Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Évaluation de la capacité du microbiote intestinal de donneurs humains, de différents niveaux d’entraînement physique, à moduler la susceptibilité et la sévérité d’une colite induite par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Vidées de leur flore intestinale par un cocktail d'antibiotiques à large spectre, gavées du microbiote fécal de donneurs humains, puis exposées au dextran sulfate de sodium pour déclencher une colite, 67 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si le microbiote de donneurs plus ou moins entraînés physiquement change la gravité de la colite, la souris servant d'intermédiaire entre une étude clinique menée sur des humains et ses conclusions. Le porteur écrit que "Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement", puis qu'aucun soin pharmacologique n'est possible et que les souris atteignant un point limite seront tuées.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comprenant la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent environ 7 millions de personnes dans le monde. Elles se caractérisent par des lésions digestives discontinues pour la première et une inflammation colique continue pour la seconde. Leur origine reste partiellement inconnue, mais elles résultent d’une réponse inflammatoire inappropriée chez des individus génétiquement prédisposés, influencée par des facteurs environnementaux, une dysbiose du microbiote intestinal et une altération de la barrière intestinale. L’activité physique (AP) est aujourd’hui reconnue comme un levier thérapeutique, notamment dans la prévention des maladies chroniques, et influence également le microbiote intestinal. Plusieurs études, dont une de notre laboratoire, ont montré un lien entre niveau d’entraînement et signatures microbiennes. Une AP modérée à élevée est associée à une plus grande diversité microbienne et à une production accrue de métabolites bénéfiques, tandis que la sédentarité ou un entraînement très intensif peuvent altérer ces fonctions. Cependant, le rôle exact de l’AP dans le développement et l’évolution des MICI reste encore mal compris. Dans ce cadre, nous menons une étude clinique visant à caractériser le microbiote intestinal en lien avec la capacité cardiovasculaire et le profil métabolique à l’exercice chez des individus de niveaux d’activité variés. En parallèle, une étude préclinique repose sur la transplantation de microbiote fécal de ces participants chez des souris, suivie de l’induction d’une colite chimique. Afin de de permettre l’étude du rôle causal du microbiote intestinal dans la susceptibilité aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, les souris recevront dans un premier temps un cocktail d’antibiotiques à large spectre. Cette étape permet une déplétion importante du microbiote résident, réduisant la variabilité interindividuelle et créant une niche écologique disponible pour une recolonisation contrôlée. Puis, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d’établir des microbiotes expérimentaux différenciés. Enfin, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d'établir des microbiotes expérimentaux différenciés.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation existe entre une signature bactérienne et fonctionnelle retrouvée chez les populations de différents niveaux d’entraînement et la susceptibilité de la réponse à une colite induite. Sur le plan de la santé, cette étude permettra d’identifier des profils ayant des signatures bactériennes et fonctionnelles pour 1) mieux comprendre les mécanismes d’apparition ou non des MICI et 2) développer des stratégies de prévention et de prise en charge personnalisées de ces maladies, fondées sur la modulation du microbiote intestinal.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute), un prelèvement sanguin de 100 μL et un prelèvement terminal intra-cardiaque avant la mise à mort. Les animaux subiront également le gavage oral pour la transplantation du microbiote fécale (FMT) des sujets humains et l’induction de la colite par le Dextran Sodium Sulfate.
Impact sur les animaux
Le traitement par antibiotiques à large spectre est administré à des doses extrapolées de celles utilisées en clinique humaine et ajustées au modèle animal. Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement. Ils comprennent, pour le traitement antibiotique, une déplétion du microbiote intestinal pouvant entraîner une modification temporaire du transit et une diminution de la fermentation bactérienne. Le gavage de suspension de microbiote peut induire un stress aigu transitoire lié à la manipulation ainsi qu’une possible fausse route. Enfin, l’induction de la colite par DSS entraîne des effets dose-dépendants incluant une perte de poids, une modification du transit intestinal (diarrhée), et une inflammation colique transitoire associée à une altération de la barrière épithéliale Les procédures de gavage peuvent engendrer un stress transitoire chez les animaux. Le traitement au Dextran Sodium Sulfate (DSS) peut induire des troubles gastro-intestinaux tels qu’une diarrhée et une inflammation intestinale transitoire, pouvant entraîner une perte de poids et une diminution de la prise alimentaire. Ces effets sont attendus, surveillés et limités dans le temps.
Devenir
A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses histologiques et moléculaires sur ces tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions dynamiques entre le microbiote intestinal de différentes signatures fonctionnelles et bactériennes et la réponse à la colite induite sur la physiogie de la barrière intestinale de l’hôte. Ces phénomènes impliquent des réponses systémiques, des interactions multi-organes et des adaptations physiologiques complexes. Il n’existe, à ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire fidèlement ces interactions intégrées et mimer la colite. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de permettre la mise en évidence d’une différence de sévérité de la colite entre les groupes expérimentaux, évaluée à partir de critères cliniques incluant la perte de poids, la consistance des selles et la présence de saignements. L’étude comprend cinq groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, le donneur de microbiote est considéré comme l’unité de réplication biologique. Plusieurs souris recevront le microbiote d’un même donneur, ce qui permet de prendre en compte la variabilité technique liée à la transplantation tout en réduisant le nombre total d’animaux. Par ailleurs, une procédure pilote sera réalisée sur 9 animaux (3 par groupe) afin d’évaluer la faisabilité du modèle et d’ajuster les conditions expérimentales. Cette étape permettra notamment de suivre la tolérance, la cinétique de perte de poids et la sévérité clinique, sans objectif de démonstration statistique. Elle vise à réduire le risque d’échec de la procédure principale et à éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 2 animaux par cage. Des jouets seront introduits afin de minimiser le stress induit par les différents traitements. Le raffinement est complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Un questionnaire pour mesurer le niveau d’inconfort des rongeurs est mis à disposition dans les locaux. En cas de souffrance ou inconfort constaté, toutes les mesures nécessaires pour réduire la souffrance seront mises en place. Compte tenu de la pathologie développée dans ce projet et de l’impossibilité de recourir à des soins pharmacologiques, les animaux présentant un inconfort lié à au moins l’un des points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle approprié pour l’étude du microbiote et de la barrière intestinale en raison : •De sa facilité de manipulation •De son homogénéité génétique Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre ainsi qu’une transplantation du microbiote fécal du l’Homme vers l’animal chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation. Pour étudier l'effet de la flore intestinale sur la susceptibilité de la réponse à la colite induite, il faut disposer d'animaux adultes dont le développement de la barrière intestinale et du système immunitaire est stabilisé.
Gestion du ph?notype dommageable d?inflammation chronique de l?intestin lors de l’?levage de lign?es murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Produire des souris qui développent avec l'âge une inflammation chronique de l'intestin, telle est la finalité de cet élevage, qui porte sur 2 560 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La seule intervention décrite est un poinçonnage de l'oreille sur souris vigile, en moins de trente secondes, pour génotyper une partie des reproductrices. La souffrance vient de la lignée elle-même : le porteur annonce de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante en cas de forme sévère, avec une mobilité et un pelage altérés. Le devenir déclaré compte les 2 560 souris comme mises à mort, alors que le résumé indique qu'une partie est expédiée vers un autre établissement utilisateur avant l'expression du "phénotype dommageable", celles gardées pour la reproduction étant tuées avant 24 semaines.
Objectifs
Ce projet d?crit une proc?dure de l'?levage avec la prise en charge des animaux d?une lign?e de souris d?veloppant progressivement une inflammation chronique de l?intestin (colite). Ces souris sont un mod?le des Maladies Inflammatoires Chroniques de l?Intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn et la colite h?morragique qui sont caus?es par un m?lange de facteurs g?n?tiques, environnementaux et li?s aux microbes pr?sents dans l?intestin. Normalement, le corps produit des substances qui aident ? limiter l?inflammation dans l?intestin. Dans notre mod?le de souris, cette mol?cule est absente, ce qui entra?ne une r?action excessive du syst?me immunitaire et une inflammation chronique du c?lon. De plus, des ?l?ments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques peuvent aggraver cette inflammation en modifiant les microbes intestinaux. L?objectif de cet ?levage est de produire des animaux reproduisant la maladie observ?e chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilis?s dans des projets de recherche afin d'?tudier les maladies inflammatoires de l?intestin et, ? terme, aider ? la recherche sur ces maladies chez l?homme.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre ? l'?quipe de recherche et ? leurs partenaires d?avoir les souris n?cessaires pour mener leurs ?tudes sur les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI). A long terme, ces souris aideront les chercheurs ? : mieux comprendre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles fa?ons de traiter ces maladies, tester de nouveaux m?dicaments anti-inflammatoires et d??valuer leur efficacit? par rapport aux traitements d?j? disponibles pour les patients atteints de MICI.
Procédures
Afin de r?aliser le g?notypage, un poin?onnage de l?oreille sera effectu? apr?s l??ge de 14 jours. Cette m?thode consiste ? pr?lever sur animaux vigiles un petit ?chantillon de tissu sur la p?riph?rie du pavillon de l?oreille o? le tissu est le plus mince, ? l?aide d?un poin?on. Cette intervention n?est r?alis?e qu?une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilis?s pour les croisements seront g?notyp?s.
