Les projets approuvés

2 200 souris subissent une électrostimulation sous anesthésie destinée à léser leur muscle, puis une mesure de force musculaire également sous anesthésie. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ce dispositif de "totalement non-invasif" alors qu'il sert à endommager le muscle, et affirme que l'interaction entre cellules ne peut être étudiée qu'in vivo. Les souris sont tuées pour prélever le tissu musculaire et analyser le métabolisme des cellules souches qu'il contient.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Cette régénération est notamment médiée par une population cellulaire spécifique, les cellules souches musculaires. De précédentes études ont démontré l’importance du métabolisme dans la fonction de ces cellules. Le projet vise à i) caractériser le comportement et le destin de cette population cellulaire au cours de la régénération, ii) identifier les régulations métaboliques sous-jacentes, iii) identifier des cibles biologiques qui permettraient d’influer sur la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser les régulations métaboliques qui surviennent au cours de la régénération musculaire et d’identifier des cibles potentielles qui permettraient d’influer sur cette régénération. De plus, les analyses réalisées au cours de ce projet conduiront à la création d’une base de données importante sur le métabolisme des cellules souches lors de la régénération musculaire qui pourra alimenter des projets ultérieurs et être mise à disposition de la communauté scientifique. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques.

Procédures

Les souris sont soumises à un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum) et à une une mesure de force musculaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation, anesthésies). Le stress des animaux inclut : 1) l'anesthésie gazeuse lors de l'induction de la blessure musculaire (environ 15 minutes), 2) l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort (environ 1 minute).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8-12 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes.

Marquées avec des perles de couleur, soumises deux fois par jour pendant un mois à un courant de 50 cm/s, puis injectées de puromycine et tuées vingt-cinq minutes plus tard : 60 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exercice de nage à l'activité des cellules à l'origine des fibres musculaires, avec des recommandations attendues pour les pisciculteurs sur la gestion du débit d'eau en élevage. La description des atteintes ramène l'effort à un courant intense de dix minutes, quand le protocole annonce deux séances quotidiennes sur un mois. Les truites sont tuées pour prélever muscle et foie, et le porteur précise que des échantillons de ces mêmes individus alimenteront un autre projet.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer chez les poissons les effets de l’exercice physique sur les cellules à l'origine des fibres musculaires— en termes d’activité et de nombre — et de les relier aux variations de taille et de nombre des fibres musculaires. Nous pourrons également déterminer dans quelle mesure l'activité physique chez la truite altère l'activité respiratoire des cellules et la production des protéines, et étudier le lien entre ces deux processus.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, il sera possible de déterminer si l’exercice appliqué durant la phase exponentielle de croissance influence l’activité des cellules nécessaires à la formation des fibres musculaires, lesquelles jouent un rôle déterminant dans le potentiel de croissance ultérieur des animaux. Par ailleurs, les connaissances acquises permettront d’élaborer des recommandations à destination des pisciculteurs concernant la gestion du débit d’eau dans les systèmes d’élevage, dans le but d’optimiser la croissance musculaire et la qualité des produits.

Procédures

Après un marquage externe à l'aide de perles de couleur, 20 animaux seront soumis à un courant d'eau de 50 cm/s, 2 fois par jour, pendant 1 mois. Ensuite les animaux seront injectés avec de la puromycine puis euthanasiés 25 min plus tard pour réaliser des prélèvements de tissus (foie et muscle).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un courant intense (50cm/s) pendant 10 minutes, ce qui peut induire un stress transitoire. Bien que cet effort soit intense, il est de courte durée, et les animaux devraient s'habituer à ce changement soudain de courant.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puisque nous devons prélever des échantillons de muscle et de foie pour des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des de l'exercice sur la plasticité des cellules nécessaires à la formation in vivo de fibres musculaires, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons construit un couloir de nage de petite taille pour maintenir une densité optimale et un effectif de 30 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 20 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires. Par ailleurs, des échantillons de ces mêmes animaux seront utilisés dans le cadre d'un autre projet, évitant ainsi l'utilisation d'animaux additionnels.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, pH) seront également régulièrement contrôlés. L’ensemble des transferts et manipulations sera réalisé dans les plus brefs délais afin de limiter au maximum la durée d’émersion et le stress induit par la capture. Le marquage des animaux et les injections seront réalisés sous anesthésie. Les dispositifs expérimentaux seront installés à proximité immédiate des bassins d’élevage afin de réduire les temps de transfert. Une grille d'évaluation du bien-être animal a été mise en place et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité.

