Les projets approuvés

9 000 souris et rats vont être utilisés pour des tests de sécurité réglementaires exigés avant les essais cliniques de médicaments, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules candidates, subissent des prélèvements, sont isolés jusqu'à douze heures pour mesurer leur respiration, et une partie porte un émetteur cardiaque implanté par chirurgie. Le porteur présente l'établissement comme spécialisé dans ces études commandées par des clients, et affirme qu'aucun modèle ne remplace l'animal pour prédire la toxicité. La plupart sont tués à l'issue, une partie des rats réutilisée dans des procédures sans réveil, quelques témoins adoptés.

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.

Bénéfices attendus

Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, généralement 6h et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 minutes environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.

Impact sur les animaux

Quatres catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. 3) Liés à l'isolement physique pendant les enregistrements cardiovasculaires (24 à 72h maximum, généralement moins de 30 heures ; 4) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.

Devenir

Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à au moins par cage, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement. En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation. MODIFICATION : en cas d'isolement pour des mesures télémétriques de plus de 24h, l'enrichissement est doublé et des friandises apétentes sont rajoutées aux copeaux.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par des textes internationnaux. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 5 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 5-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.

Une artère de la patte comprimée pendant dix minutes puis relâchée dix minutes, une course sur tapis roulant, une injection destinée à imiter en six heures les effets du diabète. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cœur soit analysé. Le porteur cherche à comprendre pourquoi le cœur et les vaisseaux des personnes diabétiques répondent mal à l'effort, et espère y appuyer des stratégies de prévention par l'activité physique ou la nutrition. Il qualifie l'occlusion de l'artère fémorale de modèle non invasif et l'épreuve d'effort de source de quelques irritations aux pattes, sans autre précision sur ce que représentent dix minutes d'arrêt de la circulation.

Objectifs

L'augmentation de la quantité de sucre dans le sang, telle qu’observée dans le cadre du diabète, perturbe l'équilibre entre deux mécanismes de régulation qui conduit à une baisse de la production de monoxyde d'azote (une molécule essentielle au relâchement de nos vaisseaux et au bon fonctionnement de notre coeur) engendrant ainsi une altération de la fonction cardiaque et vasculaire. En conditions de stress (comme retrouvé dans une situation d'exercice physique par exemple), la production de monoxyde d'azote joue pourtant un rôle majeur afin de permettre une augmentation de la taille des vaisseaux ainsi qu’une augmentation des propriétés de contraction et de relaxation du coeur. Ceci pourrait donc compromettre les adaptations et expliquer, au moins en partie, les problèmes cardiovasculaires retrouvés chez des personnes diabétiques en conditions de stress. Néanmoins, l'état actuel de la littérature ne permet pas de comprendre comment cette compétition peut affecter la réponse cardiovasculaire aux conditions de stress chez des personnes diabétiques. L'objectif du présent projet sera donc d'évaluer l'impact de la compétition entre ces deux mécanismes afin de mieux comprendre ce qui se passe chez une personne diabétique soumise à un stress et de par la suite pouvoir mieux prendre en charge cette problématique.

Bénéfices attendus

Le présent projet nous permettra de mieux comprendre l'impact du diabète sur la réponse du coeur et des vaisseaux à un stress et servira au développement de stratégies de prévention basées sur l'activité physique ou la nutrition pour améliorer la santé des patients. En effet, si notre hypothèse se confirme, nous pourrons utiliser ces nouvelles stratégies pour restaurer une fonction "normale" et ainsi améliorer la santé cardiovasculaire des patients.

Procédures

Sur les 80 animaux du projet, 40 animaux recevront une injection (durée de l'injection : entre 2 et 5 secondes) d'une molécule permettant de mimmer les effets du diabète. Après 6 heures, les animaux seront évalués sur les différents tests : un test de tolérance à l'effort sur tapis de course, un test réactivité des vaisseaux induit par une compression de l'artère fémorale pendant 10 minutes puis reperfusion pendant 10 minutes afin de stimuler la dilatation du vaisseau de manière mécanique (20 animaux), une injection (durée de l'injection : entre 2 et 5 secondes) de drogues permettant d'engendrer un stress chimique uniquement. L'ensemble de ces procédures durereront environ 40 minutes et seront réalisées avec toutes les précautions nécessaires permettant de limiter les nuisances.

