Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Caractérisation du processus de calcification cardiovasculaire chez le poisson-zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués pour prélèvement d'organes, 169 120 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu peut passer sept séances d'imagerie avec coloration in vivo des tissus calcifiés, comptant 45 minutes de coloration et de lavage, et jusqu'à quatre échocardiographies. Certains sont soumis deux fois par jour à un régime riche en graisses pendant 90 jours ou plus, d'autres à un choc thermique local ou à des injections répétées, et les poissons génotypés sont isolés deux à sept jours en attendant le résultat de la biopsie. Le porteur explique cet effectif par la variabilité entre individus et par le caractère progressif de la calcification, et précise que 169 120 correspond au maximum qu'il peut utiliser.
Objectifs
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes molécules thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Procédures
Pour tous les gestes techniques, les animaux seront anesthésiés. Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Les animaux seront analysés par microscopie d'imagerie en direct (10 minutes d'imagerie par point de temps) avec une coloration in vivo pour les tissus calcifiés (45 minutes de coloration et de lavage). Chaque animal sera soumis à cette procédure au maximum 7 fois (à 5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 jours post fertilisation) sur les 30 jours de l’expérience. Une échocardiographie (10 minutes d'imagerie par point de temps) sera réalisée au maximum 4 fois par animal sur une durée maximale de l’expérience de 60 jours. Certains poissons recevront 2 fois par jours une alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux sur une durée pouvant aller de 90 jours, voire plus. En ce qui concerne les traitements médicamenteux, si l'administration se fait dans un bain, l’incubation varie de 3 à 6h ; si l’administration du médicament se fait par injection, le temps d'anesthésie est inférieur à 2 minutes et l'injection est très rapide (quelques secondes). Les poissons seront traités pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. Les médicaments seront administrés en doses uniques ou répétées en fonction de leur durée de vie et des périodes d'absorption. Une autre intervention consistera en un choc thermique local d’une durée inférieure à une minute suivi de 10 minutes d'imagerie par point de temps. L’expérience pourra durer jusqu’à 90 jours, ou plus. Concernant le génotypage des poissons, les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) pour une biopsie (quelques secondes). Les poissons seront isolés jusqu’au résultat de la biopsie (2 à 7 jours).
Impact sur les animaux
Les animaux adultes seront soumis, lors de l'administration des médicaments ou des composés destinés au traçage et au marquage des cellules, à une injection d’une durée inférieure à 30 secondes, douleur légère. L'effet du médicament ou du traitement peut entraîner des phénotypes spécifiques d’une durée de 1 à 14 jours dont les douleurs seront de classe légère à modérée. Les études échographiques pourront engendrer une douleur légère de courte durée (5 minutes maximum). Pour les besoins expérimentaux, les animaux pourront être hébergés de manière isolée pouvant durer jusqu'à 14 jours (sévérité légère à modérée selon la durée). Les phénotypes dommageables potentiellement observés sur les lignées mutantes incluent des modifications de la morphologie (déformations squelettiques, variations de taille ou de l’opercule), des atteintes oculaires ou des nageoires, ainsi que des changements d’aspect ou de vitalité liés au vieillissement. Les niveaux de sévérité peuvent varier de léger à modéré sur une durée de 6 mois maximum. Une surveillance accrue sera effectuée afin de prévenir et limiter la souffrance des animaux. Tout individu présentant des effets indésirables entraînant une souffrance significative sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse.
Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro pour comprendre la calcification cardiovasculaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques complexes de ces maladies, puisqu'elles résultent de l'action de multiples facteurs et types de cellules. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
Réduction
La diversité entre les individus, particulièrement prononcée chez les jeunes poissons zèbres (à leurs stades larvaires), explique pourquoi il est nécessaire d'utiliser un plus grand nombre d'animaux afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour valider nos résultats. De même, la calcification cardiovasculaire, qui évolue progressivement et de manière très variable, requiert également un nombre accru d'animaux pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que chaque fond génétique peut présenter une variabilité différente, nous prévoyons de réaliser nos expériences en plusieurs étapes, augmentant progressivement notre effectif, afin d'éviter d'utiliser un surplus d'animaux si la puissance statistique est atteinte avec un effectif moindre. Par conséquent, le nombre d'animaux requis correspond au maximum que nous pouvons utiliser. Étant donné la nature dynamique et hétérogène de la calcification cardiovasculaire, nous suggérons d'exploiter et de créer un grand nombre de lignées génétiques. Ceci permettra d'explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à l'établissement et à l'aggravation du phénotype de calcification. En utilisant des techniques d'imagerie en direct, nous serons en mesure de suivre la progression individuelle de la calcification chez les mêmes animaux, réduisant ainsi le recours habituel à un grand nombre d'animaux pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem ainsi que les coupes histologiques de tissus.
