Les projets approuvés

Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Chacune des 96 femelles macaques à longue queue utilisées est anesthésiée une quarantaine de fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, par macaque, une infection vaginale par Chlamydia trachomatis, une à six injections de vaccin ou de placebo, l'implantation d'une puce de télémétrie, une quarantaine de prélèvements de sang, une trentaine d'écouvillonnages vaginaux, quinze biopsies vaginales et sept biopsies ganglionnaires. Le porteur attend des diarrhées, un amaigrissement, une cervicite avec écoulement purulent, une anémie transitoire et des infections cutanées aux sites de prélèvement, et prévoit des phases d'hébergement individuel dont il reconnaît qu'elles peuvent provoquer stress et ennui. Cinquante-deux macaques seront tuées pour analyse des organes cibles de l'infection, les quarante-quatre autres gardées en vie et réutilisées après vérification de leur état sanitaire par le vétérinaire.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre une infection sexuellement transmissible fréquente causée par la bactérie Chlamydia trachomatis, et à tester de nouvelles stratégies de vaccination pour essayer de la prévenir. Cette infection est très répandue dans le monde. Elle passe souvent inaperçue, en particulier chez les femmes, car elle ne provoque pas toujours de symptômes. Pourtant, elle peut avoir des conséquences graves, notamment sur la fertilité, en augmentant le risque de douleurs chroniques, de grossesse extra-utérine ou d’infertilité. Les traitements antibiotiques permettent de soigner l’infection, mais ils ne suffisent pas toujours à empêcher la propagation de l’infection dans la population ni à éviter certaines complications. Le développement d’un vaccin pourrait donc représenter un progrès important pour la santé publique. Le projet a pour objectif de mieux comprendre la manière dont cette infection se développe dans l’organisme et d’évaluer de nouveaux vaccins potentiels. Les nouveaux modèles d’infection développés dans ce projet permettront d’étudier une situation plus proche de celle observée chez l’être humain. Les candidats vaccins ayant montré des résultats satisfaisants chez le primate non humain pourront ensuite faire l’objet d’évaluations complémentaires en vue d’un possible développement clinique chez l’être humain. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches de prévention pour réduire les conséquences de cette infection dans la population.

Bénéfices attendus

Le modèle d’infection développé dans ce projet aidera à mieux comprendre comment la bactérie Chlamydia trachomatis infecte l’organisme et s’y développe. Il permettra de disposer d’un outil proche de ce qui se passe chez l’être humain pour tester de futurs vaccins. Les candidats vaccins les plus prometteurs, après des résultats encourageants chez l’animal évalué au cours de ce projet, pourraient ensuite être utilisés chez l’être humain. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer à développer de nouvelles méthodes de prévention contre cette infection, avec pour objectif de réduire ses effets sur la santé publique

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (40 fois environ , entre 5 et 30 minutes sur tous les animaux) Les différentes interventions dans ce projet sont : - Injection des vaccins ou placebo (1 à 6 fois, tous les groupes vaccinés et contrôles, 5 min) - Infection vaginale avec la bactérie Chlamydia trachomatis (1 fois, tous les animaux, 15 min) - Prélèvement de sang (40 fois environ, tous les animaux, 5min) - Ecouvillonnage vaginal (30 fois environ, tous les animaux, 5 min) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, tous les animaux, 20 min) - Biopsies ganglionnaires (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Biopsies vaginales (15 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux vaccinations et aux biopsies (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’administration ou les prélèvements. Nuisances liées à l’infection : diarrhée, amaigrissement, cervicite avec écoulement purulent (peu attendus). Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