Impact sur les animaux
Une partie des souris dans ce projet peuvent commencer ? d?velopper progressivement avec l??ge une inflammation de l?intestin. En cas de forme s?v?re, cela peut entra?ner de fortes diarrh?es, des saignements rectaux, une d?shydratation et une perte de poids importante. La mobilit? ainsi que l?apparence du pelage peuvent ?tre alt?r?es. Les souris reproductrices pourraient ressentir une l?g?re nuisance due au pr?l?vement effectu? pour le g?notypage (douleur l?g?re de courte dur?e).
Devenir
Une partie des animaux sera exp?di?e en d?but ou avant l?expression du ph?notype dommageable et utilis?e dans des projets de l??quipe de recherche dans un autre ?tablissement utilisateur. Une autre partie des animaux sera utilis?e pour l??levage dans notre ?tablissement. Les animaux utilis?s pour l??levage seront mis ? mort avant 24 semaines, pour limiter l??volution du ph?notype dommageable avec l??ge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d??valuation du bien-?tre animal seront mis ? mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entiers est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI) sont tr?s complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le syst?me immunitaire, les microbes intestinaux, la g?n?tique et l?environnement. Ces maladies affectent non seulement l?intestin mais aussi d?autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l?environnement et les microbes interagissent avec l?organisme, les souris sont le mod?le le plus adapt?. ? ce jour, il est impossible de recr?er ces interactions complexes en laboratoire par l'utilisation de m?thodes alternatives (par exemple, mod?les cellulaires), d?o? la n?cessit? d??tudier ces maladies sur des animaux vivants.
Réduction
Un nombre total de 2560 animaux au ph?notype dommageable est n?cessaire et comprend les animaux pour l??levage et les animaux n?cessaires pour l?exp?rimentation pour les projets scientifiques associ?s. La production des animaux sera planifi?e et suivie par l?exp?rimentateur et les zootechniciens de l??tablissement utilisateur afin de limiter le nombre d?animaux g?n?r?s au strict n?cessaire pour les besoins exp?rimentaux et l??levage. Le nombre de reproducteurs et la dur?e d?accouplements seront d?finies en amont de la mise en place des croisements. Ces param?tres seront d?finis en fonction des objectifs et des diff?rentes caract?ristiques connues des lign?es (taille de port?es, viabilit?, ph?notype, etc.). L'?levage sera suivi via le fichier de l'?levage. En fin de projet exp?rimental, l??levage sera arr?t? et le mod?le restera disponible cryoarchiv? dans notre ?tablissement.
Raffinement
Les conditions de l?h?bergement, le seuil de l??ge d?utilisation, les crit?res du suivi et les points limites ont ?t? d?finis afin de minimiser les nuisances. Tous les animaux mut?s de mani?re homozygote pour la modification g?n?tique et susceptibles de d?velopper le ph?notype dommageable ? partir de 5-6 semaines seront suivis ? partir de 3-4 semaines (sevrage) et ce jusqu'? leur envoi avant 6 semaines vers l??tablissement o? sera r?alis?e l?exp?rimentation (ou leur mise ? mort) : une ?valuation du bien-?tre animal sera r?alis?e en prenant en compte la pr?sence de diarrh?e, la pr?sence de saignements rectaux, l?apparence et la mobilit? de l?animal. En fonction de l??tat de l?animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la v?t?rinaire et/ou la SBEA (disponibilit? de la nourriture directement dans la cage, mise ? disposition d?une solution de r?hydratation g?lifi?e, augmentation de la fr?quence du suivi avec la pes?e d?animaux). Les points limites pr?coces et sp?cifiques pour les signes cliniques de l?inflammation de l?intestin ont ?t? d?finis. Si, malgr? le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l?animal sera imm?diatement mis ? mort. Dans le cas o? les animaux homozygotes ne sont pas transf?r?s pour l?exp?rimentation, ces derniers seront utilis?s pour l??levage et mis ? mort avant 24 semaines (pour limiter les nuisances li?es ? la progression de la maladie avec l??ge).
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilis?es pour ?tudier les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l?alimentation, l?environnement, les microbes intestinaux et l?intestin lui-m?me. Dans ce projet, nous utilisons une lign?e de souris qui ne produit pas une prot?ine cl? entra?nant ainsi une inflammation intestinale ressemblant ? une colite h?morragique chez l?humain. Ce mod?le g?n?tique de la maladie n?existe que chez la souris. Les souris seront utilis?es pour les croisements d?s l??ge de 7-8 semaines (maturit? sexuelle) et ce jusqu?? 24 semaines, pour limiter l?expression du ph?notype dommageable qui progresse avec l??ge. Le ph?notype dommageable de colite est susceptible d'appara?tre ? partir de l'?ge de 5-6 semaines, mais dans l??levage de l?EU du chercheur seulement 5% d?animaux sont concern?s ? cet ?ge. Les animaux envoy?s pour exp?rimentation auront ainsi un ?ge de 4-6 semaines pour limiter et potentiellement ?viter l?expression du ph?notype dommageable avant l?envoi.
Étude de l’effet de l’insufflation intra-abdominale de dioxyde de carbone (CO₂) sur l’inflammation générale et cérébrale dans un modèle d’entérocolite (inflammation sévère de l’intestin) chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Nourris par une sonde introduite par la bouche jusqu'à l'estomac, matin et soir du 3e au 7e jour de vie, avec un lait contenant une substance qui provoque une inflammation intestinale, 432 souriceaux subissent aussi trois passages quotidiens de dix minutes dans une chambre où l'oxygène est abaissé de 21 à 5 %. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, avec douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l'état général et décès parmi les effets attendus. Certains reçoivent au 6e jour une insufflation de dioxyde de carbone dans l'abdomen, que le porteur décrit comme réalisée sous anesthésie générale afin qu'ils ne ressentent aucune douleur, tout en signalant une perforation d'organe suivie du décès et une perforation possible de l'œsophage lors du passage de la sonde. Des tests comportementaux sont annoncés au 30e et au 45e jour de vie, sans que le document précise lesquels. Tous sont tués, à 8 jours pour prélever intestins, cerveaux, sang, foie et rate, à 50 jours pour prélever les cerveaux.
Objectifs
L’entérocolite ulcéro-nécrosante (ECUN) est une maladie grave de l’intestin du nouveau-né prématuré, correspondant à une inflammation sévère pouvant abîmer voire détruire une partie de l’intestin. Elle est responsable d’un état inflammatoire général prolongé avec un risque élevé de complications et de décès (15–30 %). Elle peut également avoir des effets sur le développement cérébral. En effet, elle est associée à une augmentation de la survenue de troubles du neurodéveloppement (TND) sans que l’on ne comprenne encore pourquoi. Les troubles du neurodéveloppement regroupent plusieurs difficultés liées au développement du cerveau pendant l’enfance et peuvent inclure par exemple des difficultés pour apprendre, se concentrer, communiquer ou interagir avec les autres. L’hypothèse principale pour expliquer ces séquelles neurologiques est que l’inflammation due à l’entérocolite perturberait le développement du cerveau chez ces nouveau-nés très fragiles. Le traitement de l’ECUN repose initialement sur les antibiotiques et la mise au repos de l’intestin (mise à jeûn). Si l’intestin se perfore ou si l’état du nouveau-né s’aggrave malgré ce traitement, une opération devient nécessaire. La chirurgie se fait classiquement par laparotomie, c’est-à-dire par une large ouverture abdominale. Une technique plus récente et moins invasive peut être utilisée. Il s’agit de la coelioscopie néonatale. Il s’agit d’une technique chirurgicale peu invasive. Elle consiste à faire de petites incisions dans le ventre pour introduire une caméra et des instruments. Le ventre est légèrement gonflé avec un gaz (le dioxyde de carbone) afin de créer de l’espace et permettre de voir et d’explorer les organes. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les études ont montré une diminution significative de l’inflammation chez les nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie. L’hypothèse est l’effet anti-inflammatoire du CO2 insufflé lors de la cœlioscopie et son interaction directe avec l'intestin. Notre projet de recherche a pour objectif d’étudier l’effet anti inflammatoire et notamment neuroprotecteur de l’insufflation intra-abdominale de CO2 sur un modèle d’entérocolite chez la souris. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des entérocolites des nouveau-nés prématurés, et sur leur pronostic.
