus récemment CCR6.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant la robustesse statistique des résultats afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs test préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet significatif. Le nombre d’animaux par groupe varie selon le type d’expérience. Tandis que des effectifs réduits (environ 4 animaux) peuvent suffire pour des analyses moléculaires et tissulaires ; des évaluations fonctionnelles sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (environ 6 à 8 animaux par groupe), pouvant être ajustés si nécessaire. Une expérience de mise au point du système expérimental permet aussi ensuite de réduire le nombre d’animaux utilisés ensuite (procédure 3). Ce projet s’inscrit dans la continuité de nos travaux antérieurs au laboratoire, ainsi que de projets similaires menés dans d’autres établissements. Lorsque cela est possible et compatible avec les exigences règlementaires, les animaux proviennent d’élevages issus de notre projet précédent, limitant ainsi l’acquisition de nouveaux animaux spécifiquement pour cette étude. Des animaux initialement utilises pour la caractérisation de lignées et génotypes pourront ainsi être inclus ultérieurement dans des procédures de stress ou d’administration (procédure 2 à 5). De même, des animaux reproducteurs vieillissants pourront être réaffectés lorsque cela est scientifiquement et éthiquement justifié. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement sont mises en oeuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Lors de la procédure d’élevage utilisant des rates transgéniques B27, l’alimentation sera supplémentée en fromage pour les femelles gestantes leur permettant une alimentation plus riche lors de cette période afin de mieux nourir les petits. Après chaque séance de stress contrôlé, les rats seront retournés dans leur cage respective avec 1 autre rat pour permettre de réduire le stress de la contention. Pour les administrations intraveineuses, les animaux seront anesthésiés avant l’injection afin de diminuer le stress et la douleur liées à la procédure. L’anesthésique utilisé sera l’isoflurane par voie inhalée. Pour le confort des animaux, les rats ne seront pas isolés mais le nombre d’animaux sera de 2 à 3 par cage suivant leur poids et les changes des cages seront plus fréquents (2 fois par semaine) chez les animaux malades. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Le geste sera réalisé par des personnes entraînées à cette technique. Pour limiter le stress après administration de composés du microbiote, les animaux seront maintenus en cage par groupe expérimental respectif, 2 ou 3 animaux par cage. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est importante. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. Nous utiliserons un tableau de scoring hebdomadaire permettant d’évaluer la sévérité des symptômes (annexe 2). L'administration d'un médicament analgésique (Butorphanol par voie sous-cutanée 1 fois par jour pendant 1 semaine) est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA chez les rats qui présentent une inflammation articulaire forte mais qui n'ont pas atteint le point limite (score articulaire supérieure à 8/16). En cas de présence d’arthrites, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant les formes axiales et périphériques de la SpA. Les atouts sont la survenue spontanée de la maladie chez les rats B27 possédant le facteur génétique majeur de prédisposition à la SpA, et la disponibilité de plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les lignées de rats B27 utilisées sont complémentaires et permettent d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats B27 est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote ou du système immunitaire doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage et au stade prémorbide chez le rat B27) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle du stress (procédure 2), des composant du microbiote (procédure 3) et de cellules immunitaires purifiées (procédure 4) et de composés thérapeutiques candidats (procédure 5) lors du développement de la SpA du rat B27. Quelques expériences de caractérisation de nos lignées utiliseront des femelles gestantes (n=10 sur 5 ans). Cette saisine inclue une procédure d’entretien des lignées (procédure 1) nécessitant des rats adultes âgés de 2 à 6 mois. Ces âges correspondent à la période de fertilité de ces animaux en laboratoire.