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent 28 ou 56 jours en hypoxie intermittente, des baisses répétées d'oxygène reproduisant l'apnée du sommeil, dans le bruit de la machine et avec la fatigue d'un sommeil dégradé, puis reçoivent une lésion musculaire provoquée sous anesthésie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, mieux comprendre comment ce manque d'oxygène perturbe le muscle chez des souris jeunes ou âgées, mâles ou femelles. Le porteur mène en parallèle des cultures de cellules souches musculaires, tout en écartant le remplacement total au motif que le in vitro ne rend pas compte des interactions dans un tissu entier, et fixe des groupes de huit à dix animaux sans dire combien de groupes composent les 3 360.

Objectifs

Le Syndrôme d’Apnées Obstructives du Sommeil (SAOS) est le trouble respiratoire du sommeil le plus courant, qui touche plus d’un milliard de personnes dans le monde. Cette maladie chronique se caractérise par des épisodes répétés de l'affaissement complet ou partiel des voies aériennes supérieures entraînant une diminution transitoire de la saturation en oxygène appelée hypoxie intermittente. Cette succession de phases hypoxiques et de réoxygénations crée un déséquilibre d’approvisionnement des organes en oxygène, responsable de nombreux effets délétères pour notre organisme tels que de l’inflammation, des anomalies vasculaires et de la mortalité cellulaire. Certains patients atteints de SAOS présentent des changements structurels et bioénergétiques dans les muscles squelettiques impliqués dans la respiration mais l’impact de l’hypoxie intermittente sur la biologie des muscles squelettiques périphériques et des cellules souches musculaires reste méconnu. Chez l’adulte, le muscle squelettique a une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites nommées ainsi du fait de leur localisation en périphérie des fibres musculaires. Elles sont présentes dans toutes les masses musculaires squelettiques, où elles résident dans un état de repos jusqu’à ce que des stimuli notamment environnementaux viennent les solliciter afin de participer à l’homéostasie et à la régénération musculaire. Notre hypothèse est que l’hypoxie intermittente joue un rôle délétère sur la fonction des cellules satellites en homéostasie ou au cours de la régénération musculaire. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’impact de l’hypoxie intermittente sur l’homéostasie du muscle squelettique et au cours de la régénération chez la souris saine, jeune ou âgée, mâle ou femelle.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’hypoxie intermittente liée au SAOS perturbe l’homéostasie du muscle sain ou en régénération, chez des sujets jeunes ou âgés, mâles ou femelles.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de trois : 1. Modèle de régénération musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 3. Prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Exposition à une hypoxie intermittente (28 ou 56 jours) 2. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesthésié (2 fois / souris, durée : 15 min) 3. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition à l’hypoxie intermittente : à l'hypoxie au début de l'expérimentation et au bruit généré par la machine ainsi qu'une fatigue chez les souris due à une faible qualité de sommeil. Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire passées les 24 premières heures post-lésionnelles suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à l’hypoxie intermittente.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à nos questions biologiques.

Remplacement

Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, présentant des similitudes au niveau des systèmes de réparation du muscle squelettique humain, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de l'hypoxie intermittente sur le muscle squelettique. Par ailleurs, les souris âgées peuvent fournir des notions importantes sur l’impact de l’hypoxie intermittente sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés (*) et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8-10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans notre modèle de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à l’hypoxie intermittente. (*)Un test de Student (également appelé test T) sera utilisé pour comparer deux groupes (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente versus contrôle). Pour les comparaisons multiples (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente en fonction du sexe et/ou de l’âge), nous utiliserons des tests ANOVA à un ou deux facteurs. Une valeur p < 0,05 sera considérée comme statistiquement significative.

Raffinement

Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour le modèle de lésion musculaire, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon quotidienne pendant les 2-3 premiers jours suivant le début de l’exposition à l’hypoxie intermittente et l’induction de la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris Tg :Pax7-GFP et Tg :Pax7CT2mTmG permettent l’expression ciblée de protéines fluorescentes dans les cellules satellites afin de faciliter leur analyse spatiale en histologie et/ou leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. Le modèle de lésion musculaire utilisé n'entraine aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous utiliserons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 4 mois. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact de l’hypoxie intermittente.

Une injection dans le muscle qui commande le mouvement de l'œil, une autre dans une patte arrière : 40 rats de 24 mois subissent ces deux gestes sous anesthésie générale, avant des injections abdominales quotidiennes pendant deux semaines. Avec 40 rats plus jeunes soumis à quatre prélèvements sanguins en huit heures sur animaux éveillés, 80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. L'objet est de tester si la forskoline, une molécule végétale repérée en étudiant la résistance des muscles oculaires, améliore la régénération musculaire chez des animaux âgés. Le porteur retient le rat pour sa proximité évolutive avec l'être humain et pour une longévité qu'il juge compatible avec l'étude du vieillissement dans un délai raisonnable.