Bénéfices attendus
Un enfant né prématuré sur trois aura des TND. La survenue de ces troubles est plus fréquente en cas d’ECUN associée. En effet, plus de 50% des nouveau-nés prématurés avec ECUN auront un trouble du neurodéveloppement. Les effets de l’entérocolite sur le cerveau des nouveau-nés n’ont pas encore été élucidés. Avec ce projet, nous cherchons à comprendre d’une part l’association entre TND et entérocolite en étudiant l’impact de l’inflammation sur le développement du cerveau des nouveau-nés. Nous cherchons à comprendre d’autre part la baisse de l’inflammation et la meilleure évolution des nouveau-nés ayant bénéficié d’une coelioscopie, qui ont été constaté chez les patients. Seulement 8 % des chirurgiens pédiatres dans le monde utilisent la coelioscopie dans la prise en charge des ECUN. Les résultats de nos expériences précliniques, s’ils s’avèrent positifs, constitueraient un pré requis indispensable à la généralisation de l’exploration coelioscopique chez les nouveau-nés atteints d’ECUN. L’intégralité de ce travail aura une application directe sur le protocole de prise en charge chirurgicale des ECUN, et sur leur pronostic à court et long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’intervention : - Une alimentation par une fine sonde orogastrique (fin tube introduit par la bouche, jusqu'à l'estomac) avec une solution lactée matin et soir du 3ème au 7ème jour de vie. La composition de la solution lactée diffère entre les groupes. Certains souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire. D’autres souriceaux recevront du lait à usage vétérinaire contenant une substance qui provoque de l’inflammation intestinale (Dextran Sodium Sulfate). Cela permet de reproduire, chez la souris, une entérocolite similaire à celle observée chez les nouveau-nés prématurés. - Un maintien pendant 10 minutes trois fois par jour du 3ème au 7ème jour de vie dans une chambre avec une concentration en oxygène abaissée de 21 à 5%. - Au 6ème jour de vie, certains souriceaux auront une insufflation de CO2 dans l’abdomen, c’est à dire qu’ils recevront une faible quantité de gaz dans la cavité abdominale à l’aide d’un très fin tube. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent aucune douleur. Le gaz sera administré pendant 10 minutes avec une pression très faible et contrôlée. Chaque souris concernée recevra cette intervention une seule fois. - Une IRM cérébrale sera réalisée sur chaque souris autour du 40ème jour de vie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale pour obtenir une immobilité parfaite.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent tout d’abord subir un stress temporaire lors : des manipulations, de la séparation ponctuelle avec la mère chez les souriceaux, des tests comportementaux, et du transport des animaux vers les salles d’expérimentation. Ils peuvent ensuite être sujets aux symptômes d’entérocolite : douleur abdominale, diarrhée, sang dans les selles, altération de l’état général, décès. L’administration du lait par voie orogastrique (sonde introduite par la bouche jusqu’à l’estomac) présente également des risques : l’introduction de cette sonde peut entrainer un stress et un inconfort liés au passage de la sonde et à la contention. Dans de rares cas des complications peuvent survenir, comme une fausse route ou une perforation de l’œsophage. De plus, bien que cela reste exceptionnel, une perforation d’organe suivi du décès peut survenir lors de l’introduction du petit tube d’insufflation de CO2. Pour finir, ils présentent un risque de décès provoqué par les produits anesthésiants lors des procédures réalisées sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires post-mortem : - A l’âge de 8 jours : prélèvement des intestins pour caractériser l’entérocolite, des cerveaux pour analyse de l’architecture cérébrale et des conséquences cérébrales de l’inflammation, du sang, du foie et de la rate pour caractériser l’inflammation. - A l'âge de 50 jours : prélèvement des cerveaux pour caractériser l’architecture cérébrale.
Remplacement
Les effets de cette maladie sur le cerveau et sur le système de défense du corps ne peuvent pas être étudiés correctement sans utiliser un animal entier. Il n’est pas possible de tester cette approche uniquement sur des cellules en laboratoire ou à l’aide d’un logiciel, car ces méthodes ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. La souris est un animal souvent utilisé en recherche médicale pour les modèles d'entérocolite. Elle permet d’étudier cette maladie de manière fiable, car son organisme réagit d’une façon comparable et adaptée à ce type d’étude.
Réduction
Le modèle de maladie utilisé a été mis au point pour provoquer des lésions de l’intestin tout en limitant la gravité de l’état des jeunes souris, permettant de limiter la souffrance et de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Une surveillance au minimum quotidienne est mise en place afin d’apprécier l’état des souriceaux. Plusieurs examens sont réalisés sur les mêmes animaux au cours de l’étude, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations tout en limitant le nombre total de souris nécessaires. Le nombre de souris est réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats fiables.
Raffinement
Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé et autorisé. Cela concerne notamment l’alimentation des jeunes souris à l’aide de la sonde, l’anesthésie, les insufflations dans l’abdomen. Les animaux sont hébergées dans des conditions adaptées à leur bien-être : alternance jour/nuit régulière, température stable, eau et nourriture à volonté. Les cages contiennent du papier doux pour leur permettre de construire un nid. Les mères et leurs petits ne sont pas dérangés avant le troisième jour de vie. Lors des manipulations, la séparation est la plus courte possible et les petits sont maintenus au chaud avant d’être replacés auprès de leur mère. Pendant la période où la maladie est provoquée, les animaux sont observés deux fois par jour (poids, comportement, état général). Des règles précises sont suivies pour décider si un animal doit être euthanasié plus tôt afin d’éviter toute souffrance inutile. L’administration du gaz dans l'abdomen est réalisée sous anesthésie générale afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Le matériel utilisé permet de délivrer une pression très faible, adaptée à la taille des jeunes souris. Les animaux sont surveillés en permanence pendant et après l’anesthésie. Les tests de comportement sont réalisés dans une salle calme. Les animaux sont d’abord habitués à l’environnement et sont manipulés avec douceur.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux d’ECUN, le rongeur est largement utilisé dans la littérature. Plusieurs études sur les conséquences de l’insufflation du CO2 chez la souris ont été publiées précédemment. L’insufflation de CO2 intra-abdominale chez la souris est facilement réalisable, reproductible et ne nécessite qu’un seul point de ponction. Notre modèle d’entérocolite est induit chez des souriceaux du 3ème au 7ème jour de vie car ils ont à cet âge, un développement cérébral comparable à celui d’un nouveau-né prématuré. Les tests comportementaux sont réalisés pendant la période de l’acquisition motrice puis plus tard au 30ème et 45ème jours de vie correspondant aux périodes d’adolescence et de jeune adulte, à la recherche de troubles du neurodéveloppement.
Traitements innovants des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 2400
7 720 souris et 2 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est provoquée chez chaque animal, avec perte de poids puis diarrhées et baisse d'activité, avant d'appliquer une lumière UV dans le colon, d'injecter des leurres apoptotiques synthétiques ou d'administrer des nanovecteurs. Aucun analgésique ne leur est donné, le porteur indiquant que les anti-inflammatoires modifieraient la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire étudiés. Les animaux dont le score clinique passe en sévère sortent de l'étude et sont mis à mort, une quantité importante de sang étant prélevée sur les autres au moment de leur propre mise à mort.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent un nombre croissant de patients en France et dans le monde. Elles ont un impact important sur la qualité de vie tant sur le plan physique que psychologique et social. L’apparition des MICI chez l’Homme est très souvent due à une dérégulation du système immunitaire. Lors d’une agression pathogène physique ou chimique, une inflammation va se créer au niveau de l’intestin. Dans certain cas, cette inflammation va persister et ainsi provoquer une inflammation chronique. L'objectif de ce projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ayant déjà montré un intérêt après évaluation dans des modèles simplifiés in vitro. Une première approche consiste à appliquer une lumière UV in situ au niveau de la lésion du colon. Cette exposition va permettre d’induire une mort cellulaire programmée, nommée apoptose, de certaines cellules sur le site de l’inflammation et ainsi de ré-engager la résolution de l’inflammation ainsi que la réparation tissulaire. Des premiers résultats encourageants montrent une amélioration du score clinique des animaux après traitement. Il est donc essentiel de continuer ces travaux pour comprendre afin d’améliorer, et rendre cette thérapie accessible aux patients. La deuxième approche consiste à appliquer des particules imitant les cellules en mort programmée pour ré-engager la résolution et la réparation tissulaire. Pour cela différentes formulations des leurres apoptotiques synthétiques devront être testées afin de se rapprocher au mieux de la cellule apoptotique physiologique. La troisième partie est orientée sur la formulation de substances actives pour en améliorer leur efficacité et leur tolérance. Pour cela, différents nanovecteurs seront développées afin de renforcer l’activité de l’actif thérapeutique par le biais d’un meilleur ciblage de la lésion inflammatoire permettant ainsi de pouvoir administrer des médicaments.
Bénéfices attendus
Les MICI touchent un nombre croissant de patient en France (+ de 300000 patients) et dans le monde. Aujourd’hui des traitements symptomatiques efficaces existent : anti-inflammatoires, corticoïdes, biothérapies. Malgré tout cet arsenal, 50% des patients doivent subir une chirurgie lourde à 10 ans. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour palier à ces pathologies. Dans ce projet, nous développons des thérapies qui visent, les symptômes de la maladie tout en en réduisant les effets secondaires, mais aussi les causes en venant moduler et rééduquer le système immunitaire. A échéance courte, ce projet permettra de proposer de nouvelles formes médicamenteuses spécifiques de ces maladies et apportera des connaissances cruciales quant aux mécanismes cellulaires et immunologiques responsables de la pathologie. Cela permettra de promouvoir de nouvelles stratégies thérapeutiques accessibles aux patients à plus long terme. De plus, ces traitements, que nous évaluons dans ces modèles de MICI, ne sont pas spécifiques de ces pathologies mais pourront ensuite être testés et adaptés à une grande majorité des maladies inflammatoires chroniques tels que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque…
Procédures
Les traitements seront administrés sous anesthésie. Pharmacocinétique : les prélèvements de sang se feront au niveau de la veine caudale grâce à un catheter.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les animaux vont développer différentes formes des maladies chroniques de l’intestin. Ces pathologies sont caractérisées et évaluées sur différents critères relevant des nuisances causées aux animaux. Un des premiers signes est la perte de poids. Ensuite apparaissent des diarrhées. L’activité des animaux va alors être impactée. Ces nuisances apparaissent généralement quelques jours après le début de l’induction.