Impact sur les animaux

Le traitement avec la molécule mimmant le diabète peut avoir un impact sur la santé des animaux. Néanmoins, nous utiliserons un modèle court (6 heures) qui a fait ses preuves dans la littérature et qui permet de limiter le risque de souffrance des animaux. La réalisation de l'occlusion artérielle peut induire quelques effets indésirables, néanmoins, afin de limiter ces possibilités nous utilisons un modèle non invasif sur une très courte durée qui a pour but unique d'augmenter le flux sanguin au niveau de la patte. L'épreuve d'effort réalisée sur tapis roulant peut induire quelques irritations au niveau des pattes, néanmoins elle sera réalisée sur un tapis adapté après une habituation chez les animaux, ce qui limitera les possiibilités de nuisances.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le coeur pour effectuer des analyses.

Remplacement

Il n'existe à ce jour aucun modèle de substitution in vitro permettant d'évaluer l'impactdu diabète sur la capacité du du coeur et des vaisseaux à répondre à un stress. Nous avons initié des travaux préliminaires sur des cellules afin de limiter au maximum le recourt à l'utilisation des animaux.

Réduction

Pour chaque animal nous utiliserons des évaluations du vivant de l'animal puis des évaluations sur les tissus après mise à mort, ce qui permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. L'effectif nécessaire a été calculé gra^ce à l'utilisation d'un logiciel statistique approprié.

Raffinement

Durant les 7 premiers jours suivant l'arrivée des animaux, aucune expérimentation ne sera réalisée afin de laisser une période d'adaptation à ces derniers. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergées en cages de 6 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum avec un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Afin de limiter la douleur liée aux injections, la zone d'injection sera préalablement enduite de lidocaine (crème). Les animaux sont pesés deux fois par semaine. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme et permet des analyses fonctionnelles. Le modèle souris a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. Les animaux seront utilisés à un stade de jeune adulte (souris de 10 - 12 semaines) afin de pouvoir éviter l'impact confondant de tout phénomène de maturation.

50 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, un émetteur implanté dans l'abdomen et des électrodes placées sous la peau enregistrant leur fonction cardiovasculaire. Ils reçoivent, une fois ou de façon répétée, des molécules en cours de test, et les prises de sang peuvent atteindre 19,5 ml toutes les deux semaines, soit 10 % de leur volume sanguin total. Le porteur écrit que l'implant, dont la durée de vie est d'environ deux ans, rend ces animaux inaptes à toute réhabilitation, et qu'ils seront réutilisés dans d'autres projets ou tués. La finalité est réglementaire : produire le rapport de pharmacologie de sécurité qui accompagne une demande d'essai clinique, étape que le porteur qualifie d'"indispensable" faute de "modèle de substitution".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un composé thérapeutique (potentiellement futur médicament). La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique des ces composés. Préalablement aux études cliniques, leurs effets sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire ces effets pharmacologiques. Seule l’expérimentation animale permet de définir l’innocuité des composés thérapeutiques afin de sécuriser les premiers essais chez l’homme. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations vétérinaires et pharmaceutiques internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de ces composés sur le système cardiovasculaire du macaque. L’évaluation de la fonction cardiovasculaire se fera par l’utilisation d’électrodes sous-cutanée et d’un émetteur placer dans l’abdomen, avant et après administration du composé thérapeutique test. La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé test sur la fonction cardiovasculaire. Ce rapport, requis par la réglementation, fera partie intégrante de la demande d’essai clinique.