Objectifs

Dans certaines maladies musculaires graves, comme les dystrophies musculaires, les cellules souches musculaires — responsables de la réparation des fibres — vieillissent trop vite et perdent leur capacité de régénération. Avec l’âge, un phénomène similaire se produit également dans les muscles sains, qui deviennent progressivement moins capables de se réparer. Des recherches récentes menées sur un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne ont montré que la forskoline, une molécule d’origine végétale, peut activer une voie biologique permettant de restaurer partiellement la fonction réparatrice des cellules souches. De façon remarquable, cette substance a été identifiée grâce à l’étude des muscles extra-oculaires (les muscles qui bougent les yeux). Ces muscles sont connus pour être étonnamment résistants, aussi bien au vieillissement qu’aux dystrophies musculaires, suggérant qu’ils disposent de mécanismes naturels de protection. Le présent projet vise donc à comparer les mécanismes de vieillissement normal et ceux liés aux maladies musculaires au niveau des cellules souches, et à tester si la forskoline (ou une molécule analogue) peut également améliorer la régénération musculaire chez des animaux âgés. L’objectif final est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques permettant de préserver la force et la masse musculaire au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables du vieillissement prématuré des cellules souches musculaires. Cette connaissance est essentielle pour développer, à terme, de nouvelles approches pharmacologiques visant à limiter la perte progressive de masse et de force musculaire liée à l’âge. Plus largement, l’étude pourrait mettre en évidence des mécanismes naturels de protection des cellules souches musculaires, en complément de ceux déjà connus et activés par la forskoline. L’identification de tels mécanismes ouvrira la voie à la découverte ou au développement de nouvelles molécules capables de retarder la sénescence des cellules souches et de renforcer la capacité de réparation des muscles.

Procédures

La première moitié des animaux (40 animaux au total, âgés de 2-3 mois) sera traitée une seule fois avec l’une des 4 molécules d’intérêt et le véhicule, via une injection dans la zone abdominale. Des prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés à quatre reprises, réparties sur les 8 heures suivant l’administration des molécules (volume total prélevé de 2 mL). La durée estimée de chaque prélèvement est d’environ 5 minutes par animal. Toutes ces interventions seront effectuées sur des animaux éveillés. La seconde moitié des animaux (40 au total, âgés de 24 mois) sera soumise à une injection dans un muscle d’une patte arrière et d’un œil (dans le muscle que permet le mouvement de l’œil). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 3 minutes par animal au total. Un traitement médicamenteux contre la douleur sera administré par une injection 30 minutes avant de l’injection dans le muscle, puis toutes les 12 h pendant 2 à 3 jours (5 à 6 injections avec la molécule contre la douleur par animal, d’une durée inférieure à une minute chacune). Deux jours plus tard, les animaux — éveillés — seront soumis à des injections quotidiennes dans la zone abdominale (avec le véhicule ou la molécule d’intérêt), chacune durant moins d’une minute. Les animaux seront répartis en deux groupes (20 par groupe) : le premier avec un point de terminaison au jour 6, impliquant 4 injections (jours 2, 3, 4 et 5), et le second avec un point de terminaison au jour 30, impliquant 12 injections (du jour 2 au jour 14 inclus).

Impact sur les animaux

Dans le cas des injections dans la zone abdominale et des prélèvements sanguins répétés, la piqûre de l’aiguille et la contention peuvent provoquer un inconfort passager chez les animaux. Chez les animaux âgés (40 rats, âgés de 24 mois), une sensibilité accrue aux manipulations et aux conditions environnementales est possible, ce qui peut renforcer la gêne ressentie lors des injections. Par ailleurs, les injections dans le muscle (patte arrière et œil) peuvent provoquer une douleur temporaire ainsi qu’un léger malaise ou une gêne passagère dans la mobilité. Ces effets sont généralement transitoires et disparaissent en deux à trois jours, grâce à la mise en œuvre systématique de mesures antidouleur et à un suivi clinique attentif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les étapes qui pouvaient être réalisées sans recours aux animaux ont été effectuées en amont de ce projet. Ainsi, l’efficacité des composés a d’abord été testée in vitro. L’innocuité dans un organisme de mammifère a été validée, étape indispensable pour évaluer la toxicité éventuelle des produits administrés ainsi que celle de leurs métabolites issus de la transformation par les organes, en particulier le foie. Sur cette base, ce projet vise à comparer les similitudes et les différences dans le processus de détérioration des cellules souches musculaires entre le vieillissement naturel et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), en s’appuyant sur les résultats déjà obtenus dans un projet précédent. Cette étude cherche à répondre à une question qui ne peut être abordée qu’in vivo, dans un organisme entier où tous les organes interagissent en permanence : la perte de fonction des cellules souches musculaires observée lors du vieillissement est-elle liée aux mêmes mécanismes que ceux altérés dans un contexte de déficience en dystrophine (comme dans la DMD) ? De plus, la forskoline ou ses analogues conservent-ils leur capacité à stimuler efficacement les cellules souches musculaires et à favoriser la régénération dans un muscle sain mais âgé ?