Devenir
Une quantité impotante de sang sera prélévé au moment de la mise à mort et différents organes seront prélevés pour évaluer l'efficacité des traitements. Des analyses de biodistribution seront réalisées.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans les pathologies inflammatoires chroniques. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire ou celle des barrières épithéliales avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de détecter une différence de 20-30% sur les scores clinique, histologique et marquers de l'inflammation avec une puissance statistique de 80% et un risque alpha de 0,05 soit des des groupes de 6-10 individus pour les souris et 5-8 pour les rats. Ces paramètres ont été consolidés par le passé grâce à nos expériences réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages stériles pour les études impliquant une action directe sur le système immunitaire afin de ne pas entrainer de biais sur les expériences. Pour les études concernant la formulation d’actifs thérapeutiques, elles seront réalisées dans des cages non stériles. L’intensité de la pathologie est contrôlée lors de l’induction afin de ne pas induire une pathologie trop intense avec une trop grande souffrance des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. En cas de score estimé sévère sur l’état général de l’évaluation clinique, les animaux seront exclus de l’étude et mis à mort car l’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas envisageable en raison de la pathologie inflammatoire induite et des modifications induites sur la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire par les analgésiques. En cas de réduction d’activité, les animaux recevront de la nourriture et/ou de l’eau sous une forme plus accessible dans la cage.
Choix des espèces
La souris ainsi que le rat présentent un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Souris agées de 3 à 8 semaines seront utilisées Rats agés de 5-6 semaines
Nouvelle thérapie anti-inflammatoire dans un modèle murin de colite aigüe et chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Des injections provoquent une colite aiguë ou chronique chez 1 200 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec douleurs abdominales, perte de poids et changements de comportement. Une nouvelle molécule anti-inflammatoire leur est ensuite administrée, seule ou combinée à d'autres, l'étude durant d'une à quatre semaines selon le protocole. Toutes sont tuées pour analyser la réponse de leur système immunitaire, ce que la rubrique consacrée au devenir ramène à "certains animaux" mis à mort "de manière réglementaire". Le RNT ne nomme ni le produit qui déclenche la colite, ni les tests de suivi, ni les seuils des scores cliniques annoncés, et indique que l'anesthésie ne sera utilisée "que si la situation l'exige".
Objectifs
Certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle clé dans l’inflammation, qu’elle soit aiguë ou chronique. Lors de maladies inflammatoires, un déséquilibre entre différents types de cellules immunitaires contribue à entretenir et aggraver l’inflammation. Nous cherchons donc à tester de nouvelles molécules capables d’agir spécifiquement sur ces cellules afin de rétablir l’équilibre. En laboratoire, ces molécules ont déjà montré qu’elles réduisent les substances responsables de l’inflammation et augmentent celles qui la freinent. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité dans différents modèles de maladies inflammatoires et d’estimer leur potentiel comme futurs traitements
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester une nouvelle molécule qui agit sur un mécanisme précis du système immunitaire afin de réduire l’inflammation. Son efficacité sera comparée à celle des traitements déjà existants pour vérifier son intérêt. L’étude permettra aussi de mieux comprendre comment cette molécule agit sur le fonctionnement des cellules immunitaires. Enfin, nous évaluerons des traitements combinant plusieurs cibles du système immunitaire. Ces approches pourraient être plus efficaces que les traitements actuels ou que l’utilisation d’une seule molécule.
Procédures
Les animaux recevront des injections pour provoquer la maladie étudiée et pour administrer les traitements. Des prises de sang pourront également être réalisées si nécessaire, sous anesthésie afin de limiter tout inconfort. Chaque intervention sera courte et l’ensemble de l’étude se déroulera sur une période allant d’une à quatre semaines, selon le protocole prévu.
Impact sur les animaux
La colite, qu’elle soit aiguë ou chronique, peut provoquer des douleurs abdominales, une perte de poids et des changements de comportement chez les animaux. Afin de suivre leur état de santé et de limiter ces effets, des évaluations régulières basées sur des scores cliniques et pathologiques seront mises en place. Ces outils permettront de surveiller au mieux l’évolution de la maladie et le bien‑être des animaux.
Devenir
Après les injections, les animaux seront replacés dans leur cage. À la fin de certaines étapes de l’étude, certains animaux seront mis à mort de manière réglementaire afin d’analyser la réponse du système immunitaire et mieux comprendre les effets des traitements.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode capable de reproduire entièrement le fonctionnement du système immunitaire en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour cette étude. Des essais réalisés auparavant en laboratoire sur des cellules ont montré que la molécule testée avait un effet biologique. Ces résultats ont permis de mieux préparer l’étude chez l’animal et de choisir les éléments à observer pour évaluer son efficacité.
Réduction
Tous les animaux prévus ne seront pas forcément utilisés. Des études supplémentaires ne seront réalisées que si un effet du traitement est observé. Dans ce cas, des analyses seront menées pour mieux comprendre comment le traitement agit, en examinant certains animaux à différents moments de l’évolution de la maladie, avant l’apparition de signes sévères. Afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux, le nombre a été fixé à 10 animaux par groupe, ce qui permet une analyse statistique pertinente avec un nombre réduit d’animaux.
Raffinement
L’objectif principal est de comparer le niveau d’inflammation observé entre différents groupes de souris afin d’identifier des effets clairs et fiables des traitements testés. Une attention particulière sera portée au bien‑être des animaux : leur état de santé sera surveillé régulièrement et des mesures seront prises pour limiter autant que possible la douleur et la souffrance. Si l’état d’un animal se dégrade au‑delà d’un certain seuil, il sera retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, un rythme jour/nuit équilibré et un environnement enrichi pour réduire le stress. Le nombre d’animaux par cage sera limité afin d’éviter la surpopulation, et des ajustements seront faits en cas de comportements agressifs. Les procédures ont été conçues pour minimiser le stress et la douleur tout en permettant une évaluation scientifique fiable. Des traitements contre la douleur seront administrés lorsque nécessaire, et l’anesthésie ne sera utilisée que si la situation l’exige.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche, notamment pour les études fondamentales et précliniques, car elle est bien connue et dispose de nombreux outils permettant d’analyser le fonctionnement du système immunitaire. Les modèles d’inflammation développés chez la souris reproduisent de manière satisfaisante ce qui est observé chez l’être humain. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines. À cet âge, les réponses inflammatoires sont plus homogènes et reproductibles que chez des animaux plus jeunes ou plus âgés, dont le système immunitaire fonctionne différemment. Cela permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables entre les groupes étudiés.
