Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées :
- 235 projets autorisés en avril 2026 (01/05/2026)
- 296 projets autorisés en mai 2026 (01/06/2026)
Thérapie par modulation génique de Bin1 dans la neuropathie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Objectifs
Le but de ce projet est de tester une approche de modulation génique prometteuse pour la maladie rare de Charcot- Marie-Tooth (CMT), une neuropathie périphérique entraînant des troubles moteurs et sensitifs. Cette pathologie provoque une perte progressive de force et de coordination, et aucune thérapie curative n’existe actuellement. Nous utilisons des souris reproduisant fidèlement la maladie humaine pour évaluer si la réduction du gène d’intérêt permet d’améliorer la fonction musculaire et nerveuse. Cette stratégie sera testée soit par croisement génétique, soit par thérapie génique utilisant des vecteurs viraux (AAV). Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie et la validation d’une approche thérapeutique innovante, transposable ultérieurement à l’Homme. Tous les tests sont conçus pour limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Les critères de bien-être sont surveillés quotidiennement et toute souffrance incompatible avec le maintien dans le protocole entraîne l’arrêt immédiat et l’euthanasie de l’animal.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable
Procédures
Une partie des animaux (130) sera utilisée pour un entrainement aux différentes techniques d’injection (intramusculaire, intrathécale, intraveineux). Les autres animaux (280) seront répartis comme suivant : 200 animaux seront injectés durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno- associés ; 80 animaux seront injectés au 2ème et jour après la naissance et 120 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 8 semaines, les animaux seront soumis à une série de 10 tests comportementaux : test d’aggrippement (durée 3x20s) - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x30s max en tout), -test sensibilité au froid (3 mesures par patte, 30s max par patte) -mesure de réactivité sur plaque froide (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité des souris par des capteurs (durée de 22h) ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le phénotype général des souris a été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Dans cette étude, nous utiliserons des souris mâles et femelles issues des croisements pour maximiser les informations obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux. Chaque souris sera suivie longitudinalement, c’est-à-dire qu’elle sera étudiée à plusieurs moments au cours de sa vie, afin de mesurer l’évolution des symptômes musculaires et nerveux. Grâce à cette approche, nous pourrons obtenir des résultats fiables tout en appliquant le principe de réduction : utiliser le moins d’animaux possible pour répondre aux questions scientifiques.
Raffinement
Les nouveau-nés seront avec leurs parents jusqu’au sevrage. Après cette période, les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 5 par cage, dans un environnement ventilé. La température sera maintenue constante et un cycle lumineux de 12 heures jour/nuit sera respecté. Chaque cage sera équipée de nids et les animaux auront un accès illimité à l’eau et la nourriture. Un tube par cage sera également disposé. Les souris CMT présentent des difficultés au temps de suspension, de la nourriture en gel ainsi que des pellets seront donc directement placés dans la cage afin de soulager l’animal dans son accès à la nourriture. À partir du moment où les animaux seront au phénotypage (semaine 7 et 8), ils seront contrôlés du lundi au vendredi lors des tests afin de pouvoir détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance ou de stress comme un pelage ébouriffé ou terne, un dos voûté, de l’apathie, des comportements répétitifs (léchage excessif, tourner en rond), une maigreur visible (pesée lundi semaine 7 et semaine 8), ou encore une agressivité envers les congénères. Si un de ces signes se présente de manière sévère ou persistante, l’animal sera euthanasié et retiré de l’étude afin de lui éviter toute souffrance, cette décision est justifiée par le fait que l’administration d’analgésiques pourrait altérer les paramètres comportementaux ou sensoriels étudiés (baisse de la sensibilité), compromettant ainsi la validité scientifique des données. Cependant, un antalgique sera administré en sous-cutanée au niveau de la nuque avant l'injection d'AAV afin de ne pas induire de douleur. La zone d’injection sera régulièrement inspectée pour détecter tout gonflement ou changement de couleur pouvant indiquer une infection.