Raffinement
Tout au long de notre projet, les animaux seront maintenus dans des conditions optimisées pour assurer leur bien-être. Les paramètres de l’eau (température, conductivité et pH) ainsi que le cycle lumineux seront contrôlés. Un enrichissement sera assuré par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Des points limites sont fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. De plus, nous utiliserons des procédures non invasives (imagerie, échocardiographie) afin de caractériser le processus de calcification cardiovasculaire.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle idéal pour la recherche en raison de ses caractéristiques uniques. Sa transparence durant les premières semaines après la fécondation permet des techniques d'imagerie exceptionnelles, impossibles avec d'autres modèles. Sa petite taille et sa grande progéniture facilitent son hébergement et sa manipulation, favorisant les études à haut débit. De plus, ses techniques avancées de transgenèse et de mutation offrent diverses méthodes pour étudier spécifiquement les gènes et les voies de signalisation. La similitude marquée entre le poisson zèbre et les mammifères renforce sa valeur en tant qu'organisme modèle. Sa remarquable capacité de régénération tissulaire tout au long de sa vie le rend particulièrement intéressant d'un point de vue d’application clinique. Pour notre projet, le poisson zèbre offre la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement et de cibler des cellules spécifiques grâce à des techniques d'ablation génétique. Cela en fait l'organisme idéal pour notre étude sur l'établissement de la calcification cardiovasculaire, aussi bien au cours du développement que chez les adultes. Nous examinerons les stades larvaires et juvéniles (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 jours post-fécondation) pour comprendre les étapes clés du développement cardiovasculaire, ainsi que les stades adultes (60, 90 et >90 jours post-fécondation) pour observer les tissus sains et malades chez les jeunes et les animaux plus âgés.
Caractérisation du processus de calcification cardiovasculaire chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à "phénotype nocif". Le porteur indique n'attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu'aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l'animal demeure "crucial".
Objectifs
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d'imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l'excès de teinture - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 30 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 60 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux - 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) - Expérience de 90 jours - les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l'ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l'eau ou par injection intrapéritonéale. - Injection intrapéritonéale avec un temps d'anesthésie inférieur à 5 minutes. - Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L'administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d'absorption. 4. Choc thermique local - Moins de 1 minute pour le choc thermique - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 90 jours (maximum) - Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d'aileron pour le génotypage - Moins de 1 minute par clip d'aileron - Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d'animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu'à l'âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu'à 2 ans après la fécondation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d'alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c'est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d'ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse (histologique, moléculaire)
Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
Réduction
La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l'exigence d'un plus grand nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d'animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d'utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d'animaux demandé est le plus grand nombre d'animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d'utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d'imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d'animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : - Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux - Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d'imagerie qui ne sont pas possibles avec d'autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d'autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d'ablation génétique, font du poisson zèbre l'organisme idéal pour l'expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l'établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l'âge adulte pour comparer l'apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu'aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l'on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).
Intérêt du blocage des récepteurs CXCR1 et CXCR2 pour prévenir le développement des calcifications cardiovasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
242 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. La plupart développent une insuffisance rénale chronique provoquée par un régime enrichi en adénine, reçoivent la ladarixine ou un placebo par gavage cinq jours sur sept, subissent des anesthésies gazeuses répétées et des prises de sang, avant une ponction terminale de tout leur volume sanguin dans l'aorte. Le porteur prévient que l'adénine peut causer une insuffisance rénale très sévère, avec perte de poids, prostration et surmortalité, et restreint les rats témoins à 75 % de leur ration pour les besoins de l'imagerie. Il teste la ladarixine contre les calcifications cardiovasculaires et affirme ces phénomènes "non modélisables in vitro".