Nouvelles thérapies anti-inflammatoires et pro-résolutives dans des modèles d’inflammation aigue et chronique de l’intestin chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une colite est provoquée chez 832 souris par un agent chimique irritant administré dans l'eau de boisson ou par voie intra-rectale, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré. Le RNT décrit pourtant une perte de poids supérieure à 10 pour cent, des diarrhées, une prostration et des signes de douleur au plus fort de l'inflammation. Toutes les souris seront tuées par dislocation cervicale pour prélèvements, certaines plus tôt si les points limites sont atteints. Le projet teste des molécules censées activer la résolution de l'inflammation, un essai chez l'humain restant une perspective lointaine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation, tout en limitant l’inflammation persistante et la fibrose, dans des pathologies caractérisées par un déficit de ces mécanismes. Depuis quelques années, il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), sont liées à un échec de la résolution de l’inflammation. Les traitements actuels (corticoïdes, immunomodulateurs) agissent principalement en bloquant l’initiation de l’inflammation, ce qui entraîne des effets secondaires importants. De plus, près de 60 % des patients présentent un échappement primaire ou secondaire à ces traitements, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients résistants ou en échec. Chez les patients atteints de MICI l’absence de résolution de l’inflammation en dépit des traitements existant est la première cause d’échec thérapeutique, ce qui entraine une persistance de l’inflammation, un développement de fibrose et à des symptômes invalidants comme la douleur, les diarrhées chroniques ou un impact sur la qualité de vie et la santé mentale. Notre projet vise à tester, chez la souris, des molécules innovantes capables d’activer ces voies de résolution lorsque celles-ci sont défaillantes, tout en réduisant l’inflammation chronique et en limitant la fibrose, qui constitue une complication majeure des MICI et d’autres pathologies inflammatoires. Les molécules sélectionnées auront été validées in vitro au préalable. Nous comparerons ensuite nos traitements à des références établies dans chaque modèle, où l’efficacité sera mesurée par une accélération de la résolution de l’inflammation, une réduction des lésions tissulaires et une diminution des marqueurs de fibrose, par rapport à un groupe contrôle. 832 animaux pourront être utilisés, ce qui garantit une puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux conformément aux principes des 3R.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont actuellement traitées principalement par trois types de médicaments : les corticoïdes, les traitements qui diminuent l’activité du système immunitaire et des thérapies ciblées plus récentes. Les corticoïdes permettent de réduire rapidement l’inflammation, mais leur utilisation prolongée peut entraîner des effets indésirables importants, tels qu’une prise de poids, une augmentation de la pression artérielle, des perturbations hormonales et des troubles du métabolisme du sucre. Les traitements immunosuppresseurs, qui réduisent de façon globale les défenses immunitaires, exposent quant à eux les patients à un risque accru d’infections. Les thérapies ciblées, utilisées lorsque les traitements précédents ne sont plus efficaces, agissent sur des mécanismes précis de l’inflammation intestinale et permettent de ralentir l’évolution de la maladie. Toutefois, environ six patients sur dix ne répondent pas durablement à ces approches, un phénomène également observé dans les modèles animaux. De plus, ces traitements peuvent eux aussi augmenter la sensibilité aux infections. Afin de répondre à ces limites, nous avons développé une nouvelle molécule innovante visant à stimuler les mécanismes naturels de résolution de l’inflammation plutôt qu’à inhiber globalement le système immunitaire. Dans des modèles expérimentaux de colite chez l’animal, nous espérons observer une récupération plus rapide du poids, une amélioration des symptômes digestifs, ainsi qu’une amélioration de l’aspect du côlon, indicateur d’une inflammation réduite. L’objectif est de restaurer une morphologie intestinale proche de la normale. Si ces résultats sont confirmés chez l’animal, nous envisageons à terme un essai clinique chez l’Homme, destiné aux patients pour lesquels les traitements actuels ne sont plus efficaces, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Procédures
Chirurgie : Pas de chirurgie ni sutures. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés à J0 pour induire le modèle (protocole 3) par injection intra-rectale à raison d’un maximum de 280 souris. Un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sur des animaux vigiles à hauteur d'une fois par semaine maximum pourra être envisagé (50µL par prélèvement). Cette procédure peut concerner l’ensemble des animaux à savoir un maximum de 832 souris. Les traitements
Impact sur les animaux
Modèle 1 : colite induite par un polysaccharide administré dans l’eau de boisson L’administration orale d’un agent chimique irritant entraîne une augmentation de la perméabilité de la paroi du tube digestif, provoquant une inflammation localisée du côlon, comparable à la rectocolite hémorragique observée chez l’Homme. Ce modèle se traduit par une perte de poids et l’apparition de diarrhée, évaluée à l’aide d’un score compris entre 0 et 4. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë de l’inflammation, puis tous les deux jours par la suite. Lorsque le score de diarrhée atteint 3, celle‑ci s’accompagne généralement d’une prostration, d’une diminution de l’activité et de signes de douleur. Ces manifestations cliniques, associées à la perte de poids, apparaissent généralement entre le septième et le dixième jour après le début de l’induction, avant une récupération rapide, les animaux retrouvant leur poids initial vers le vingtième jour. Le score de diarrhée égal à 3 correspond à un épisode transitoire, observé sur une courte période, avec une amélioration progressive. Durant la phase la plus sévère, les animaux sont suivis quotidiennement et un traitement analgésique est administré afin de limiter la souffrance. Modèle 2 : colite induite par administration locale d’un agent inflammatoire L’administration locale d’un agent inflammatoire associé à un solvant provoque une augmentation de la perméabilité de la paroi colique et un recrutement important de cellules immunitaires. Ce modèle induit une perte de poids supérieure à 10 % ainsi qu’une diarrhée modérée. Les symptômes apparaissent dès le lendemain de l’administration et s’améliorent rapidement à partir du troisième jour. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’étude et un traitement analgésique est administré du jour de l’induction jusqu’au troisième jour afin de limiter la douleur.
Devenir
L’ensemble des 832 souris seront mis à mort par dislocation cervicale en fin d’expérimentation pour effectuer des prélèvements biologiques à des fin d’analyse cellulaire ou tissulaire. Au cours d’une des procédures décrites ci-dessus il se peut également que des animaux soient mis à mort précocement si des points limites sont atteints, que ce soit lié à la pathologie elle-même ou aux traitements si leur efficacité s’avère futile.
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal. Les études pilotes sur un nombre restreintes d’animaux et sans traitements thérapeutiques permette de valider la mise en place du modèle dans les conditions d’hébergement de l’animalerie. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons tout d'abord déterminé la différence attendue entre le groupe contrôle et le groupe traité ainsi que l'écart-type des échantillons grâce à des expériences précédentes. Ceci nous a permis d'obtenir la variante d= 0.79. Pour un test statistique bilatéral n=22 animaux sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. Les protocoles sont planifiés afin d’éviter le stress à l’animal et les points limites définis sont bien intégrés afin d’anticiper toute souffrance inutile. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de la buprénorphine dans l’eau de biberon (0.003mg/mL). Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie par un mélange d’air/isoflurane 4%. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur souffrance. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton. Pour finir, si des animaux montrent des difficultés pour s'alimenter, des croquettes mouillées seront mise au fond de la cage.
Choix des espèces
Afin d’étudier différents mécanismes de l’inflammation chez l’animal vivant, nous utiliserons des souris appartenant à plusieurs lignées connues pour leur sensibilité aux modèles de colite induite chimiquement. Ces lignées présentent des niveaux d’inflammation plus ou moins marqués, ce qui permet d’adapter la sévérité du modèle aux objectifs de l’étude. Le choix de la lignée dépend également du traitement testé, certains agissant uniquement chez des animaux exprimant la cible biologique concernée. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Effet du regime alimentaire riche en algues et de l’inflammation intestinale sur le developpement de la nephropathie à IgA chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rendues malades par un régime enrichi en algues puis par une colite chimique, 560 souris vont être utilisées dans des procédures allant du niveau léger au sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des gavages d'antibiotiques et un prélèvement de sang terminal derrière l'œil sous anesthésie. L'étude vise à confirmer qu'une alimentation riche en algues aggrave une maladie rénale, la néphropathie à IgA, en partant de la forte incidence observée au Japon. Le niveau de souffrance sévère tient à la colite induite chez des souris qui développent déjà spontanément cette maladie.
Objectifs
La néphropathie à IgA (NIgA) est l’une des maladies rénales les plus fréquentes dans le monde. C'est une maladie où les dépôts d'IgA s'accumulent dans le rein et constitue une cause majeure d’insuffisance rénale terminale nécessitant un traitement de suppléance par dialyse ou greffe rénale. La néphropathie à IgA, c’est donc une maladie qui touche les reins (les organes qui filtrent le sang). Le corps fabrique des petites “armes” pour se défendre contre les microbes. Parmi elles, il y en a une appelée IgA. Chez certaines personnes, ces IgA ne se comportent pas comme prévu : elles s’accumulent dans les reins et les abîment petit à petit. Du coup, les reins filtrent moins bien le sang. Cela peut provoquer du sang dans les urines, de la fatigue, et parfois des problèmes pour uriner. Dans les cas les plus graves, les reins peuvent beaucoup se fatiguer et ne plus fonctionner. Cette maladie est fréquemment associée à une inflammation intestinale, souvent discrète, avec peu de symptômes cliniques. L'intestin est un organe fortement colonisé, connu pour abriter une communauté complexe de micro-organismes appelée microbiote. La nephropathie à IgA (NIgA)est associée à une altération du microbiote intestinal.L’Extrême-Orient, notamment le Japon, présente la plus forte incidence de NIgA au monde ce qui suggère que l’alimentation joue un rôle déclencheur dans cette pathologie, en accord avec l’hypothèse selon laquelle la forte consommation d’algues (comme dans les sushis) en Asie pourrait contribuer à l’incidence élevée observée dans cette région. Les objectifs du projet sont de comparer le développement de la NIgA induite par une alimentation enrichie en algues, avec ou sans inflammation intestinale et donc de confirmer le rôle aggravant d’une diète riche en algue dans le développement de la néphropathie à IgA., de déterminer le rôle d’inflammation intestinale induite dans le développement de la maladie et donc de determiner le rôle des deux facteurs (diète + inflammation intestinale) dans le développement de la néphropathie à IgA.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les diètes riche en algues et le microbiote interagissent induisant la maladie rénale. Cela permettra une orientation thérapeutique dans les pays à forte consomation d’algue alimentaire et nous permettrons de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les diètes modifiées ou des probiotiques (micro-organismes bénéfiques pour la santé du système digestif), pour le traitement et/ou la prévention de la néphropathie à IgA.
Procédures
Des prélèvements d'urines et de fécès seront effectués avant et après les procédures. Un prélèvement de sang au début des expérimentations ainsi qu'un prélèvèment de sang en terminal par voie rétro-orbital sous anesthesie (au niveau de l'oeil). Les antibiotiques seront administrés par gavages.