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, une optimisation préalable du plan expérimental a été réalisée. Les analyses statistiques ont montré qu’un effectif de 8 animaux par groupe était suffisant pour obtenir des résultats fiables dans le cas des animaux jeunes ou adultes. Ce nombre a déjà été validé dans des projets similaires, avec des résultats significatifs. Pour les animaux âgés (plus de 20 mois), un effectif légèrement plus élevé (10 par groupe) est prévu afin de compenser le risque accru de mortalité spontanée. Enfin, les animaux dystrophiques (DMD) ne seront pas inclus dans cette étude, car ils ont déjà été étudiés dans un projet précédent, ce qui permet de réduire davantage le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués hebdomadairement (ou quotidiennement si nécessaire, week-ends et jours fériés inclus) en observant individuellement les animaux. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain, présentant de nombreux aspects anatomiques et physiologiques en commun, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes, ainsi que pour les processus métaboliques. Cette proximité évolutive en fait un modèle très apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis de faire du rat un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent ce type de maladies humaines de manière très fidèle, tout en conservant les atouts propres aux rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’étude des effets à long terme dans un délai raisonnable, en particulier chez les individus âgés.

Ligature de l'artère fémorale, injection d'une toxine dans le muscle de la patte, irradiation des pattes postérieures sous anesthésie : 180 souris subissent ces interventions, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection de cellules souches musculaires humaines, associées ou non à un biomatériau, pour évaluer une thérapie cellulaire de l'ischémie chronique des membres inférieurs. Les atteintes décrites comprennent une perte de poids de 10 %, un poil ébouriffé, une paupière fermée, une posture anormale et une mobilité réduite dans les vingt-quatre heures. Le porteur affirme pourtant qu'aucun signe de souffrance n'est observé après l'irradiation des pattes postérieures, la moelle osseuse étant selon lui parfaitement conservée.

Objectifs

L’ischémie chronique des membres inférieurs est la forme la plus grave de maladie vasculaires périphérique.s Elle est associée à une faiblesse et des douleurs musculaires qui ne peuvent s'expliquer uniquement par une réduction du flux sanguin. Le muscle squelettique adulte possède une forte capacité de régénération grâce à des cellules souches musculaires résidentes. Leur fonction réparatrice est étroitement régulée par leur environnement. Plusieurs études ont montré l’existence d’interactions entre les cellules souches musculaires et les cellules vasculaires environnantes lors de la réparation du muscle squelettique. Les signaux contrôlant ces interactions dans le contexte de l'ischémie des membres inférieurs ne sont pas connus. De même, les mécanismes du remodelage tissulaire et la contribution des cellules souches musculaires au développement des lésions musculaires post-ischémiques restent peu explorés. Nous avons observé qu’une exposition chronique à un faible taux d’oxygène altère la fonction des cellules souches musculaires et par conséquent la régénération musculaire chez la souris. Étant donné l'importance du tissu musculaire comme support biomécanique et biologique de la revascularisation, une altération fonctionnelle des cellules souches musculaires pourrait participer à l'aggravation des lésions musculaires et au défaut de perfusion des membres inférieurs chez les patients atteints d’ischémie des membres inférieurs. Dans ce contexte, nos objectifs sont 1) de caractériser l’altération des propriétés cicatricielles des cellules souches musculaires issues de patients atteints d'ischémie des membres inférieurs in vivo, et 2) d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la restauration d’un tissu musculaire viable par des approches de thérapie cellulaire associant des cellules souches musculaires humaines de muscle sain et des biomatériaux innovants, sur la revascularisation et la régénération des membres ischémiés in vivo.

Bénéfices attendus

Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables des lésions musculaires post-ischémiques chez les patients et offrira une nouvelle approche de thérapie cellulaire innovante pour le traitement de l'ischémie des membres inférieurs, en fournissant un support biomécanique favorable à la revascularisation des muscles ischémiés chez les patients.

Procédures

Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de quatre : 1. Injection d'une toxine dans le muscle de la patte sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Modèle de lésion musculaire par injection d'une toxine dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 3. Modèle de lésion musculaire par ligature de l'artère fémorale (modèle d’ischémie des membres inférieurs) sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min) 4. Injection de cellules souches musculaires humaines associées ou non à un biomatériaux dans le Tibialis Anterior sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min). Les procédures non invasives sur animal anesthésié sont au nombre de une : irradiation des pattes postérieures de la souris sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle de lésion musculaire) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, les signes de souffrance interviennent dans les 24h suivant l’induction des lésions musculaires (que ce soit par un agent chimique ou à la suite de la ligature de l’artère fémorale) mais ne perdurent généralement pas au-delà. De même, aucun signe de souffrance n'est observé chez des animaux qui ont subi une irradiation que des pattes postérieures (la moelle osseuse étant parfaitement conservée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des deux procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à notre question biologique.