Bénéfices attendus

À l’échelle mondiale, les maladies cardiovasculaires demeurent la première cause de décès avec environ 17,9 millions de morts par an, suivies des cancers (10 millions/an), des maladies neurologiques (9 millions/an), des maladies infectieuses (7,7 millions/an), des maladies respiratoires chroniques (3,9 millions/an) et du diabète (1,5 million/an). Pour ces pathologies, il n’existe à ce jour aucune solution thérapeutique satisfaisante. Ce projet vise à couvrir une étape indispensable dans le développement de solutions thérapeutiques. La pharmacologie de sécurité est une phase règlementaire indispensable au développement préclinique, préalable aux études cliniques. Elle permet de caractériser les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. 10 à 12 % des xénobiotiques échouent en essais cliniques en raison de problèmes de sécurité cardiovasculaire. Ces risques cardiovasculaires sont mieux identifiés et anticipés aujourd’hui grâce à l'intégration des études de pharmacologie de sécurité chez le macaque en raison de sa valeur prédictive, notamment dans le cadre des recommandations médicales internationnales. A court terme, le bénéfice premier de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique, spécifique à la fonction cardiovasculaire, d’un composé. A long terme, les données obtenues de ces études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers de demandes d’autoristion d’essais cliniques. Ces études réduiront les risques cardiovasculaires lors de ces essais et contribueront à : 1. améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. améliorer la sécurité des patients, en identifiant/caractérisant les effets cardiovasculaires indésirables 3. optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. réduire les coûts de santé (améliorer la sécurité/efficacité des traitements) 6. répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration, unique ou répété, d'une molécule thérapeutique en phase de test ou d'un composé de référence (témoin). Chaque administration dure quelques minutes ou quelques dizaines de minutes. Des prélèvements sanguins peuvent être effectués (5 minutes environ). La quantité et la fréquence acceptables dépendent du volume sanguin total (VST). Chez le macaque, il est estimé à 195 ml pour un macaque de 3 kg. Environ 10 % du VST peut être prélevé en toute sécurité toutes les 2 semaines (soit 19.5mL) , 7,5 % tous les 7 jours (15 ml) selon les recommandations internationnales vétérinaires. En cas de cinétique (plusieurs prélèvements rapprochés pour déterminer l'évolution de la concentration de la molécule dans le sang), les temps de prélèvement sont déterminés sont les caractéristiques de la molécule testée tout en respectant le volume maximal possible de 7,5% sur 7 jours glissant. Par exemple : prélèvement avant administration, puis 3h, 6h, 12h et 24h après, 0.5 à 1 ml à chaque temps. Dans une étude standard, 5 administrations sont nécessaires : 1 avec un placebo, 3 avec une doses différentes de la molécule thérapeutique, et une dernière avec le dose la plus importante utilisé afin d'effectuer des dosages de la molécule et s'assurer de la bonne exposition de l'animal.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration répétée d'une molécule peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque de lésions ou d’infection lors d’administration intrathécale, intracraniale (lésions neurologiques, paralysie partielle) ou intra-articulaire (boiterie, arthrite). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : il n’est pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie en raison de la faible dose administrée de xénobiotique ou d'une administration unique.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet ne sont pas aptes à une réhabilitation en raison du système d'enregistrement cardiovasculaire implanté. Le système a une durée de vie d'environ 2 ans. Dans la mesure du possible, les animaux seront ré-utilisés (après validation vétérinaire prenant en compte l'ensemble de la vie de l'animal) dans d'autres projets afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. S'ils ne sont pas aptes à une réutilisation, ils seront euthanasiés.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule étrangère à l’organisme (le composé thérapeutique) et une ou plusieurs cibles liées au système cardiovasculaire (objet de cette DAP). Ces interactions englobent les effets du composé ou de ses produits de dégradation, sur des cibles, mais aussi l’influence éventuelle de ces cibles sur le composé. Une compréhension fine des mécanismes toxique et pharmacologique est donc indissociable d’une connaissance approfondie des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. À ce jour, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes impliqués dans la toxicité cardiovasculaire ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe pas, en conséquence, de modèle de substitution. C’est pourquoi la réglementation impose l’évaluation de la sécurité pharmacologique d’un composé thérapeutique avant toute administration chez l’humain. Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie cardiovasculaire de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • des études pilotes seront réalisées, si nécessaire, sur un nombre limité d’animaux. L’objectif sera d’identifier les doses les plus favorables et les moins toxiques • un même animal pourra participer à plusieurs études si et seulement si : o les composés testés précédemment n’ont présenté ni effets cardiovasculaires irréversibles, ni effets toxiques oUne période de repos de 15 jours minimum entre la fin de dernière étude et la prochaine. Cette période peut être allongé selon les profils pharmacocinétiques des produits, un avis vétérinaire. o les paramètres biochimiques et hématologiques évalués avant l’étude se situent dans les valeurs de référence attendues pour cette espèce Le nombre d’animaux par étude est de 4 (4 males) et peut aller jusqu’à 8 (4 males et 4 femelles). Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation statistique pertinente des données, et la caractérisation correcte des effets cardiovasculaires potentiels.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : La gestion du stress et de l’angoisse : à leur arrivé sur site, les animaux seront acclimatés (3 semaines) aux conditions d’hébergement, et suivent un programme d’habituation et d’entrainement aux procédures expérimentales ainsi qu'aux manipulations vigiles, basés sur le renforcement positif. Ils seront également hébergés en collectivité, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi, validé par la structure en charge du bien-être animal et le service vétérinaire La prise en charge précoce de la souffrance : un opérateur observera a minima matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement selon une procédure interne rédigé par le service vétérinaire. Dès les premiers signes de douleur, une intervention vétérinaire sera effectuée. L’utilisation de grilles de signes cliniques ou de score de douleurs permettra aux opérateurs et aux vétérinaires de mettre en place les mesures les mieux adaptés à l’état de l’animal. Un vétérinaire est toujours présent aux heures ouvrées et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7 Certaines administrations seront effectuées systématiquement sous anesthésie Des soins vétérinaires adaptés si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotiques, analgésiques. En fonction des effets attendus ou observés du composé testé sur la fonction cardiaque, des molécules permettant de traiter ces éventuels effets peuvent être utilisées. L’intégration de points limites stricts afin de limiter toutes souffrances prolongées Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface et un gilet porté le temps des enregistrements est à l’étude.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont encadrées par des directives internationnales. Elles peuvent être réalisées chez des espèces rongeurs ou non rongeurs. Le macaque, en raison de sa proximité avec l’humain, est l’une des espèces non rongeurs retenue pour ce type d’étude, lorsque le composé thérapeutique testé est suceptible de déclencher une réaction immunitaire, que sa cible dans l’organisme est présente que chez les primates (dont l’humain) ou que son métabolisme est plus proche de celui de l’humain chez le macaque par rapport aux autres espèces non primates. Les macaques sont inclus dans les études de pharmacologie à partir de 2 ans.