Objectifs
Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) résulte d’une dégénérescence fibro-calcique de la valve aortique à l’origine de désordres hémodynamiques responsables de complications cardiovasculaires majeures. A ce jour, il n’existe aucun traitement capable de réduire la progression du RAC. Le remplacement de la valve altérée reste aujourd’hui la seule option thérapeutique efficace. Chez les patients souffrant d'insuffisance rénale chronique (IRC), ce remodelage pathologique de la valve est plus fréquent, plus précoce, et progresse plus rapidement, entraînant une mortalité trois fois plus importante qu’en population générale. Dans cette population, le remplacement valvulaire est associé à une mortalité plus importante. Une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant au développement du RAC chez ces patients apparaît donc cruciale afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques sur lesquelles agir afin de ralentir son évolution. Il a été démontré que l’interleukine 8 (IL-8), dont les concentrations sanguines sont élevées chez les patients IRC, favorise in vitro la calcification des cellules de la valve aortique et de l’aorte. Ces travaux suggèrent que l’IL-8 pourrait jouer un rôle clé dans l’évolution rapide de la pathologie dans un contexte d’IRC. Le travail que nous proposons ici vise à vérifier dans un modèle animal d’IRC si l’antagonisme des récepteurs de l'IL-8 (appelés CXCR1 et CXCR2) permet de prévenir le développement du RAC. Notre objectif est de créer une méthodologie d’étude se rapprochant le plus possible de la réalité clinique, afin d’augmenter le potentiel translationnel de nos travaux, en répondant aux critères suivants : 1/ Établir un modèle d’insuffisance rénale progressive associée au développement de calcifications cardiovasculaires chez le rat, 2/ Utiliser un antagoniste pharmacologique de CXCR1 et 2 actuellement en cours d’évaluation clinique (la ladarixine) et 3/ Évaluer les conséquences de ce traitement sur les fonctions valvulaires et cardiaques des rats au moyen d’outils généralement utilisés en routine clinique (microCT, IRM, échocardiographie).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de vérifier si l'antagoniste des recepteurs de l'IL-8, appelé la ladarixine, peut être utilisé pour prévenir efficacement le développement des calcifications cardiovasculaires ainsi que les dysfonctions valvulaires et cardiaques se développant dans un contexte d’insuffisance rénale chronique chez le rat. L’obtention de résultats concluants in vivo pourrait mener à terme à une évaluation de l’usage en clinique de la ladarixine chez les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique. Pour rappel, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement médicamenteux efficace pour prévenir ou ralentir la progression des calcifications valvulaires/vasculaires. L’identification d’une approche pharmacologique permettant de prévenir la survenue ou de ralentir la progression du rétrécissement aortique calcifié permettra à terme à une meilleure prise en charge des patients et une diminution du coût pour la société.
Procédures
Une cohorte de 12 rats subira une à trois anesthésies gazeuses de 2h réalisées chacune à une semaine d’intervalle en vue de mettre au point les techniques d’imagerie IRM et d’échocardiographie. Une cohorte de 14 rats subira deux anesthésies gazeuses de 45 minutes réalisées à 2 jours d’intervalle afin comparer les données mesurées par IRM et par échocardiographie. Une cohorte de 36 rats sera soumise à un régime enrichi en adénine et en phosphate sur une durée pouvant aller de 5 à 12 semaines dans le but de mettre en place un modèle d'insuffisance rénale chronique associée au développement de calcifications cardiovasculaires. Une cohorte de 180 rats sera utilisée pour vérifier l’impact de la ladarixine sur le développement des calcifications cardiovasculaires secondaires à l’insuffisance rénale chronique. Les 180 animaux de cette cohorte seront maintenus sous régime contrôle (n=84) ou sous un régime adénine provoquant l'IRC (n=96) et recevront la ladarixine (n=90) ou le placebo (n=90), administrée par gavage 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg), durant toute la durée du régime. Au total, 216 animaux subiront deux anesthésies gazeuses de 45 minutes en début, en milieu et en fin de protocole afin d’évaluer l’impact des traitements sur les fonctions cardiaques et vasculaires par imagerie. Ces 216 animaux subiront deux prélèvements de 1 mL de sang, réalisés sous anesthésie générale, au début et au milieu du protocole. Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et leur volume sanguin total sera prélevé. Une chirurgie sera nécessaire au moment de l’euthanasie afin de pouvoir réaliser la ponction sanguine terminale. Cette procédure n’excèdera pas 5 minutes. Les analyses sanguines et tissulaires (aortes, valves, reins, os) permettront de conclure fermement sur les effets de la ladarixine sur le système cardiovasculaire dans ce modèle.