Remplacement

Afin de caractériser l’atteinte des capacités régénératrices des cellules souches musculaires (MuSCs) issues de patients atteints d’ischémie critique des membres inférieurs (ICMI) comparativement à des patients contrôles, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment, afin de tester in vitro leur capacité de prolifération, de différenciation et de fusion. Mais pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier et notamment entre les MuSCs et les cellules vasculaires. Notamment, l'utilisation de modèles animaux reste essentielle pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’ICMI et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques innovantes dans le muscle ischémié. Enfin, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes des systèmes de réparation du muscle squelettique humain. Ainsi, le modèle de ligature de l’artère fémorale permet de reproduire les lésions ischémiques retrouvées chez les patients atteints d’ICMI, offrant une pertinence clinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette pathologie.

Réduction

Nous allons réduire le nombre d'animaux grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés et grâce à l’utilisation de la patte opposée non injectée que nous utiliserons comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=10 animaux par groupe expérimental et par temps sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité inter-individuelle dans nos deux modèles chirurgicaux de régénération musculaire.

Raffinement

Les animaux importés qui arriveront de la zone d’élevage à la zone expérimentale sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 5 premières jours suivant la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé et établir la grille de score des points limites. En cas des signes de souffrance déinfis par la grille de score des points limites, des mesures graduées et adaptées (analgésie, mise à mort compassionnelle, ...) seront prises. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie et la réparation post-lésionnelle du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Elle a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées rendant possible la greffe de cellules d’origine humaine et permettant en déplétant les MuSCs de l’hôte de tester l’efficacité d’une thérapie cellulaire à base de MuSCs humaines sur la revascularisation et la réparation musculaire dans un modèle murin d’ICMI. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de limiter ainsi le nombre de cellules humaines à greffer in vivo. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 7 à 10 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules souches musculaires résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous maitrisons les modèles chirurgicaux de lésion musculaire pour lesquels nous n’avons aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous maitrisons les outils permettant les évaluations structurelles et moléculaires du muscle squelettique et le suivi des MuSCs humaines greffées chez la souris.

Améliorer les pratiques d'élevage piscicole et mieux maîtriser la croissance musculaire de la truite : c'est d'abord à cela que sert ce projet, où 125 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La procédure tient en une privation alimentaire d'un an, les poissons n'étant nourris que le lundi et le jeudi, ce qui les laisse jusqu'à cinq jours par semaine dans une sensation de faim que le porteur qualifie de modérée. Sur les 125 truites affamées, dix seulement serviront à produire les résultats, les autres étant là pour maintenir une densité correcte dans les bacs. La piste médicale évoquée, un traitement de l'atrophie musculaire, arrive après les objectifs zootechniques.

Objectifs

La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, la croissance musculaire est continue tout au long de la vie de l’animal mais la formation de nouvelles fibres (hyperplasie) diminue avec l’âge et(ou) le poids, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons précédemment montré que la fonctionnalité de la niche (environnement des cellules souches musculaires) diminuait rapidement pour atteindre un minimum dès 500g. Lors d'une expérience préliminaire nous avons montré que cette diminution était liée au poids et pas à l'âge. Notre objectif est maintenant de déterminer quelles sont les gènes différentiellement exprimés avec le poids qui peuvent expliquer cette diminution.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'identifier les gènes différentiellement exprimés en fonction du poids et pas de l'âge des animaux. Cette question qui existe également chez les mammifères, ne peut être résolue que grâce à l’utilisation de poissons avec une croissance continue et une très forte plasticité de croissance comme la truite. Cette connaissance devrait permettre d’améliorer les pratiques zootechniques afin de maîtriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite. Au-delà de ces aspects agronomiques, une meilleure compréhension des impacts de l’âge et du poids sur les capacités des cellules souches à se différencier, pourrait fournir de nouvelles pistes dans le traitement de certaines pathologies d’atrophie musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une restriction alimentaire afin de ralentir leur croissance pendant 1 an, puis ils seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être nourris uniquement 2 jours par semaine (lundi et jeudi) ce qui engendre une sensation modérée de faim pendant au maximum 5 jours par semaine. Néanmoins ces animaux, de par leur métabolisme, peuvent aisément gérer des périodes sans nourriture.