Cent cinq jours de régime gras, quarante-huit heures enfermées seules dans une cage de mesure sans le moindre enrichissement, une pression artérielle relevée chaque semaine sur animal conscient : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inhibiteur métabolique ajouté à leur eau de boisson, associé au régime, leur fait prendre du poids, rigidifie leurs vaisseaux et abîme leur cœur, ce que le projet cherche justement à observer. Le porteur reconnaît que les injections répétées exposent à une péritonite, l'anesthésie à une détresse respiratoire, et l'isolement à un stress social. Les souris sont décrites comme viables, fertiles, immunocompétentes et sans pathologie spontanée, l'atteinte étant entièrement fabriquée, et toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes.

Objectifs

Certaines maladies métaboliques chroniques peuvent fragiliser les vaisseaux sanguins et le cœur. Elles surviennent souvent après une alimentation déséquilibrée, trop riche en graisses, et en raison de troubles de la régulation vasculaire. Ces désordres augmentent le risque de maladies cardiovasculaires, qui se manifestent notamment par une prise de poids excessive, une élévation de la pression artérielle, une baisse de la tolérance à l’effort et, à long terme, par une plus grande vulnérabilité à l’insuffisance cardiaque. Ces complications représentent aujourd’hui un problème majeur de santé publique, car leur fréquence augmente dans la population et elles sont associées à une forte morbidité et mortalité. L’origine exacte de ces atteintes reste encore mal comprise. Les interactions entre alimentation, métabolisme, système vasculaire et cœur sont complexes et ne peuvent pas être étudiées uniquement avec des approches cellulaires. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à ces complications cardiovasculaires. Pour cela, un modèle expérimental chez la souris sera utilisé afin de reproduire les effets d’un régime alimentaire déséquilibré associé à une altération de la régulation vasculaire. L’objectif est de déterminer si certains processus biologiques naturels peuvent limiter ou prévenir la prise de poids excessive, la rigidité des vaisseaux et les altérations cardiaques observées. À terme, ces recherches permettront d’identifier de nouvelles pistes pour protéger le cœur et les vaisseaux dans des contextes métaboliques défavorables. Elles pourraient contribuer à améliorer la prévention et la prise en charge des maladies cardiovasculaires en agissant sur leurs causes profondes.