Impact sur les animaux
Les rats des groupes IRC (n=114) développeront progressivement une insuffisance rénale chronique associée à des désordres cardiovasculaires. Ils devraient prendre moins de poids que les rats contrôles (n=102). Il se pourrait que la quantité d’adénine à laquelle seront exposés les animaux des cohortes IRC de l’étude pilote (n=18) provoque des IRC très sévères. Dans ce cas, les rats des groupes IRC pourraient montrer une perte de poids importante, une réduction du comportement exploratoire, des signes de prostration et un risque accru de mortalité en comparaison aux rats des groupes contrôles. L’ajout d’adénine modifie le goût des croquettes et peut provoquer une aversion des animaux envers l’aliment. Les rats des groupes contrôles (n=102) recevront un apport alimentaire correspondant à 75% de leur apport journalier sur toute la durée du protocole afin de ralentir leur prise de poids en vue de leur passage dans les appareils d’IRM et de microCT en fin d’étude. Une partie des rats (n=216) subira un prélèvement sanguin (au niveau de la veine de la langue ou de celle de la queue). Le prélèvement de sang au niveau de la veine de la langue pourrait être associé à l’apparition d’hématomes sublinguaux. Certains animaux (n=180) subiront un gavage journalier 5 jours sur 7 (volume max : 1,5 mL/Kg). Tous les rats du protocole (n=242) seront soumis à plusieurs cycles d’anesthésies gazeuses d’une durée pouvant aller de 45 minutes à deux heures. Les rats ayant subi une anesthésie gazeuse pourraient souffrir de déshydratation. En fin de protocole 216 rats subiront une chirurgie sous anesthésie générale en vue de prélever la totalité de leur volume sanguin par ponction dans l’aorte abdominale.
Devenir
Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés et la totalité de leur volume sanguin sera prélevé pour permettre à l'équipe de récupérer assez de sang pour la réalisation des analyses biochimiques et hématologiques nécessaires à l’interprétation des résultats. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal seront récupérées post-mortem pour analyses histologiques et quantification de l’expression des principaux marqueurs de calcification (expression protéique et des ARNm).