Devenir

A l'issue de la procédure les animaux seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables du projet et des prélèvements de tissus musculaires seront réalisés pour analyser l'expression de l'ensemble des gènes.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer l’impact de l’âge et du poids sur les capacités myogéniques du muscle, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

Pour soumettre le minimum d’animaux à la restriction alimentaire modérée, nous allons utiliser des bacs de petite taille afin de maintenir une densité optimale avec 125 poissons/bac au maximum. Parmi ces animaux, 10 seront utilisés pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité) et leur manipulation sera réduite au maximum avec un suivi du bien-être à l'aide d'une grille. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Un enrichissement particulier sera mis en place avec des plantes et tubes en plastique pour limiter l'agressivité potentielle.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une des rares espèces qui permet de tester séparément l’effet de l’âge et du poids compte tenu de sa croissance continue et de sa très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques de la niche étaient bien différentes à 10g (~6 et 12 mois) et 1kg (12 mois).

Nourries huit à dix semaines avec un régime qui déclenche myotonie et faiblesse musculaire, injectées seize fois en huit semaines, soumises à une myotoxine qui abîme le muscle et à trente séances de course sur tapis roulant de quarante-cinq minutes, 720 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie passe aussi par une chirurgie de mesure de la force musculaire. Le porteur écrit que les modèles murins existants de la dystrophie myotonique de type 1 ne reproduisent que partiellement les anomalies observées chez les patients, et qualifie dans la même phrase le développement de nouveaux modèles murins d'"étape incontournable". Toutes les souris sont tuées pour prélever deux muscles, parfois trois, ce que le porteur juge "indispensable" pour mener ces recherches.

Objectifs

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire fréquente chez l’adulte, qui provoque des troubles musculaires, cardiaques et neurologiques particulièrement invalidants. Elle est causée par une anomalie génétique qui résulte de la répétition excessive d’une courte séquence d’ADN (répétitions CTG -variant de 50 à plus de 1500 répétitions chez les patients) ce qui provoque diverses dysfonctions cellulaires en perturbant le fonctionnement de certaines protéines essentielles. Ces perturbations affectent de nombreux processus cellulaires, dont certains sont directement liés aux symptômes observés chez les patients. Cependant, d’autres mécanismes moléculaires et cellulaires contribuent probablement à cette pathologie complexe. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la DM1.

Bénéfices attendus

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est la dystrophie musculaire la plus fréquente chez l’adulte, touchant environ 1 personne sur 8 000. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire progressive, une raideur des muscles (myotonie), ainsi que des atteintes cardiaques, respiratoires et neurologiques. Ces symptômes affectent le quotidien des patients et peuvent progressivement réduire leur autonomie. A ce jour, aucune thérapie n’est disponible pour soigner cette maladie génétique. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie en disséquant les processus physiopathologiques musculaires des patients DM1. Ces études sont pré-requises pour le développement de thérapies ciblées.

Procédures

Certains lots d'animaux seront soumis à un régime alimentaire spécial pendant 8 à 10 semaines (animal vigil, prise alimentaire spontanée), d'autres subiront une injection à raison de 2 fois par semaines pendant 8 semaines (animal vigil, 16 injections maximum, 30 secondes). Certains lots d'animaux auront une injection (animal sous anesthésie et analgésie, 1 injection, 3 minutes) et d'autres effectueront un exercice sur tapis de course (animal vigil, 30 fois, 45 minutes). Enfin, certains animaux seront soumis à une intervention chirurgicale pour la mesure de la force musculaire (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire spécial donné aux souris génétiquement modifiées induira un phénotype tel que la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d'activité. Les injections en intrapéritonéales étalées sur 8 semaines pourraient induire une légère douleur au point d’injection et un stress léger lors des manipulations, tout comme la contention nécessaire à l’injection ou les manipulations lors des mesures du poids effectuées deux fois par semaines à partir du début des injections. Les différents traitements sont connus, mais pourraient avoir des effets indésirables dans de rare cas tels que des diarrhées ou une perte de poids. D’autres effets indésirables de notre expérimentation concernent les dommages musculaires dues à l’injection de myotoxine. Ils peuvent être une infection de la peau au site d’injection et une douleur post-dommage du muscle. Les courses sur tapis roulant pourront engendrer un stress et une fatigue transitoire. Les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes invasifs, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés, car nous devons prélever leurs muscles pour les analyser. Ces analyses permettent d’étudier les effets de la maladie sur le muscle et sa capacité à se régénérer. Nous examinons généralement deux muscles par souris (parfois un troisième selon les besoins), ce qui rend l’euthanasie indispensable pour mener ces recherches.

Remplacement

Les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement de nouveaux modèles murins de la DM1 présentent davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine.