Bénéfices attendus

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins sont parmi les plus fréquentes dans la population. Elles sont souvent favorisées par une alimentation trop riche en graisses ou par un déséquilibre du métabolisme. Ces situations entraînent progressivement une perte de souplesse des vaisseaux et une baisse de la performance du cœur. Ce projet cherche à comprendre comment ces déséquilibres se développent et à trouver des moyens de les prévenir. Des études réalisées chez la souris permettront d’observer les effets d’une alimentation déséquilibrée sur l’organisme et d’identifier des mécanismes naturels capables de protéger le cœur et les vaisseaux. Les bénéfices attendus sont les suivants : – améliorer les connaissances sur les liens entre alimentation, métabolisme et santé cardiovasculaire ; – identifier des processus biologiques qui aident le cœur à résister aux effets d’une mauvaise alimentation ; – ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de prévention des maladies du cœur ; – à long terme, réduire le nombre de personnes atteintes d’hypertension, d’insuffisance cardiaque ou de rigidité artérielle. Ces recherches devraient ainsi contribuer à améliorer la qualité de vie et à diminuer la charge médicale associée aux maladies cardiovasculaires.

Procédures

Certaines souris recevront, pendant cinq jours consécutifs, une injection quotidienne réalisée sur animal vigile, chaque administration durant seulement quelques secondes. À partir du début du protocole, les animaux seront répartis entre deux types d’alimentation, maintenus pendant toute la durée du protocole distribués ad libitum pendant toute la durée du protocole (105 jours). À intervalles réguliers, des prélèvements sanguins seront recueillis chez chaque animal, chaque manipulation ne durant que quelques secondes. Les animaux disposeront d’un temps de récupération complet d’au moins quatre semaines entre deux prélèvements. La pression artérielle sera mesurée chaque semaine (environ 10 minutes) sur animaux vigiles, après une courte phase d’habitation. Les fonctions cardiaques et vasculaires seront évaluées à trois reprises (jours 35, 70 et 105) grâce à des examens d’imagerie réalisés sous anesthésie légère, d’une durée d’environ 30 minutes chacun. Entre les jours 90 et 92, les animaux seront hébergés individuellement pendant une durée maximale de 48 heures afin de mesurer en continu leur activité, leur dépense énergétique et leur consommation alimentaire et hydrique.