En fonction des résultats obtenus, certains animaux pourront être euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses plus approfondies des organes cibles de l’infection. Les autres animaux seront gardés en vie à la fin de l’étude et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié par le vétérinaire compétent.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour mimer la pathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par Chlamydia trachomatis. En effet, ce modèle animal permet de reproduire la réponse immunitaire induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Le primate non humain étant proche physiologiquement de l’être humain, son utilisation permet une meilleure extrapolation des résultats chez celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats. Il a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre une interprétation robuste des effets des conditions expérimentales, tout en prenant en compte la variabilité entre individus.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours, par une équipe dédiée. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure chargée du bien-être animal. En cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’ensemble des interventions et les prélèvements seront regroupés au maximum et réalisés sous anesthésie générale des animaux. Les prélèvements sanguins, l’implantation de puces de télémétrie ou l’administration de vaccins peuvent entraîner des réactions locales (douleur, gonflement ou irritation). Si nécessaire, des soins appropriés, tels qu’une désinfection et un traitement contre la douleur, seront mis en place sur avis vétérinaire. Des phases d’hébergements en individuel seront nécessaires au cours du projet. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition bactérienne.

Choix des espèces

Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques et biologiques en termes de réponse immunitaire et vaccinale suffisamment proches de l’être humain pour permettre une étude pertinente de l’infection par Chlamydia trachomatis et de l’immunité. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, modèle d’infection pour la bactérie d’intérêt déjà utilisé dans des études scientifiques précédentes et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à l’infection vaginale par Chlamydia trachomatis nécessite d’avoir accès à des femelles adultes et matures.

Pour tester un bolus de levures vivantes destiné aux élevages allaitants, 34 jeunes veaux mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué à l'issue. Ils subissent des prélèvements de jus de rumen par sonde gastro-œsophagienne, deux endoscopies avec biopsie de la paroi du rumen, des fouilles rectales, une tonte du flanc et des prises de sang à la veine caudale, réparties sur huit sessions autour du sevrage. Le porteur situe la retombée dans des "recommandations pratiques aux éleveurs" et des valorisations scientifiques et techniques, si le bolus prépare mieux le jeune au stress du sevrage. Ce résumé est le second de deux volets portant le même intitulé et déclarant chacun 34 veaux pour le même protocole, sans que le lien entre les deux soit explicité.

Objectifs

L'objectif du présent projet est d'étudier l'intérêt d'une supplémentation en levures vivantes probiotiques autour du sevrage pour favoriser le développement du microbiote commensal et fonctionnel dans le tube digestif et ainsi de stimuler le développement des papilles ruminales et leur fonctionnalité. Au-delà des effets au niveau de la sphère digestive, un impact bénéfique sera recherché sur la limitation du stress au sevrage et sur la croissance et l'efficacité alimentaire en post-sevrage. Ce projet est multisite et se déroulera sur 2 sites différents distants de 32 km. Le changement de site se fera le jour du sevrage.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces investigations permettra d’approfondir notre connaissance, encore très limitée, sur l’impact des stress de sevrage (séparation maternelle, changement d’alimentation) et de changement de lieux d’hébergement chez des veaux sous la mère. Le suivi longitudinal des animaux permettra de caractériser les effets du sevrage sur la stabilité du microbiote digestif (ruminal et fécal), l’impact de celui-ci sur le développement du rumen et sur sa fonctionnalité, et de mesurer les conséquences potentielles sur le comportement, la santé et la performance des jeunes taurillons. L’étude permettra d’apporter également des informations uniques sur le développement des papilles ruminales grâce à l’utilisation de l’endoscope. Si la stratégie de supplémentation en levures vivantes probiotiques via un bolus nutritionnel permettait de mieux « préparer » le jeune au stress du sevrage grâce à un écosystème ruminal plus stable et performant et une meilleure maturation du rumen, l’étude pourrait conduire à des valorisations scientifiques et techniques ainsi qu’à des recommandations pratiques aux éleveurs.