Impact sur les animaux
Aucun phénotype dommageable au stade auquel les animaux seront étudiés n'a été reporté pour les différentes lignées disponibles pour ce projet. Des nuisances seront en revanche générées chez les animaux soumis à un traitement Dextran Sodium Sulfate (DSS) qui induit la colite (inflammation intestinale). Il est aussi reconnu que les gavages utilisés dans les procédures, peuvent induire un stress chez les animaux, de même que la contention de l'animal peut occasionné un stress chez l'animal. Ces nuisances sont de courtes durées.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les modèles cellulaires ou la modélisation informatique ne permet pas d’imiter la dynamique de la progression de la néphropathie à IgA (NIgA). Les conséquences liées à la maladie peuvent être validées uniquement dans des modèles qui présentent la véritable pathologie dans des conditions identiques à celles qui surviennent chez l'homme ou l’animal. L’utilisation de l’animal permet d'analyser les mécanismes de la néphropathie à IgA au niveau de l'organe et des cellules, de tester l'efficacité des diètes et d’évaluer leur risque relatifs. Comprendre comment l'inflammation intestinale contribue au dévelppement de la NIgA permettra à terme le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques au bénéfice des patients atteints de NIgA.
Réduction
Des précedents travaux, ont permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation de logiciel statistique a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées statistiquement.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes cliniques selon une grille de score). Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons).
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisées dans ce projet développe spontanément une néphropathie à IgA mais sans signes d’inflammation intestinale et ne progressent pas vers l’insuffisance rénale terminale. Ce modèle permet de mieux étudier le rôle de l’induction d’une inflammation intestinale (colite) de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications d'une maladie progressive observées chez les patients. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Pour toutes ces raisons, nous pensons qu'il n'existe pas d'autre modèle animal qui soit davantage favorable, ou toute autre approche qui pourrait remplacer l'utilisation des souris pour modéliser la NIgA. Les souris utilisées pour les procédures auront entre 4 à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la NIgA.
Influence du microbiote intestinal postnatal précoce dans les réponses inflammatoires associées à une douleur cornéenne en lien avec la sécheresse oculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux instillations par jour d'un conservateur de collyre abrasif pendant une semaine, un inducteur de colite dans l'eau de boisson, quatre semaines d'antibiotiques : 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. L'objectif est de relier un déséquilibre du microbiote intestinal en début de vie à l'apparition de douleurs oculaires chroniques. Les souris reproductrices, qui ne font l'objet d'aucun prélèvement, sont elles aussi tuées faute de pouvoir être réutilisées. Les pistes thérapeutiques annoncées pour les patients restent renvoyées au long terme.
Objectifs
Après la naissance, le système immunitaire apprend progressivement à faire la différence entre ce qui est inoffensif et ce qui peut etre dangereux pour l’organisme. Cet apprentissage dépend en grande partie du microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des bactéries qui vivent naturellement dans l’intestin. Un moment clé de cette maturation est le sevrage, lorsque l’alimentation du nourrisson se diversifie. A cette période, le système immunitaire s’active afin de s’adapter aux nouvelles bactéries présentes dans l’intestin. Cette étape est essentielle pour installer une tolérance immunitaire, qui permet d’éviter des réactions excessives ou dirigées contre les propres tissus du corps. Si le microbiote est perturbé à ce moment critique, par exemple après la prise d’antibiotiques ou en cas de déséquilibre des bactéries intestinales, cet apprentissage peut être altéré. Le système immunitaire devient alors plus susceptible de réagir de manière inappropriée, augmentant le risque de maladies inflammatoires ou auto-immunes plus tard dans la vie. Des travaux récents ont également mis en évidence un lien étroit entre l’intestin, le cerveau et l’œil, appelé axe intestin cerveau œil. Une perturbation précoce du microbiote peut interférer avec le développement normal de la cornée, la surface transparente de l’œil, ainsi que de ses nerfs. Cela peut rendre l’œil plus vulnérable à l’inflammation, qui, lorsqu’elle devient chronique, peut entraîner des douleurs oculaires ou une sécheresse oculaire. Ce projet vise à comprendre comment un microbiote déséquilibré en début de vie perturbe le système immunitaire et favorise l’apparition de douleurs oculaires. A terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements permettant de mieux prévenir et soulager ces troubles, et d’améliorer la qualité de vie des personnes concernées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire (les mécanismes de défense du corps) agit au niveau de la cornée, la surface transparente de l’œil. En identifiant précisément ces mécanismes, il permettra de mettre en évidence de nouvelles pistes pour développer des traitements plus efficaces. Le projet s’intéresse également au role du microbiote intestinal, l’ensemble des micro organismes vivant dans l’intestin, en particulier lorsqu’il est perturbé très tôt dans la vie. Ces perturbations précoces peuvent avoir des effets durables sur la santé, y compris en dehors de l’intestin. L’objectif est de comprendre comment elles influencent la santé de la surface de l’œil, favorisent l’inflammation et peuvent conduire à des douleurs cornéennes chroniques ou à une sécheresse oculaire. À plus long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes, visant à rétablir un bon équilibre des réponses immunitaires, à soulager durablement la douleur et la sécheresse oculaire, voire à prévenir leur apparition. En ciblant les interactions entre le système immunitaire et les nerfs impliqués dans la douleur, ce projet ambitionne d’améliorer significativement la qualité de vie des patients souffrant de douleurs oculaires chroniques ou de maladies inflammatoires associées.
Procédures
Perturbation du microbiote intestinal précoce : Le microbiote intestinal sera perturbé par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 4 semaines, associée à un régime alimentaire dépourvu de fibres. Modèle d’inflammation intestinale (colites) : Un agent inducteur de colite sera administré dans l’eau de boisson pendant 14 jours au total, selon deux cycles successifs de 7 jours. Les instillations nécessiteront une contention de quelques secondes chez l’animal vigile. Les tests comportementaux, réalisés chez des animaux vigiles, impliqueront également des contentions brèves : test d’anxiété (2 sessions de 10 minutes par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 sessions de 30 secondes) et test de sensibilité chimique cornéenne (1 session de 30 secondes). Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (4 sessions de 5 minutes), et une euthanasie règlementaire sera effectuée après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Modèle de douleur inflammatoire par instillation d’un conservateur de collyre : La douleur inflammatoire sera induite par des instillations d’un conservateur de collyre abrasif, réalisées deux fois par jour pendant 7 jours, suivies d’instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique (2 fois par jour espacées de 4 heures pendant 7 jours). Les instillations et tests comportementaux nécessiteront des contentions de quelques secondes chez l’animal vigile, selon les mêmes modalités que précédemment (tests d’anxiété et de sensibilité cornéenne). Les sessions d’imagerie (4 × 5 minutes) et l’euthanasie règlementaire seront effectuées après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Thérapie par instillations oculaires : Les traitements topiques (agent pharmacologique ou solvant) seront administrés par instillations oculaires deux fois par jour pendant 7 jours, espacées de 4 heures, une heure après l’instillation d’un conservateur de collyre abrasif chez l’animal vigile. Les modalités de contention, de tests comportementaux et d’anesthésie pour l’imagerie et l’euthanasie seront identiques à celles décrites ci-dessus.
Impact sur les animaux
Les antibiotiques et l’alimentation pauvre en fibres peuvent parfois provoquer une légère perte de poils sur le dos et un ralentissement modéré de la prise de poids. Les substances utilisées pour provoquer une inflammation peuvent entraîner une irritation de l’intestin ou de l’œil, une perte de poids et, plus rarement, la présence de sang dans les selles. Les animaux sont manipulés régulièrement pour l’administration de gouttes dans les yeux, ce qui peut générer un léger stress. Les injections d’anesthésiques ou d’antalgiques peuvent aussi provoquer une gêne brève au point d’injection. L’anesthésie générale comporte un faible risque (ralentissement cardiaque ou respiratoire, baisse de la température corporelle) et, très rarement, un décès. Des réactions locales au site d’injection (rougeur, douleur, petite infection) peuvent apparaître mais restent peu fréquentes. Les examens d’imagerie de l’œil nécessitent une anesthésie générale, ce qui représente un risque léger. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress passager (fatigue ou modification temporaire du comportement). Les traitements testés sont destinés à soulager l’inflammation oculaire. Leur administration est généralement indolore, mais une légère irritation transitoire peut parfois être observée. Les animaux sont surveillés attentivement afin de détecter et limiter tout inconfort.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires, impliquant l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à l’issue de chaque procédure expérimentale. Tous les animaux inclus dans le champ du projet et soumis aux procédures expérimentales feront l’objet de prélèvements post-mortem et seront euthanasiés. Les femelles reproductrices ne font pas l’objet de prélèvements mais, ne pouvant être réutilisées, sont néanmoins euthanasiées conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire, le microbiote et l’activation des voies nociceptives cornéennes. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire, le système nerveux et le microbiote intestinal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur.