Choix des espèces
La souris est utilisée comme modèle pour étudier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), car son système musculaire et nerveux est suffisamment proche de celui de l’humain pour reproduire les principaux aspects de la pathologie. Les autres espèces présentent des différences trop importantes, et les modèles cellulaires ne permettent pas d’observer les effets à l’échelle de l’organisme, notamment sur la fonction musculaire et la conduction nerveuse. Les animaux sont étudiés à l’âge de 7 à 8 semaines, correspondant à un stade où le phénotype de la maladie est pleinement exprimé. Cela permet d’évaluer de manière pertinente les effets de la pathologie ainsi que l’efficacité de la thérapie.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Caractérisation des effets de la diminution de DNM2 ou de l’augmentation de BIN1 sur la fonction musculaire dans un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien et qui affectent considérablement leur qualité de vie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pour ces maladies graves.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal (activité locomotrice, force, posture) seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines), puis une fois par mois de deux mois jusqu’à un an. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 48h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux (40/280) sont porteurs de la mutation qui entraine une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 8 semaines). Pour ces animaux, les mâles et les femelles sont affectés. Tous les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie auriculaire prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Tous les animaux seront isolés temporairement. Tous les animaux seront mis sous anesthésie générale profonde en fin de procédure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets de la modulation du niveau de protéines sur la fonction du muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets de ce type de modulation. L’évaluation in vivo des effets de potentiels traitements est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la production des animaux expérimentaux, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit la pathologie humaine. Une partie des animaux générés développe un phénotype dommageable (symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance). La durée de vie maximale de ces animaux étant de 8 semaines avec une majorité des animaux mourant avant l’âge de 8 semaines, ces animaux seront utilisés entre 5 et 7 semaines. Si la modulation génique améliore le phénotype, les autres animaux générés ne développeront pas de phénotype dommageable. Les tests de la fonction musculaire seront réalisés une fois par semaine sur les animaux âgés de 3 semaines (i.e. à partir du sevrage) sur une période de 5 semaines puis une fois par mois à partir de 2 mois jusqu’à un an, chez les animaux sans phénotype dommageable.
Thérapie pour les myopathies de type BIN1 & Dynamin 2 par ajout de tamoxifène dans l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 semaines ou 15 semaines. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile ou sous anesthésie légère pendant un maximum d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal sous anesthésie générale sur une durée maximale de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une perte de masse corporelle. Les animaux seront mis sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques qui pourra provoquer une douleur ou une inflammation au point d’injection. Lors du prélèvement de sang, l’animal pourra ressentir un stress lors de la manipulation et un inconfort au niveau du point de piqure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par groupe (i.e. 10 animaux par groupe), basé sur de précédentes études, a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique mettant en évidence une différence phénotypique entre les animaux malades non traités et les animaux contrôles. Les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Enfin, les groupes d’animaux ne recevant pas d’agent pharmacologique serviront de groupe contrôle pour les différentes doses d’agent pharmacologique testées. Ces points sont importants car ils sont à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide système permettant la circulation d'eau chaude et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées.
Choix des espèces
Le modèle murin est privilégié car il s’agit de l’espèce la plus proche de l’Homme physiologiquement et structurellement pour laquelle les manipulations génétiques permettent de reproduire les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le traitement des souris mères débutera 14 jours après la naissance des animaux ce qui permet aux animaux nés de recevoir le traitement via le lait maternel dès les premiers jours de vie, et ainsi de traiter au plus tôt la maladie qui est présente dès la naissance. Les mâles et les femelles seront utilisées car la maladie se développent indépendamment du sexe. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 ou 15 semaines, i.e. à partir du sevrage et pendant toute la durée du traitement.
Modulation du niveau de BIN1 par croisement génétique dans le traitement des myopathies centronucléaires liées au gène SPEG
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris Xdéficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X
Procédures
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux Xdéficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris Xdéfcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène BIN1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en apportant le gène manquant responsable de cette maladie à l'aide d'un vecteur viral. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différents domaines de la protéine manquante responsable de la maladie musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée.
Procédures
Les 140 souris de la cohorte « Injection intraveineuse » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections systémiques rétro-orbitales sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. -Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 10min par animal - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 13 semaines d’âge
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement. En revanche lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable le temps de l’analyse. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intra-musculaire peuvent causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la procédure expérimentale.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de l’injection par voie rétro-orbitale, du gel ophtalmique sera appliqué au niveau de l’œil de l’animal afin de s’affranchir de la sécheresse oculaire au réveil. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. L’effet du traitement avant l’apparition des symptômes a déjà prouvé son efficacité lors d’une étude précédente au laboratoire, nous traiterons donc ces animaux au stade adulte (8 semaines) pour étudier l’effet du traitement après l’apparition des symptômes.