Procédures

Dans ce projet, les veaux seront soumis à six types de prélèvements : prélèvement gastro-oesophagien, prélèvement de fèces, prise de sang, endoscopie avec prélèvements de papilles ruminales, écouvillonnage buccal et tonte de poils. Lorsque cela est possible, ces prélèvements seront réalisés le même jour afin de limiter le nombre de contentions et de réduire le stress associé aux manipulations répétées. Par ailleurs, un intervalle minimal de 10 jours sera respecté entre deux sessions de prélèvements, afin de permettre un rétablissement complet de l’animal. À l’exception de l’endoscopie, qui sera réalisée deux fois par animal. Les autres prélèvements seront effectués 3 fois au cours de la période pré-sevrage et cinq fois au cours de la période de post-sevrage du veau. La durée cumulée des interventions lors d’une même session n’excédera pas 10 minutes. En cas de dépassement ou de signes de mauvaise tolérance, les interventions seront immédiatement interrompues. Enfin, les volumes et quantités d’échantillons prélevés ont été définis en amont de manière à ne pas compromettre la santé, le bien-être ou la survie des animaux, conformément aux recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

L’étude prévoit plusieurs prélèvements à différents niveaux de sévérité notamment des prélèvements de jus de rumen (PGO) et des biopsies en classe modérée. Différents prélèvements relevant de procédures légères (fèces et sang) afin de caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des jeunes bovins (JB) à l’engraissement. La prise de sang sera effectuée à la veine caudale et les prélèvements de fèces par défécation naturelle ou fouille rectale si besoin et le prélèvement de poils par tonte au niveau du flanc de l'animal. La prise de sang peut induire une douleur succinte. La prise de sang, la PGO et la fouille (si nécessaire) dureront maximum 3 minutes chacune. Le prélèvement de jus de rumen sera réalisé par prélèvement gastro-oesophagiens (PGO) et pourrait engendrer une irritation de l'oesophage. Les biopsies (J-5 et J+45) seront réalisées par un vétérinaire et pourraient engendrer une irritation de l’oesophage et de la paroi du rumen. Au total, les prélèvements n'excéderont pas 10 minutes. Ces prélèvements seront réalisés en cage de contention et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation.

Devenir

Les 34 veaux seront maintenus en vie à l'issue de l'étude, sous réserve de l'autorisation du vétérinaire. Quatre d'entre eux réintégreront le circuit classique du premier élevage, tandis que les 30 autres poursuivront leur parcours au sein du deuxième élevage, où ils seront suivis durant leur phase d'engraissement.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’obtenir des données scientifiques sur la maturation du rumen du veau allaitant donc sur un processus dynamique qui est propre à chaque individu, et qui comprend l’analyse de différents compartiments digestifs, aucune solution de remplacement in vitro n’est adaptée pour ce projet.

Réduction

Des tests statistiques prenant en compte, la puissance statistique nécessaire de 75%, la variabilité individuelle entre les animaux (races pures et mixtes et âges de naissance étalés sur plusieurs semaines) de 10% et le seuil de significativité fixé à 0.1, ont permis de déterminer à 15 le nombre minimal d'individus par lot pour générer des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les fouilles rectales pour les prélèvements de fèces ne seront réalisées que si les animaux ne défèquent pas naturellement au moment de la collecte. Les animaux seront habitués à chaque acte en mimant les différents prélèvements lors de contention. Cet entrainement sera réalisé 2 fois avant les prélèvements réels. Les prélèvements se feront de façon groupée dans la mesure du possible afin de ne pas multiplier les séquences de manipulation et de contention. L'utilisation de lubrifiant durant la PGO ou de la fouille rectale altère la qualité de l'échantillon. Cependant, lorsque la fouille rectale sera effectuée, les gants utilisés seront humidifiés pour faciliter le prélèvement. L'utilisation d'un lève-tête pour les PGO est systématique afin de limiter les risques de blessures pour l'animal et l'opérateur. Après chaque journée de prélèvements, les animaux seront suivis durant 5 jours pour détecter tout comportement anormal potentiellement induit par les prélèvements. Après le sevrage, lors du changement de site des animaux, ceux-ci auront une phase d'habituation à leur nouvel environnement et auront individuellement une inspection générale de leur état corporel. Le jour du sevrage, les veaux seront transportés dans une bétaillère adaptée, offrant une ventilation suffisante, un sol antidérapant et un espace adapté au nombre d'animaux. De plus, les veaux seront transportés en groupe, avec leurs congénères, afin de limiter le stress lié à l'isolement. Enfin, le transport sera effectué sur une courte distance (moins d'une heure) et nous réaliseront le transport tôt le matin afin de limiter le plus possible les périodes de fortes chaleurs.