Réduction

Pour ce projet, un maximum de 720 animaux sera utilisé. Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est de 15, soit 720 au total dans le cadre de ce projet. La taille des effectifs a été établie grâce à nos études précédentes et à un calcul de puissance. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre l'interprétation fiable des résultats. Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, tous les animaux avec le génotype d'intérêt seront analysés, sans distinction de sexe. Les souris seront analysées in vivo et in situ et les tissus seront prélevés post-mortem et conservés pour des expériences ultérieures éventuelles.

Raffinement

Dans le but de raffiner le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux est amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu (carré de lanière kraft et bâtonnet en bois). Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'hébergement individuel est évité au maximum. Dans le but de réduire la souffrance et le stress des animaux, une habituation aux gestes de contention et d’injection sera faite avant le début des injections. Une attention particulière sera apportée sur la manipulation douce des cages et des animaux lors des contentions et injections successives. Une phase d’acclimatation sera réalisée avant le début des séances d’exercice sur tapis roulant. La durée et la vitesse sont adaptées à chaque souris de façon à ce qu’elle ne soit pas épuisée et puisse réaliser la totalité de la séance. Les injections ainsi que les mesures de force in situ seront réalisées sous anesthésie générale, et l'administration d'un analgésique sera effectuée 30 minutes avant l'anesthésie. Enfin, un suivi du bien-être des animaux et des points limites seront réalisés quotidiennement. En cas d’effet indésirables observés tel que des diarrhées, l’apport d’aliment et une source de nutrition hydratée sera proposé.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous générons et ré-utilisons des modèles murins développés par d'autres chercheurs. Le choix de cette espèce est pertinent car la structure et la fonction du muscle est très proche entre l'humain et la souris. Le projet vise à étudier les défauts liés à la dystrophie myotonique de type 1, pathologie qui se développe chez l’adulte. Chez la souris, la maturation du muscle continue jusqu'à 8 semaines après la naissance. Les souris portant le génotype d'intérêt seront donc utilisées sevrées et adultes âgées de 8 semaines au minimum au début des procédures.

Mesurer si les truites arc-en-ciel retrouvent après la ponte la proportion de filet, la couleur et la texture attendues du produit vendu. 1 000 truites vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour des prélèvements musculaires. Chacune est anesthésiée, sortie de l'eau une minute, marquée par un pit-tag et amputée d'un morceau de nageoire pelvienne d'environ 5 mm2, 500 d'entre elles étant ensuite pêchées à l'épuisette chaque mois, et les femelles prêtes à pondre restant à jeun cinq jours. Le porteur précise que les poissons atteindront 2 à 2,5 kg au point final, ce qui correspond au poids du produit commercialisé sous forme de filets de truite fumés.

Objectifs

Chez la truite, la reproduction affecte fortement la croissance. C’est particulièrement impactant chez la femelle qui produit une quantité d’œufs correspondant à 10 à 15 % de son poids. Au moment de la reproduction, la croissance s’arrête et elle reprend après la ponte. Cela affecte également la qualité des produits, en particulier la proportion de filets du poisson, et la couleur et la texture des filets, qui sont dégradés au moment de la ponte. Ces qualités sont ensuite restaurées. L'objectif du projet est d’évaluer si le changement de rythme de croissance, au moment de la ponte et après la ponte, affecte le nombre et l’activité des cellules souches musculaires (cellules satellites), qui vont permettre la croissance musculaire. Ce projet a également comme objectif d’évaluer la possibilité d’effectuer un sexage par échographie (méthode non invasive) des truites dès le printemps qui précède leur maturation sexuelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur la plasticité des cellules satellites. Nous espérons ainsi montrer que ces cellules sont la clé de la reprise de croissance et de la restauration des qualités après la ponte. Ce type de connaissance peut permettre, dans des travaux futurs, d’identifier des souches de truites ou des pratiques d’élevage favorisant cette aptitude à la récupération post-ponte des poissons. Ce projet sera également l’occasion de tester, en parallèle du sexage moléculaire sur prélèvement de nageoire, un sexage par échographie. Si cette technique non invasive s’avère fiable, elle permettra, à l’avenir, d’éviter de prélever un échantillon biologique, pratique dommageable pour les poissons.

Procédures

En début de procédure, 1000 poissons anesthésiés seront soumis une première fois à une émersion d’une 1 minute maximum, puis à l’insertion d’un pit-tag et à un prélèvement concomitant d’un échantillon de nageoire pelvienne pour sexage moléculaire. Ils seront également soumis à une mesure échographique non invasive dans l’eau qui durera 1 minute maximum. Une seconde mesure échographique sera réalisée 2 mois plus tard, lors d’une biométrie, sur les poissons anesthésiés, après l’obtention des résultats du sexage moléculaire, pour valider la fiabilité de l’identification du sexe par échographie. Puis 500 d’entre eux seront ensuite soumis une fois par mois à une pêche avec une épuisette, une anesthésie, une émersion de 30 sec pour la lecture du numéro de pit-tag, la mesure du poids et de la longueur. Enfin, ils seront également soumis à des transferts pour constituer les lots post ovulation.