Rôle de la protéine BIN1 et du transport vésiculaire pour le maintien des tubules T dans l’infarctus myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'éclaircir les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation de tubules T des cardiomyocytes dans l’infarctus myocardique. En particulier, nous cherchons à déterminer si BIN1 et le transport vésiculaire ont un effet protecteur sur le maintien des tubules T et la contractilité cardiaque. Nous utiliserons un modèle d'ischémie-reperfusion myocardique chez la souris nous permettant d'étudier l’organisation des tubules T, les taux de BIN1 et de ses partenaires, ainsi que l'effet de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs (dexaméthasone, DEX, et rapamycine, RAP) sur la taille de l'infarctus.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde (IM) aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Lors d’un IM, l’occlusion d’une artère coronaire irrigant le cœur prive les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) d’oxygène, entrainant une dégradation de ces cellules et une diminution de leur contractilité. En particulier, les invaginations transversales membranaires ou tubules T des cardiomyocytes, essentielles à la contraction au niveau cellulaire, sont altérées. Cependant, ces mécanismes sont pour le moment encore mal compris. En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du réseau de tubules T cardiaques, notre projet permettra de mieux comprendre comment les tubules T sont générés et dégradés, et de déterminer les acteurs clés de ces processus. Il sera ainsi possible de contrecarrer la dégradation des tubules T et de restaurer la contractilité cardiaque en régulant la concentration des acteurs clés. Pendant la durée de ce projet, nous espérons pouvoir identifier les conditions permettant la maintenance des tubules T des cardiomyocytes dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion, ainsi qu’une amélioration de la contractilité cardiaque. L’étude de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs nous mettrons également sur la voie de futur traitements possibles chez les patients pour maintenir la contractilité cardiaque dans les zones les plus affectées après un IM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'ischémie/reperfusion myocardique (ligature coronaire). La durée totale de l'intervention chirurgicale est de 60 min, dont 15 min entre l'intubation oro-trachéale et l'accès au coeur, 30 min de ligature coronaire, et 15 min pour la fermeture du thorax. Un prélèvement sanguin terminal de 150 µl sera également effectué au moment du sacrifice des animaux (procédure 1).
Impact sur les animaux
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie et la chirurgie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Avant utilisation, une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur, dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids en groupe social au sein de l’animalerie en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu par des jouets (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Avant procédure, une surveillance quotidienne des animaux (observation de l’état général) sera réalisée par le personnel de l’animalerie soignant les animaux, et leur poids sera suivi de façon hebdomadaire par le personnel réalisant les procédures chirurgicales. Après la chirurgie, les animaux seront gardés sous surveillance dans une cage sur tapis chauffant avec enrichissement, eau et nourriture gélifiée en plus de l’alimentation habituelle. Cette surveillance, où l’animal est isolé, dure approximativement 24h, puis les animaux retrouvent leur hébergement en groupe social avec enrichissement, en conservant autant que possible les groupes formés afin de maintenir la stabilité hiérarchique établie. Pendant tout le protocole expérimental, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel ayant réalisé la procédure chirurgicale grâce à la grille de score des points limites (fiche d’observation, voir annexe) qui est mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. En cas de souffrance de l’animal selon le score obtenu à l’aide de la grille d’évaluation, une nouvelle injection d’antalgique (buprénorphine 0.1mg/Kg) sera réalisée. Au cours de la procédure, la décision de garder les souris en vie sera prise par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde (kétamine/xylazine) pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette etude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible de l'ischémie-reperfusion myocardique
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 animaux + 25% de mortalité liée à l'infarctus, soir 15 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux les effets de l'ischémie reperfusion myocardique sur , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux a inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience.
Raffinement
Nous raffineros cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage d’animalier minimum 2 fois/jour). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique (cocktail kétamine 100mg/Kg /Xylazine 10mg/Kg i.p.) avant la chirurgie et d’analgésique (Buprénorphine 0.05mg/Kg) aux doses appropriées avant la chirurgie, une deuxième injection de Buprénorphine (0.05mg/Kg) est réalisée 6h après le réveil puis une troisième injection 14h après la seconde injection.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. 3 mois (jeunes adultes) pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie liée au vieillissement.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des AAV) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chaude à 52°C et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes. Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux Mtmr KO âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure.
Devenir
Nous feront une première étude préliminaire où les animaux seront euthanasiés à 6 mois pour étude histologique du nerf sciatique et vérification des phénotypes décrits dans la littérature scientifique. Nous nous formerons à l'injection intracérébroventriculaire et les animaux utilisés seront mis à mort le premier jour (P1) après formation. Nous nous formerons à l'injection intrathécale et les animaux seront euthanasiés 15 minutes après formation. Pour l'évaluation de phénotype dommageable et étude histologique à six mois après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort entre 8 et 11 semaines, 2 mois après injection d'AAV pour étude histologique du nerf sciatique (signal GFP). Pour la caractérisation comportementale des animaux après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort à 1 an après caractérisation comportementale pour étude histologique du nerf sciatique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.05 à 0.2 mg/kg selon l'intensité de la douleur) et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas de la buprénorphine sera administrée quotidiennement par i.p. à dose de 0.05 mg/kg. Niveau 2 : douleur modérée, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.1 mg/kg sera administrée quotidiennement par i.p.. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.2 mg/kg sera administrée toutes les 12 heures. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Modulation du niveau de BIN1 par croisement génétique dans le traitement des myopathies centronucléaires liées au gène SPEG
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.