Impact sur les animaux

L’administration prolongée d’un régime alimentaire riche en graisses, associée à l’exposition à un inhibiteur métabolique dans l’eau de boisson, peut induire une prise de poids excessive, une diminution de la tolérance à l’effort et une altération de la mobilité. Ces modifications s’accompagnent d’un risque de déséquilibre alimentaire pouvant entraîner une diminution de l’appétit ou une perte de poids excessive. Elles peuvent également induire des perturbations cardiovasculaires progressives, responsables de fatigue accrue et d’une moindre activité locomotrice. Les injections nécessaires à l’induction génétique sont susceptibles de provoquer une douleur transitoire au point d’administration ainsi qu’un risque rare d’irritation locale ou d’inflammation et, en cas d’injections répétées, un risque rare de péritonite. L’anesthésie brève requise pour les examens échocardiographiques peut entraîner une perturbation de la thermorégulation, une récupération plus lente, et exceptionnellement une détresse respiratoire. Ces épisodes sont transitoires mais génèrent un stress physiologique et une sensation d’inconfort. Le placement temporaire en hébergement individuel, limité à 48 h, s’accompagne d’une réduction des possibilités d’enrichissement et peut induire un stress social ou environnemental. De même, les prélèvements sanguins effectués sur animaux vigiles peuvent provoquer une douleur brève, un risque de petit hématome et un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre équipe privilégie chaque fois que possible le recours à des méthodes alternatives pour limiter l’utilisation d’animaux. Dans les phases préparatoires, nous utilisons des modèles in vitro (cultures cellulaires) ainsi que des approches in silico (modélisation informatique et analyses prédictives). Ces méthodes permettent de formuler des hypothèses et de tester certaines pistes de recherche sans recourir directement à l’animal. Cependant, l’avancée de ce projet nécessite l’utilisation de modèles animaux. En effet, il s’agit d’évaluer les conséquences de déséquilibres métaboliques prolongés sur le cœur et les vaisseaux. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre plusieurs systèmes de l’organisme (métabolique, vasculaire, cardiaque, nerveux, immunitaire) qu’aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire dans leur globalité. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de simuler de manière fidèle l’impact chronique d’une alimentation déséquilibrée et ses effets sur l’ensemble du corps. Seul un organisme vivant permet d’intégrer et de mesurer ces réponses, dans des conditions proches de la situation pathologique humaine. L’expérimentation animale est donc indispensable à ce stade du projet, car elle seule permet de valider les observations, de comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer le potentiel de nouvelles approches préventives ou thérapeutiques.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 720 souris. Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures sont mises en place. Les suivis sont réalisés de manière longitudinale, ce qui signifie que les mêmes animaux sont observés à différents moments de l’étude. Cette approche permet d’obtenir plusieurs informations successives chez un même individu et donc de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, chaque animal fournit plusieurs organes et tissus qui sont analysés selon différentes approches. L’exploitation multiple des échantillons maximise ainsi les informations recueillies pour un même animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec nos collaborateurs, ce qui contribue à limiter encore davantage le recours à de nouveaux animaux dans le cadre d’autres projets. Le nombre d’animaux a été défini sur la base d’une analyse statistique préalable, afin de garantir que les effectifs soient suffisants pour obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. L’équilibre entre mâles et femelles sera respecté afin de rendre les conclusions plus transposables. L’ensemble de ces mesures vise à optimiser l’utilisation des animaux, à réduire leur nombre au strict nécessaire et à maintenir la robustesse scientifique des résultats obtenus.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur, à l’exception de périodes très courtes encadrées par une autorisation spécifique, lors des séjours temporaires dans des cages de mesure où aucun matériel d’enrichissement ne peut être ajouté. L’environnement habituel sera enrichi avec du matériel permettant la construction de nids et des abris, favorisant les comportements naturels et limitant le stress. Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter précocement tout signe de mal-être, tel qu’une activité réduite, un pelage terne, un isolement ou une posture inhabituelle. Des critères précis sont définis pour interrompre la participation à l’étude si l’état d’un animal se détériore, notamment en cas de perte de poids importante, de baisse durable de l’appétit ou de signes de faiblesse. Les zones d’injection seront suivies pour repérer toute irritation. L’utilisation d’aiguilles fines et l’alternance des côtés permettront de réduire les effets locaux. Pour les examens nécessitant une anesthésie, une durée courte sera privilégiée afin de limiter l’impact sur l’animal. La respiration et la température corporelle seront surveillées, et les animaux resteront sur une surface chauffée jusqu’à leur réveil complet. En cas de baisse d’appétit, une alimentation adaptée sera proposée. Lors des séjours temporaires dans les cages de mesure, la durée sera limitée à deux jours, avec une attention particulière portée au comportement et à l’état général des animaux. Le personnel participant à ces procédures est formé et suit une formation continue. Les ajustements nécessaires pourront être décidés avec le vétérinaire ou le responsable du bien-être animal pour améliorer les conditions sans compromettre la validité scientifique du projet.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont viables, fertiles, immunocompétentes et ne présentent pas spontanément de pathologie. Le phénotype étudié est induit par l’association d’un régime alimentaire déséquilibré et d’un traitement perturbant la fonction vasculaire. Les animaux développent alors une prise de poids, une rigidité des vaisseaux, des anomalies cardiaques et une diminution de la tolérance métabolique, reproduisant certaines caractéristiques des maladies cardiovasculaires liées à une mauvaise alimentation et à une altération de la fonction endothéliale. Le choix de la souris repose sur sa pertinence scientifique et méthodologique. Ce modèle est bien établi, largement utilisé pour l’élevage, les manipulations et le suivi clinique. L’existence de lignées génétiquement modifiées ciblées permet d’explorer la contribution spécifique de certains tissus à la physiopathologie étudiée. Le modèle murin présente ainsi une transposabilité pertinente pour comprendre les interactions entre métabolisme, cœur et vaisseaux. Les animaux seront utilisés à partir de 8 à 10 semaines, âge correspondant à la maturité physiologique et métabolique, notamment cardiaque. Ce stade permet d’évaluer de façon fiable l’impact d’un régime alimentaire gras associé à une dysfonction vasculaire, tout en évitant les biais liés à la croissance ou au développement.

Tous tués pour prélèvement d'organes, 169 120 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu peut passer sept séances d'imagerie avec coloration in vivo des tissus calcifiés, comptant 45 minutes de coloration et de lavage, et jusqu'à quatre échocardiographies. Certains sont soumis deux fois par jour à un régime riche en graisses pendant 90 jours ou plus, d'autres à un choc thermique local ou à des injections répétées, et les poissons génotypés sont isolés deux à sept jours en attendant le résultat de la biopsie. Le porteur explique cet effectif par la variabilité entre individus et par le caractère progressif de la calcification, et précise que 169 120 correspond au maximum qu'il peut utiliser.

Objectifs

La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes molécules thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.