Choix des espèces

Parmi les ruminants, l’espèce bovine est une espèce de choix pour étudier la dynamique de mise en place des fonctions ruminales dans les conditions de l’étude. Par ailleurs, un des objectifs de ce projet est d’étudier l’intérêt d’un probiotique distribué sous forme d’un bolus à libération lente permettant une efficacité potentielle prolongée pendant la période d’alimentation à l’herbe jusqu’au post sevrage. Les bovins ont été choisis car ils sont à la fois modèle et sujet de la recherche. Les animaux mobilisés seront des jeunes veaux mâles entre 50 jours avant sevrage et 120 jours après sevrage. La période autour du sevrage étant la cible de notre étude.

Opérés deux à trois fois sous anesthésie générale, jusqu'à quatre heures par intervention, avec ablation du pancréas puis greffe d'îlots producteurs d'insuline, 180 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter reste posé pendant tout le protocole, qui dure de un à trois mois. Le porteur attend en post-opératoire des douleurs, une perte de poids, une baisse d'appétit, une mobilité réduite, de la confusion et des stéréotypies, ces comportements répétitifs qui signalent la détresse. Tous les animaux sont tués à l'issue, les biopsies terminales étant, écrit-il, incompatibles avec leur survie.

Objectifs

Le diabète de type 1 touche environ 8,4 millions de personnes dans le monde. Cette maladie apparaît lorsque le système immunitaire détruit les cellules du pancréas qui produisent l’insuline, une hormone indispensable pour réguler le taux de sucre dans le sang. Les personnes atteintes doivent donc s’injecter de l’insuline chaque jour pour survivre. La greffe d’îlots pancréatiques, qui consiste à transplanter les cellules productrices d’insuline provenant d’un donneur, est une approche prometteuse. Chez certains patients, elle permet de mieux contrôler la glycémie et parfois de réduire, voire d’éviter, les injections quotidiennes d’insuline. Cependant, cette technique présente encore des limites importantes. Une grande partie des cellules greffées disparaît rapidement après la transplantation. Cela est en partie lié à l’endroit où elles sont implantées dans le corps. Actuellement, les cellules sont généralement injectées dans le foie. Bien que cette méthode soit la référence actuelle, elle peut entraîner une inflammation locale et ne permet pas toujours un suivi facile du greffon. Il est donc essentiel de trouver de nouveaux sites d’implantation qui permettraient aux cellules greffées de mieux survivre et fonctionner. De plus, l’environnement immédiat autour des cellules transplantées joue un rôle crucial dans leur survie. L’utilisation de supports biologiques, appelés matrices ou biomatériaux, pourrait aider à protéger les cellules et à améliorer leur maintien après la greffe. Dans ce contexte, notre projet vise à comparer différents endroits du corps pour implanter ces cellules, ainsi que différents supports biologiques, afin d’identifier les meilleures combinaisons possibles pour améliorer la réussite de la greffe et restaurer durablement la production d’insuline. Ces essais seront comparés au site de greffe standart, utilisé à ce jour, la greffe d'îlots pancréatiques intraportale.

Bénéfices attendus

À court et moyen terme, ce projet donnera lieu à des publications scientifiques internationales, permettant de partager les résultats avec la communauté médicale et de faire avancer la recherche. À moyen et long terme, l’objectif est d’améliorer la greffe de cellules productrices d’insuline en identifiant les meilleurs endroits pour les implanter et les meilleurs supports pour les protéger. Cela pourrait permettre aux cellules greffées de survivre plus longtemps et de fonctionner plus efficacement. En trouvant des solutions alternatives au site actuellement utilisé dans le foie, il serait possible de réduire certains risques, comme la formation de caillots sanguins. À plus long terme, ces avancées pourraient aussi limiter, voire éviter, l’utilisation de traitements anti-rejet lourds. L’objectif final est d’améliorer la qualité de vie et la sécurité des patients atteints de diabète de type 1.