Procédures
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Bin1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.
Rôle de la protéine BIN1 et du transport vésiculaire pour le maintien des tubules T dans l’infarctus myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'éclaircir les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la formation de tubules T des cardiomyocytes dans l’infarctus myocardique. En particulier, nous cherchons à déterminer si BIN1 et le transport vésiculaire ont un effet protecteur sur le maintien des tubules T et la contractilité cardiaque. Nous utiliserons un modèle d'ischémie-reperfusion myocardique chez la souris nous permettant d'étudier l’organisation des tubules T, les taux de BIN1 et de ses partenaires, ainsi que l'effet de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs (dexaméthasone, DEX, et rapamycine, RAP) sur la taille de l'infarctus.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde (IM) aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Lors d’un IM, l’occlusion d’une artère coronaire irrigant le cœur prive les cellules musculaires cardiaques (cardiomyocytes) d’oxygène, entrainant une dégradation de ces cellules et une diminution de leur contractilité. En particulier, les invaginations transversales membranaires ou tubules T des cardiomyocytes, essentielles à la contraction au niveau cellulaire, sont altérées. Cependant, ces mécanismes sont pour le moment encore mal compris. En étudiant les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du réseau de tubules T cardiaques, notre projet permettra de mieux comprendre comment les tubules T sont générés et dégradés, et de déterminer les acteurs clés de ces processus. Il sera ainsi possible de contrecarrer la dégradation des tubules T et de restaurer la contractilité cardiaque en régulant la concentration des acteurs clés. Pendant la durée de ce projet, nous espérons pouvoir identifier les conditions permettant la maintenance des tubules T des cardiomyocytes dans un modèle murin d’ischémie-reperfusion, ainsi qu’une amélioration de la contractilité cardiaque. L’étude de l’administration exogène de BIN1 et d’immunosuppresseurs nous mettrons également sur la voie de futur traitements possibles chez les patients pour maintenir la contractilité cardiaque dans les zones les plus affectées après un IM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'ischémie/reperfusion myocardique (ligature coronaire). La durée totale de l'intervention chirurgicale est de 60 min, dont 15 min entre l'intubation oro-trachéale et l'accès au coeur, 30 min de ligature coronaire, et 15 min pour la fermeture du thorax. Un prélèvement sanguin terminal de 150 µl sera également effectué au moment du sacrifice des animaux (procédure 1).
Impact sur les animaux
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Les nuisances ou effets indésirables suite à l'anesthésie et la chirurgie sont l'hypotension, le refroidissement et la perte de poids. Avant utilisation, une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la règlementation en vigueur, dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids en groupe social au sein de l’animalerie en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu par des jouets (cabanes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Avant procédure, une surveillance quotidienne des animaux (observation de l’état général) sera réalisée par le personnel de l’animalerie soignant les animaux, et leur poids sera suivi de façon hebdomadaire par le personnel réalisant les procédures chirurgicales. Après la chirurgie, les animaux seront gardés sous surveillance dans une cage sur tapis chauffant avec enrichissement, eau et nourriture gélifiée en plus de l’alimentation habituelle. Cette surveillance, où l’animal est isolé, dure approximativement 24h, puis les animaux retrouvent leur hébergement en groupe social avec enrichissement, en conservant autant que possible les groupes formés afin de maintenir la stabilité hiérarchique établie. Pendant tout le protocole expérimental, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel ayant réalisé la procédure chirurgicale grâce à la grille de score des points limites (fiche d’observation, voir annexe) qui est mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. En cas de souffrance de l’animal selon le score obtenu à l’aide de la grille d’évaluation, une nouvelle injection d’antalgique (buprénorphine 0.1mg/Kg) sera réalisée. Au cours de la procédure, la décision de garder les souris en vie sera prise par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde (kétamine/xylazine) pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette etude, car il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative ni de modélisation possible de l'ischémie-reperfusion myocardique
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 animaux + 25% de mortalité liée à l'infarctus, soir 15 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux les effets de l'ischémie reperfusion myocardique sur , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux a inclure. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience.
Raffinement
Nous raffineros cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage d’animalier minimum 2 fois/jour). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique (cocktail kétamine 100mg/Kg /Xylazine 10mg/Kg i.p.) avant la chirurgie et d’analgésique (Buprénorphine 0.05mg/Kg) aux doses appropriées avant la chirurgie, une deuxième injection de Buprénorphine (0.05mg/Kg) est réalisée 6h après le réveil puis une troisième injection 14h après la seconde injection.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. 3 mois (jeunes adultes) pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie liée au vieillissement.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Bin1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.