Procédures

Pour tous les gestes techniques, les animaux seront anesthésiés. Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Les animaux seront analysés par microscopie d'imagerie en direct (10 minutes d'imagerie par point de temps) avec une coloration in vivo pour les tissus calcifiés (45 minutes de coloration et de lavage). Chaque animal sera soumis à cette procédure au maximum 7 fois (à 5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 jours post fertilisation) sur les 30 jours de l’expérience. Une échocardiographie (10 minutes d'imagerie par point de temps) sera réalisée au maximum 4 fois par animal sur une durée maximale de l’expérience de 60 jours. Certains poissons recevront 2 fois par jours une alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux sur une durée pouvant aller de 90 jours, voire plus. En ce qui concerne les traitements médicamenteux, si l'administration se fait dans un bain, l’incubation varie de 3 à 6h ; si l’administration du médicament se fait par injection, le temps d'anesthésie est inférieur à 2 minutes et l'injection est très rapide (quelques secondes). Les poissons seront traités pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. Les médicaments seront administrés en doses uniques ou répétées en fonction de leur durée de vie et des périodes d'absorption. Une autre intervention consistera en un choc thermique local d’une durée inférieure à une minute suivi de 10 minutes d'imagerie par point de temps. L’expérience pourra durer jusqu’à 90 jours, ou plus. Concernant le génotypage des poissons, les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) pour une biopsie (quelques secondes). Les poissons seront isolés jusqu’au résultat de la biopsie (2 à 7 jours).

Impact sur les animaux

Les animaux adultes seront soumis, lors de l'administration des médicaments ou des composés destinés au traçage et au marquage des cellules, à une injection d’une durée inférieure à 30 secondes, douleur légère. L'effet du médicament ou du traitement peut entraîner des phénotypes spécifiques d’une durée de 1 à 14 jours dont les douleurs seront de classe légère à modérée. Les études échographiques pourront engendrer une douleur légère de courte durée (5 minutes maximum). Pour les besoins expérimentaux, les animaux pourront être hébergés de manière isolée pouvant durer jusqu'à 14 jours (sévérité légère à modérée selon la durée). Les phénotypes dommageables potentiellement observés sur les lignées mutantes incluent des modifications de la morphologie (déformations squelettiques, variations de taille ou de l’opercule), des atteintes oculaires ou des nageoires, ainsi que des changements d’aspect ou de vitalité liés au vieillissement. Les niveaux de sévérité peuvent varier de léger à modéré sur une durée de 6 mois maximum. Une surveillance accrue sera effectuée afin de prévenir et limiter la souffrance des animaux. Tout individu présentant des effets indésirables entraînant une souffrance significative sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse.

Remplacement

Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro pour comprendre la calcification cardiovasculaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques complexes de ces maladies, puisqu'elles résultent de l'action de multiples facteurs et types de cellules. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.

Réduction

La diversité entre les individus, particulièrement prononcée chez les jeunes poissons zèbres (à leurs stades larvaires), explique pourquoi il est nécessaire d'utiliser un plus grand nombre d'animaux afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour valider nos résultats. De même, la calcification cardiovasculaire, qui évolue progressivement et de manière très variable, requiert également un nombre accru d'animaux pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que chaque fond génétique peut présenter une variabilité différente, nous prévoyons de réaliser nos expériences en plusieurs étapes, augmentant progressivement notre effectif, afin d'éviter d'utiliser un surplus d'animaux si la puissance statistique est atteinte avec un effectif moindre. Par conséquent, le nombre d'animaux requis correspond au maximum que nous pouvons utiliser. Étant donné la nature dynamique et hétérogène de la calcification cardiovasculaire, nous suggérons d'exploiter et de créer un grand nombre de lignées génétiques. Ceci permettra d'explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à l'établissement et à l'aggravation du phénotype de calcification. En utilisant des techniques d'imagerie en direct, nous serons en mesure de suivre la progression individuelle de la calcification chez les mêmes animaux, réduisant ainsi le recours habituel à un grand nombre d'animaux pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem ainsi que les coupes histologiques de tissus.