Remplacement
Les études menées in vitro suggèrent que l’Interleukin 8 pourrait être l'un des éléments clés favorisant le développement des calcifications vasculaires et valvulaires dans l'insuffisance rénale chronique. In vitro, l'antagonisme des recepteurs de l'IL-8, appelés CXCR1 et CXCR2, inhibe les effets procalcifiants de l'IL-8. La présente étude vise à vérifier si l’usage de l’antagoniste des recepteurs de l'IL-8 (la ladarixine) permet de prévenir les dysfonctions valvulaires et cardiovasculaires survenant chez le rat atteint d'insuffisance rénale chronique. Ces phénomènes complexes (modification de la surface de l’orifice valvulaire, de la dimension de la valve, de l’épaisseur et de l’expansion de la paroi de la racine aortique, modulation du flux transvalvulaire aortique, du débit cardiaque, de la vitesse de l’onde de pouls, des dimensions et fonctions systoliques et diastoliques du ventricule gauche) qui apparaissent suite au développement des calcifications, ne sont pas modélisables in vitro et leur évaluation chez l’animal est un prérequis à une éventuelle utilisation de l'antagoniste chez l’homme.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué en tenant compte du pourcentage de décès lié à l’administration du régime provoquant l'insuffisance rénale chronique et du fait qu'il nous faudra en moyenne 12 animaux par groupe afin de réaliser des statistiques robustes nous permettant de conclure fermement sur notre hypothèse. Nous avons opté pour la mise en place d’une étude pilote « à tiroir » visant à déterminer à partir de petites cohortes la composition optimale du régime à administrer pour induire une insuffisance rénale chronique et des calcifications cardiovasculaires. Ceci permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour les mises au points. Les aortes et les valves aortiques de chaque animal utilisé pour les mises au point des procédures d'imagerie seront récupérées post-mortem pour faire des mises au point d’histologie et de biologie moléculaire, ce qui évitera de commander des animaux de nécropsie spécifiquement à cet effet. Les fonctions valvulaires, vasculaires et cardiaques ainsi que le développement des calcifications cardiovasculaires seront évalués au moment de l'entrée des animaux dans le protocole, en milieu de protocole et avant l’euthanasie des animaux grâce à des techniques d’imagerie non-invasives. Cette approche longitudinale permettra d’obtenir un niveau élevé d’informations à partir du même animal, et de réduire le nombre d’animaux puisque le suivi morphologique du cœur, de la valve et de l’aorte ne nécessitera pas l’euthanasie. En fin d’étude, ces organes pourront être utilisés pour d’autres analyses (histologie, expression protéique et des ANRm). L’application sur un même animal de trois approches d’imagerie non invasives permet de réduire par 3 le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Cette approche permettra aussi de minimiser l'impact de l'hétérogénéité inter-individus au sein d'un même groupe et d’observer de manière longitudinale l’évolution de la pathologie. Pour éviter tout double emploi injustifié des animaux, une partie des os des rats de ce protocole seront récupérés post-mortem et utilisés dans le cadre d’une autre étude.
Raffinement
Une période d'acclimatation de 7 jours sera mise en place à l'arrivée des rats. Les conditions d'élevages seront optimisées afin d'offrir aux rats un maximum d'éléments environnementaux leur permettant de reproduire leurs comportements naturels (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en carton pour se cacher, et des bûchettes). Les animaux âgés de 8 semaines et pesant environ 350g lors de leur entrée dans le protocole seront hébergés par 2 dans des cages standards (900 cm2). Si leur poids venait à dépasser 600g en cours d’étude, chaque duo sera hébergé en cage de 1800 cm2. Les animaux feront l’objet d’un handling journalier. Les animaux soumis au régime provoquant l'insuffisance rénale feront l’objet d’un suivi quotidien sur toute la durée du protocole grâce à une grille de scoring de la douleur adaptée. Si une souffrance associée au régime est détectée, des périodes de discontinuations seront envisagées (aliment donné 4 jours par semaine en alternance avec des phases de récupération de 3 jours durant lesquelles les rats seront nourris avec l’aliment standard). Nous avons choisi d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin d’évaluer de façon longitudinale la calcification du système cardiovasculaire ainsi que la morphologie du cœur et de la valve plutôt que d’euthanasier des animaux pour l’étude ex-vivo de chacun de ces paramètres. Cette approche nous a permis de réduire par 3 le nombre d'animaux necessaires à l'étude. Concernant la ladarixine, les données publiées dans divers modèles de souris et rats ainsi que les données obtenues lors des phases I et II du développement clinique de la molécule sont en faveur d’une très bonne tolérance.
Choix des espèces
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle invertébré permettant de reproduire le syndrome le développement des calcifications vasculaires et valvulaires secondaires au développement d'une insuffisance rénale chronique, c’est pourquoi nous nous sommes orientés vers le rongeur. Chez le rongeur, le modèle rat est idéal car la valve aortique est de calibre suffisant pour la réalisation d’analyses d’expression protéiques et d’ARN, contrairement au modèle souris (valve aortique trop petite). Le modèle alimentaire choisi est usuellement utilisé chez des rats mâles âgés de 8 semaines lors de leur entrée dans le protocole. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur des rats mâles à ce stade de développement.