Procédures

Les animaux seront opérés 2 à 3 fois selon leur groupe; sous anesthésie générale (environ 1 à 4h selon la procédure). Ils auront un test de tolérance au glucose par voie intraveineuse (IVGTT) et un repas test pré opératoire. Le cathéter sera préalablement posé et laissé pour toute la durée du protocole. Les animaux recevront également une laparotomie afin de réaliser une pancréatectomie puis une greffe. Toutes les procédures seront réalisées pour influger le moins de douleur possible à l'animal (analgésie et anesthésie générale). L'euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale (animal endormi). La durée du protocole est de 1 à 3 mois selon les groupes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure (1 à 3 mois). En effet, la réalisation de biopsies terminales n'est pas compatible avec la survie de l'animal.

Remplacement

Le recours au modèle animal est nécessaire pour évaluer la survie et la fonctionnalité d’îlots pancréatiques transplantés dans différents sites du corps, ainsi que l’effet de matrices biologiques ou de dispositifs d’encapsulation. Ces phénomènes impliquent des interactions complexes entre inflammation, vascularisation et régulation du taux de sucre dans le sang, qui ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires ou des méthodes alternatives. Les tests métaboliques dynamiques (comme le test de tolérance au glucose) nécessitent un organisme vivant. Le miniporc a été choisi en raison de sa proximité physiologique avec l’être humain. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de répondre aux objectifs du projet sans utiliser d’animaux.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimum d’animaux pour notre étude pré-clinique (avant une potentielle étude chez l’Homme). Il est difficile d’établir un nombre précis d’individus nécessaires mais des calculs statistiques de nombre d’individus nécessaires par des logiciels prévus à cet effet nous ont permis d’estimer au plus près le nombre d’animaux nécessaires sans devoir prévoir une « marge » trop importante. Cette marge a été réduite au minimum par les calculs de puissance statistique. Grâce à ces estimations, nous pourrons réduire encore le nombre d’animaux utilisés en cours de protocole si l’effet attendu est atteint avec un plus petit nombre d’animaux.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter la douleur et le stress des animaux. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale avec surveillance continue, et un traitement antidouleur est administré avant et après les opérations. La pose d’un cathéter veineux central permet d’éviter des ponctions répétées lors des tests métaboliques et réduit ainsi les manipulations. Lorsque cela est possible, les greffes au niveau de l’estomac et du côlon sont réalisées par endoscopie afin de limiter l’invasivité. Lors du bloc terminal, la dernière intervention, le test métabolique final et l’euthanasie sont effectués sous anesthésie continue afin d’éviter tout réveil et toute douleur inutile. Des critères d’arrêt anticipé sont également prévus en cas de complication ou d’altération de l’état général. Ces mesures visent à garantir le bien-être des animaux tout en assurant la qualité scientifique de l’étude.

Choix des espèces

Le porc a un régime alimentaire omnivore et une anatomie et un métabolisme digestif semblables à l'Homme. Contrairement aux porcs juvéniles, dont le métabolisme et la croissance rapide peuvent biaiser les résultats, l’utilisation de miniporcs adultes permet d’obtenir des données plus transposables à l’Homme. Nous utiliserons des miniporcs adultes de 50kg à 70 kg.

Des femelles gestantes reçoivent une injection, leurs nouveau-nés sont gavés deux fois puis biopsiés de la queue entre le cinquième et le onzième jour pour repérer une mutation, et à quatre semaines trois gavages supplémentaires suivent. À l'âge adulte viennent cinq prélèvements de sang, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. 520 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur signale des ulcérations au point d'injection, une perte de mobilité des membres postérieurs, des raideurs de la patte et un essoufflement pour certains lots. Toutes sont tuées à la fin du projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas fidèlement le fonctionnement des ganglions lymphatiques.

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré (MODIFICATION DEBUT : notamment la différenciation des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION). Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. MODIFICATION DEBUT : 3 gavages sur souris vigile de 4 semaines (durée moins d’une minute), soit un gavage par jour tous les 2 jours. FIN MODIFICATION. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. MODIFICATION DEBUT : Une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée sera utilisée pour étudier le rôle des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.