Réduction
Afin de limiter au maximum le recours aux animaux, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été strictement calculé et optimisé. Sur une durée totale de 5 ans, le projet impliquera au maximum 2 832 souris utilisées dans les procédures expérimentales. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’études précédentes et de calculs statistiques, afin d’utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ces calculs montrent qu’il faut au moins 10 animaux analysables par groupe expérimental. Dans nos expériences, les petits d’une même mère sont considérés comme appartenant à une même “portée”. Comme les frères et sœurs se ressemblent biologiquement, on tient compte de cette particularité dans le calcul du nombre total d’animaux. Le total inclut donc aussi les femelles reproductrices nécessaires pour obtenir suffisamment de petits par groupe. En moyenne, une mère donne naissance à environ 5 souriceaux. Ainsi, pour disposer de 10 animaux réellement analysables dans un groupe, environ 12 animaux sont nécessaires au total. Cela explique pourquoi le nombre final d’animaux n’est pas toujours un multiple exact de 10. Afin de réduire encore le nombre total d’animaux utilisés, plusieurs tissus sont prélevés sur chaque animal après euthanasie (œil, nerfs, cerveau, intestin, organes immunitaires). Cette approche permet de réaliser plusieurs analyses complémentaires à partir d’un même animal, sans multiplier les expérimentations. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés, afin de garantir une interprétation fiable et objective. Ces analyses permettent de déterminer si les différences observées sont réelles ou dues au hasard, selon des critères reconnus par la communauté scientifique.
Raffinement
Les animaux importes observeront une periode d acclimatation de 5 jours minimum avant le debut des experimentations ainsi que des temps de repos etablis entre les differents actes experimentaux. Les animaux seront heberges dans des cages ventilees en stabulation standard avec enrichissement maison en carton avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous eviterons tant que possible l hebergement individuel des animaux. Les conditions d hebergement sont conformes a la reglementation en vigueur. Des points limites ont ete definis et les animaux seront examines quotidiennement par le personnel qualifie de l animalerie et ou les experimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera note dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l echelle decisionnelle definie par notre structure du bien etre animal SBEA pouvant mener a l administration d un traitement a decaler dans le temps les actes prevus ou a euthanasier l animal si cela est necessaire. Lors de la gestation et ce jusqu a la fin du sevrage les meres sont placees au nombre de 2 par cage et restent avec les nouveaux nes. La nourriture et l eau de boisson sont fournies ad libitum. La temperature de la zone d hebergement est maintenue a 22 plus ou moins 2 et suit un cycle d eclairage non inverse 12h jour 12h nuit hygrometrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent. Un systeme d etiquetage associe a des pastilles visuelles permettra d assurer un suivi rigoureux du bien etre des animaux. Pour eviter toute souffrance les procedures chirurgicales se feront sous anesthesie generale associee a un protocole analgesique en pre per et post operatoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l animal ne soit stabilise pour ces differentes constantes. Si un animal anesthesie presentait une detresse respiratoire ou cardiaque ou s il se trouve en hypothermie nous procederons a un arret immediat du protocole en cours et en l absence de retablissement selon le temps defini pour respecter le bien etre animal l euthanasie de l animal sera envisagee. Les tests de la lampe a fente et l imagerie confocale in vivo qui peuvent induire un leger stress et necessitent que l animal soit immobile seront realises sous anesthesie generale.
Choix des espèces
Pour comprendre comment le systeme immunitaire et les bacteries de l intestin (microbiote) interagissent, nous utilisons des souris commerciales non transgeniques. Ces souris sont bien adaptees pour ce type d etude car leur biologie et leur developpement sont proches de ceux de l homme, et les connaissances acquises sont utiles pour mieux comprendre la sante humaine. Elles sont egalement un modele reconnu pour l etude de la douleur oculaire, car leurs yeux et leur cerveau sont similaires a ceux de l homme. Nous utiliserons des souris a differentes etapes de la vie, de la naissance a l age adulte, pour etudier comment les changements du microbiote precoce peuvent influencer les reactions du systeme immunitaire plus tard. Chaque experience durera 14 a 16 semaines maximum, et aucun animal ne depassera l age de 16 semaines. Les stades choisis sont bases sur les connaissances scientifiques, afin de suivre le developpement des animaux sur la duree et comprendre les effets des perturbations du microbiote sur la sante des yeux et du systeme immunitaire a l age adulte.
Etude par imagerie moléculaire du rôle de l’inflammation intestinale dans l’accident vasculaire cérébral chez la souris Mus musculus – Etude pilote
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Remplacement
Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.
Réduction
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.
Raffinement
Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.
Rôle de l’interleukine-33 dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Rendues malades par une colite chimique chronique, une partie des 386 souris subit une hypersensibilité viscérale et une perte de poids qualifiées de sévères. Elles reçoivent aussi une déplétion du microbiote par antibiotiques puis un transfert par gavage quotidien pendant sept jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Pour les colites induites chimiquement, l'usage décrit par le porteur est de ne donner aucun analgésique, ces molécules risquant d'interférer avec l'inflammation étudiée. L'étude vise l'interleukine-33 comme cible contre la fibrose intestinale, la souffrance sévère de la colite étant assumée sans traitement de la douleur.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la récurrence de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente de ces maladies est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par un épaississement de la paroi intestinale lié à une réparation tissulaire chronique. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler l’interleukine-33. L’interleukine-33 est une cytokine dont les taux sont plus élevés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Elle est produite dans des cellules clés dans le développement de la fibrose intestinale comme les fibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales et endothéliales. De plus, des bactéries pathogènes sont retrouvées dans la muqueuse intestinale des patients atteints de la maladie de Crohn et contribuent à l’inflammation. La colonisation par ces bactéries dans des modèles précliniques induit de la fibrose intestinale et implique l’interleukine-33. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. De plus, l’interleukine-33 est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. Ce projet permettra donc de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication de l’interleukine-33 dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie, 1min par injection, selon la molécule utilisée. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée les premier et dernier jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’induction de colite chronique sont de 59 jours et 42 jours respectivement. Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporel chez la Souris. Les souris ont accès de façon ad libitum à la nourriture durant la totalité des procédures mais de la nourriture pourra être donnée directement dans la cage si l’état de la souris ne lui permet pas d’accéder directement à la nourriture. Concernant le transfert de microbiote, les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Le gavage engendrant un stress chez la souris, avant toute contention ou gavage, l’animal sera acclimaté aux pièces d’hébergement et manipulé fréquemment afin de l’habituer aux expérimentateurs et de réduire son stress.
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains en réponse à une cytokine pro-fibrotique ou des lignées de cellules épithéliales intestinales en réponse à des cocktails de cytokines pro-fibrotique ou pro-inflammatoire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Pour cela, un scoring basé sur un examen clinique sera réalisé permettant d’évaluer l’état de bien-être de l’animal. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 3 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. Cependant, au cours de la procédure 1, nous évaluerons l’impact de l’administration d’une analgésique tel que le butorphanol, sur le développement de l’inflammation et de la fibrose intestinale. Si le butorphanol n’interfère pas avec le développement des paramètres d’intérêt, nous utiliserons par la suite cette molécule, dans l’ensemble des procédures (procédures 2 à 4) décrites dans le projet.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.
MODIFICATION : Etude du rôle du HLA-B27 au cours de la spondylarthrite utilisant le modèle expérimental du rat transgénique pour la molécule HLA-B27 et la B2 microglobuline humaine.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Porteurs d'un transgène humain qui déclenche à lui seul la maladie, 1200 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue pour le prélèvement d'organes. Sous le seul effet du transgène, ils développent des arthrites, une colite, parfois une inflammation de la peau ou de l'œil, avec douleur, perte de poids et mobilité réduite. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant six à douze semaines lors des essais de molécules. Le porteur qualifie ce rat de modèle le plus "percutant" de la spondylarthrite, la souffrance venant ici de la maladie que l'animal porte par construction.
Objectifs
l’objectif majeur de notre projet est de comprendre le rôle pathogène du HLA (Antigènes des Leucocytes Humains)-B27 au cours de la spondyloarthrite (SPA) utilisant le modèle expérimental de SPA : le rat transgénique HLA-B27 afin de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Au cours de ces dernières années, nous avons cherché à comprendre pourquoi nous observons une proliferation anormale des lymphocytes T pro-inflammatoires producteurs de la cytokine inflammatoire (IL-17) chez le rat B27, le modèle animal le plus pertinent et le plus proche de la SpA humaine. Nos résultats ont mis en évidence que l’IL-27 (une cytokine anti-inflammatoire) et ICOS (une molécule de costimulation) étaient deux nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SpA. En ce qui concerne l’IL-27, elle a eu un effet protecteur en réduisant la sévérité des manifestations inflammatoires chez le rat B27, tout en inhibant les réponses des lymphocytes inflammaoires et la production d'IL-17. Nos résultats ouvrent des nouvelles perspectives même pour des patients qui ne repondent pas aux traitements actuellement disponibles.
Procédures
Post-mortem, des organes lymphoides des animaux seront prélévés en quelques minutes (environ 2-3) pour une analyse cellulaire ou histologique. Durant les essais pré-cliniques, les animaux seront injectés (durée de l'injection quelques secondes) intraperitoneal tous les jours pendant 6-12 semaines. Pour les experiences ex-vivo un minimun de 2 animaux non transgéniques et 2 animaux transgéniques seront utilisés et les experiences seront répétées 5 à 6 fois. Pour les essais pré-cliniques, nous utiliserons des groupes de 6 à 8 animaux par groupe.