Raffinement

Tout au long de notre projet, les animaux seront maintenus dans des conditions optimisées pour assurer leur bien-être. Les paramètres de l’eau (température, conductivité et pH) ainsi que le cycle lumineux seront contrôlés. Un enrichissement sera assuré par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Des points limites sont fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. De plus, nous utiliserons des procédures non invasives (imagerie, échocardiographie) afin de caractériser le processus de calcification cardiovasculaire.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour la recherche en raison de ses caractéristiques uniques. Sa transparence durant les premières semaines après la fécondation permet des techniques d'imagerie exceptionnelles, impossibles avec d'autres modèles. Sa petite taille et sa grande progéniture facilitent son hébergement et sa manipulation, favorisant les études à haut débit. De plus, ses techniques avancées de transgenèse et de mutation offrent diverses méthodes pour étudier spécifiquement les gènes et les voies de signalisation. La similitude marquée entre le poisson zèbre et les mammifères renforce sa valeur en tant qu'organisme modèle. Sa remarquable capacité de régénération tissulaire tout au long de sa vie le rend particulièrement intéressant d'un point de vue d’application clinique. Pour notre projet, le poisson zèbre offre la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement et de cibler des cellules spécifiques grâce à des techniques d'ablation génétique. Cela en fait l'organisme idéal pour notre étude sur l'établissement de la calcification cardiovasculaire, aussi bien au cours du développement que chez les adultes. Nous examinerons les stades larvaires et juvéniles (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 jours post-fécondation) pour comprendre les étapes clés du développement cardiovasculaire, ainsi que les stades adultes (60, 90 et >90 jours post-fécondation) pour observer les tissus sains et malades chez les jeunes et les animaux plus âgés.

4 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour analyse du cœur et des organes, une partie gardée pour entretenir l'élevage. Elles subissent une biopsie de la queue ou de l'oreille, des injections, et pour certaines des échocardiographies sous anesthésie de quinze minutes. Le porteur indique que certains animaux portent un phénotype dommageable provoquant une atteinte cardiaque et une mort spontanée, et prévoit 60 souris par groupe au lieu de 40 pour absorber cette mortalité. Il qualifie le modèle animal d'"incontournable" et de "préalable indispensable" pour valider des traitements de la myocardite, tout en précisant que les produits testés sont des références du commerce dont l'efficacité a déjà été confirmée sur cellules.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre le rôle de l'inflammation dans la myocardite, pathologie cardiaque aigüe et sévère. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris présentant spontanément une myocardite. Nous étudierons la fonction cardiaque ainsi que la présence de cellules immunitaire dans le coeur afin d’identifier les acteurs clés responsables de l’aggravation de la maladie. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette myocardite, et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques pour cette pathologie qui présente chez l’homme une évolution rapide et souvent grave, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 à 50%.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires résultant de l'action des cellules immunitaires au cours d'une myocardite. Le développement d'un traitement de la phase aiguë de la myocardite présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Les animaux vont subir la une biopsie de queue ou d'oreille. Une partie des animaux va subir une injection d'une durée maximale de 30 seconde. Une partie des animaux va subir une ou plusieurs échocardiographie non-invasive et indolore qui sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, stress lié à l'anesthésie. Potentielle douleur légère et de courte durée lors de l'injection et lors de la biopsie de queue ou d'oreille. Certains animaux présentent un phénotype dommageable associé à une atteinte cardiaque provoquant une mort spontannée.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront utilisés pour contribuer au maintien de l'élevage ou pour constituer les groupes expérimentaux s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux constituant les groupes expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

L'étude expérimentale sur des animaux est une étape incontournable pour comprendre les mécanismes intervenant dans le développement de la myocardite. En effet, ces phénomènes complexes impliquent plusieurs organes et de nombreux types cellulaires, ce que les modèles in vitro ne peuvent reproduire. Nous cherchons à comprendre dans ce modèle animal, les diverses interactions cellulaires et tissulaires qui se produisent lors d'une myocardite. Ces modèles précliniques de souris sont également un préalable indispensable pour valider les stratégies thérapeutiques avant leur application chez les patients atteints d'une myocardite. Les produits utilisés sont des références disponibles dans le commerce et dont l'efficacité a déjà été confirmée in vitro sur des cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 17 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents au modèle animal, et en distinguant mâles et femelles, nous estimons une taille de groupe à 40 animaux sans phénotype dommageable et 60 pour les animaux présentant le phénotype dommageable, afin d’inclure la mortalité associée au modèle. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par le personnel technique qualifié de l’animalerie ainsi que les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. Nous utiliserons des souris âgées de 3 semaines environ au moment de l'identification Cet âge correspond à l'âge à partir duquel il faut sevrer les animaux. Nous utiliserons ensuite les animaux adultes, âgés de 9 à 32 semaines pour les expérimentations. A ces âges, le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité mais n'est pas encore senescent.