Impact sur les animaux

Les poissons seront mis à jeun 72 heures avant les manipulations liées au contrôle de la maturité sexuelle, et les femelles prêtes à pondre seront mises à jeun pendant 5 jours, le temps nécessaire à la réalisation des mesures et des prélèvements avant d’être remises en élevage. La nuisance attendue de ces mises à jeun est d’intensité légère. Une nuisance d’intensité modérée sera générée par un prélèvement invasif de tissu au niveau de la nageoire pelvienne (de l’ordre de 5 mm2) pour réaliser l'analyse génétique du sexe des poissons. Pour l’observation des organes reproducteurs par échographie, le temps nécessaire est estimé à moins d’1 min par poisson. La nuisance attendue est d’intensité légère. Cette observation sera réalisée deux fois : une 1ère fois au moment du prélèvement de nageoire, et une 2nde fois lors de la biométrie où les males seront écartés. Les poissons subiront également un stress d’intensité légère engendré par la pêche, l’anesthésie et un temps d'émersion, au moment du prélèvement de nageoire, d’une durée maximale de 1 minute. La somme des nuisances attendues lors de cette procédure est classée modérée.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de projet afin de réaliser des prélèvements musculaires.

Remplacement

L'objectif du projet est de déterminer l'impact des rythmes de croissance du poisson, au moment de la ponte et après la ponte, sur la plasticité des cellules souches, en lien avec la qualité des produits. La croissance est une fonction physiologique qui impacte l’ensemble des tissus et organes de l’animal. Cette fonction interagit biologiquement avec une autre fonction essentielle qu’est la reproduction. Pour répondre à l’objectif du projet, nous devons réaliser des mesures sur des animaux en croissance, donc vivants.

Réduction

Le lot bisexué de 1000 truites incluses dans ce projet correspond à l’effectif minimum pour répondre à l’objectif fixé. En effet, il nous faut inclure 1000 truites pour disposer des 500 femelles nécessaires à la réalisation du projet. Le projet nécessite d’avoir des truites témoins immatures pour chaque point de mesure post-ponte, soit 4 points de mesure à 0, 1, 2 et 4 mois post-ponte. Le nombre requis, par point de mesure, est de 10 à 15 poissons, soit un nombre de 40 à 60 poissons immatures au total. Pour avoir ce nombre de femelles immatures, il nous faut partir d’un lot de 500 femelles, puisque seulement environ 10% (environ 50 poissons) vont rester immatures à 2 ans, tandis que les autres (450 animaux, 90%) vont maturer sexuellement et produire des œufs. Ce nombre de poissons prévus est donc l’effectif minimal pour les analyses prévues. Il permettra d’évaluer d’une part l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur le nombre et l’activité des cellules satellites, en lien avec la qualité des produits et la taille des fibres musculaires, en comparant les poissons ayant pondus avec les témoins immatures à chaque point de mesure. Il permettra également d’évaluer l’effet du temps post-ponte, pour les poissons ayant pondu et les témoins immatures, en comparant les données obtenues aux différents temps de mesures, à 0, 1, 2, et 4 mois post-ponte.

Raffinement

Les prélèvements d’échantillons de nageoire, ainsi que toutes les manipulations seront réalisés sous anesthésie. Un tissu humide sera utilisé pour manipuler les poissons pour éviter la déperdition de mucus. Un prélèvement d'un petit bout de nageoire sera réalisé pour l'analyse génétique du sexe des poissons. Une surveillance des poissons sera réalisée à l'issue de ce prélèvement et dans les jours qui suivent. Des tables de suivi des soins seront mises en place et utilisées tout au long du projet. L’observation des gonades par échographie sera réalisée sur chaque poisson directement dans le bac d’anesthésie à l’occasion de biométrie.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. C’est de plus une espèce d'intérêt agronomique qui représente 95 % de la production piscicole française et l’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance qui a démontré sa capacité de reprise de croissance après la ponte. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Les poissons feront environ 600 g (16 mois post-fécondation) au début de l’expérimentation. C’est à ce stade qu’ils seront soumis à la procédure expérimentale décrite dans la présente saisine. Ils seront ensuite élevés dans les conditions standard jusqu’à l’atteinte de leur maturité sexuelle, qui débouche sur la ponte de leurs œufs, à 2 ans (1,5 - 2kg), puis lors de la phase de récupération post-ponte jusqu’à 2 ans et 4 mois pour le point final, où les poissons feront 2 - 2,5 kg. Ce poids final correspond au produit commercialisé, en condition de production, sous forme de filets de truite fumés.