Impact sur les animaux
Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus percutant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes ou une partie des manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Ainsi, ces animaux développent des manifestations comme des arthrites et une colite. Certains animaux développent aussi une l’inflammation de la peau ou de l’œil. Ces manisfestations peuvent engendrer chez ces animaux de la douleur, perte de poids et parfois une mobilité reduite.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, à l'exception de l'elevage, les animaux seront mise à mort pour les prélèvements d'organes nous permettant d'etudier les céllules, les organes et les méchanismes impliqués dans la pathogénèse de la maladie. Dans d'autres cas, les animaux seront utilisés pour étudier le potentiel thérapeutique des certaines molécules à partir du prélèvements d'organes et analyse cellulaire.
Remplacement
Toutes les molécules avec un potentiel thérapeutique seront d’abord testées in vitro en utilisant des lignées cellulaires à la place des animaux par exemple. Seulement après validation in vitro, ces molécules seront téstées chez les animaux afin d'étudier leur potentiel thérapeutique dans le traitement contre les spondyloarthrites.
Réduction
Comme prévu, dans les essais pré-cliniques, le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe de traitement sera de 6 et 8. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet de réaliser des analyses statistiques robustes permettant d’établir quelques conclusions pertinentes sur des paramètres abordés dans notre projet. Il ne nous paraît pas envisageable de réduire ce nombre d’animaux par groupe dans de futurs projets, si l’on souhaite garder des analyses statistiques pertinentes.
Raffinement
Nous envisageons, en cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, de mettre de l’alimentation dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Du change de cages, deux fois par semaine , seront prévus pour les cages où il y aura des animaux très malades avec diarrhées. Nous mettrons en place l'ajout de fromage aux femelles gestantes et aux petits pour améliorer leur croissance. A partir de 7 semaines d’âge l'etat de santé des animaux sera observé et nous utiliserons un tableau de scoring de la maladie (voir tableau ci-dessous). Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% ou atteignant le score total de 15 (= point limite) seront sacrifiés. Score maximal total = 27 Semaine 7……Semaine X Poids (g) Diarrhée Absente=0 Modérée = 1 Importante= 2 Profuse=3 Anite=+1 Articulations Normale=0 Gonflée = 1 à 4 Patte AV gauche Patte AV droite Patte AR gauche Lésions cutanées 1 à 4 Ongles= +1 Orchite Absence=0 Présence=1 Uvéite Absence=0 Présence=1
Choix des espèces
Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus relevant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes les manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Notre objectif est donc de comprendre le rôle pathogène du HLA-B27 au cours de la pathologie en utilisant ce modèle. Il est important de souligner que des souris portant le même transgène ne développent aucun signe de la maladie. Nous utiliserons des animaux à un état précoce du développement de la maladie (environ 3 semaines) ne présentant pas encore des signes cliniques, par exemple pour les expériences nécessitant d’utiliser des cellules en absence d’inflammation ou dans le cas de traitement in vivo précoce. Dans ce cas, les animaux seront marqués à l’encre et génotypés avant leur utilisation. Pour toutes les autres expériences, en utilisant de rats adultes qui presentent des signes cliniques (la maladie est etablie) nous utiliserons un protocole classique de marquage à l’oreille et génotypage à partir d’échantillons de l'oreille marquée. Des rats adults (entre 3 mois et 6 mois d'âge) seront utilisés pour certaines expériences.
Impacts d’une exposition chronique périnatale à deux additifs alimentaires inorganiques riches en aluminium sur les fonctions intestinales, immunitaires, métabolique chez la souris de la vie in utéro à l’âge adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 504 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées à l'aluminium dès la gestation à travers leur mère, elles subissent des gavages, des prises de sang et, pour une partie, une colite provoquée par un produit chimique entraînant diarrhées sanglantes et perte de poids. Le projet évalue l'effet d'additifs alimentaires sur l'intestin et le risque de maladies chroniques. Le porteur annonce une fourchette large, de 1 200 à 3 504 animaux, sans préciser ce qui fixe le nombre réellement utilisé.
Objectifs
Les études montrent que l’aluminium (Al) peut être neurotoxique et immunotoxique. L’alimentation constitue la principale source d’exposition : si les denrées brutes contiennent de l’Al d’origine naturelle, les aliments ultra‑transformés en apportent les plus fortes quantités via des additifs renfermant de l’Al comme composé principal ou impureté. L’autorité européenne de sécurité des aliments estime que les consommateurs les plus exposés à ces additifs dépassent la dose hebdomadaire tolérable de 1 mg d’Al/kg pc/semaine, tout en soulignant le manque de données toxicologiques spécifiques pour l’Al qu’ils contiennent, notamment en cas d’expositions précoces susceptibles d’engendrer des effets à long terme. Des particules d’Al ont été observées dans le placenta humain et le méconium, démontrant une exposition dès la vie fœtale. Après ingestion, l’Al s’accumule dans divers organes, dont le foie, acteur clé du métabolisme. Au niveau intestinal, des particules d’Al ont été détecté dans la barrière intestinale. Celle‑ci, constituée de l’épithélium, du microbiote et du système immunitaire intestinal, dépend de l’équilibre entre ces trois composantes pour maintenir l’homéostasie. Toute altération d’un de ces acteurs est associée au développement de maladies chroniques, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le diabète de type 2. Compte tenu de l’immunotoxicité de l’Al, nous posons l’hypothèse qu’une exposition dès la gestation à des additifs riches en Al pourrait perturber la barrière intestinale et favoriser l’émergence de ces pathologies. Ce projet vise à explorer chez la souris exposée dès la gestation à deux additifs riches en Al, i) la biodistribution de l’Al et ii) les impacts sur les fonctions métaboliques et intestinales des descendants. Des femelles seront exposées à ces additifs via l’alimentation pendant la gestation et la lactation. Après le sevrage, une partie des descendants poursuivra le même régime jusqu’à l’âge adulte afin d’analyser l’impact sur le métabolisme, la barrière intestinale et la susceptibilité à la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet chez la souris nous permettra d’approfondir nos connaissances sur l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin et le diabète de type 2. Les données obtenues dans ce projet réalisé à des doses d’exposition humaine permettront également d’aider les agences de sécurité alimentaire et les responsables des politiques publiques à formuler des recommandations sur les limites de teneur en Al des additifs alimentaires pour une utilisation sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l’enfant et l’adulte.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue, après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fèces seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Dans le modèle de colite, la dilution à 2% d'un composé chimique pendant 7 jours permettra d'induire progressivement une inflammation intestinale.
Impact sur les animaux
La réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à la mise à jeun des animaux ainsi qu’à l'administration orale par gavage avec un risque possible de fausse route. L’administration de glucose entrainera une hyperglycémie transitoire nécessaire pour évaluer la tolérance au glucose des animaux. Les prélèvements de sang engendreront un stress lié à la contention et la piqure. Une fois les mesures terminées, une légère inflammation des tissus de la zone prélevée pourra se mettre en place. Enfin la procédure visant à provoquer une inflammation intestinale, entrainera une perte de poids plus importante que dans les autres procédures ainsi que des troubles intestinaux, avec apparition de selles molles ou de diarrhée, avec ou non présence de sang. Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront exposés à des doses d’additifs correspondant aux niveaux d’exposition humaine pour lesquels aucun effet clinique n’a été rapporté à ce jour. Dans un contexte d’inflammation intestinale, les propriétés immunotoxiques et adjuvantes de l’aluminium laissent supposer que l’exposition aux additifs riches en Al pourrait aggraver la colite avec une perte de poids et une diarrhée plus importante. Enfin le prélèvement de fèces pourra générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront effectués post mortem pour des analyses biochimiques, histologiques et de biologie moléculaire pour évaluer l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin, le diabète.
Remplacement
Les impacts directs des additifs alimentaires riches en aluminium sur l’épithélium intestinal, le microbiote et les cellules immunitaire peuvent être évalués par des approches in vitro ou ex-vivo à l’aide respectivement d’organoïdes intestinaux, de lignées cellulaires immunitaires ou de digesteurs artificiels. Ces approches sont actuellement mises en place pour ce projet et nous permettra d’obtenir des informations sur l’expression des gènes impliqués dans les fonctions de la barrières intestinales ou encore sur la composition et l’activité du microbiote. Toutefois elles ne permettent pas aujourd'hui de reproduire les échanges entre la mère et le fœtus ou la complexité des dialogues microbiote-intestin-foie-système immunitaire, ni même d’évaluer la distribution des particules d’Aluminium dans l’organisme.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé à l’aide de test statistiques adapté. Sur l’ensemble du projet, au minimum 1200 animaux et au maximum 3504 animaux seront nécessaires.
Raffinement
Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue une heure avant les prélèvements sanguin comme préconisé par le fabricant. Lors du modèle d’inflammation intestinale une grille d'évaluation sera utilisée pour évaluer le degré de l’inflammation avec des points limites spécifiques appliqués. L’accès à l’alimentation et l’eau sera facilité en disposant un aliment hydraté dans une boite de petri directement sur la sciure de la cage. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée par le responsable du projet sur les conseils du vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin, le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés avant la mise bas (fœtus), au sevrage ou à l’âge de 5 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale ou à long terme sur les fonctions intestinales et métaboliques en prenant en compte un potentiel effet sexe.