Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans l’étude des maladies neurodéveloppementales présentant déficiences intellectuelle (DI) et/ou troubles du spectre autistique (TSA) comme dans le Syndrome de l’X fragile.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées et élevées pour fournir des lignées modèles de déficience intellectuelle et d'autisme, 1 500 souris subissent le prélèvement de deux millimètres de l'extrémité de la queue, sur animal vigile sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération dure cinq secondes et se pratique entre le treizième et le vingt-huitième jour de vie, âge où la queue est peu ossifiée, ce qui permet de s'en tenir à une contention sans anesthésie. Le porteur indique avoir écarté trois méthodes non invasives, dont le prélèvement de poils, parce que "le souffle sous la hotte de change fait voler les poils hors des tubes". Le sort de chaque souris dépend ensuite du génotypage : celles qui portent le génotype recherché rejoignent un projet expérimental ou l'élevage, les autres sont tuées.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Il est donc nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés et ceux nécessaires au maintien des lignées. Nous avons testé des prélèvements par 3 méthodes non invasives à partir de follicules pileux, de fèces, ou via un écouvillonnage bucal. Elles ne sont pour l’instant pas adaptées à nos conditions de diagnostics et manquent de fiabilité: 1) l'écouvillonnage bucal donne des résultats de très faible intensité et parfois même ne mettant pas en évidence une mutation, 2) le prélèvement de poils donne des intensités faible et il y a aussi une forte probabilité d'erreur due au souffle sous la hotte de change qui fait voler les poils hors des tubes, 3) l’utilisation d’encoche à l’oreille ne permet pas un marquage fiable d’un nombre important d’animaux sur les moyens et longs termes. Dans tous les cas, cela peut amener à des erreurs qui compromettraient les résultats obtenus et conduiraient à la nécessité de répéter des prélèvements sur les mêmes animaux ou à en utiliser un plus grand nombre, ce qui est en contradiction avec les principes de raffinement et de réduction. L’objectif de ce projet est une procédure de prélèvement par biopsie utilisée au sein de notre équipe pour le génotypage (technique permettant de relever les différences génétiques entre les animaux d'une même fratrie) identification des animaux qui sera associée à une identification par pose d'une bague auriculaire. Les animaux produits seront utilisés sur des projets concernant l’étude l’étude des maladies neurodéveloppementales présentant déficiences intellectuelle (DI) et/ou troubles du spectre autistique (TSA) comme dans le Syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de sélectionner les animaux ayant un gène d'intérêt afin d'optimiser la gestion de l'élevage et de fournir les animaux nécessaires aux projets de l'équipe.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure sauf ceux dont le génotypage ne correspond pas à nos besoins. Leur devenir dépendra du résultat du genotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, si génotypage donnant les génotypes attendues, c) Mise à mort avec ou sans prélèvements post mortem pour les animaux au génotype non recherché .
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype (constitution génétique) non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, c’est-à-dire ayant des gènes identiques, si phénotype non dommageable, c'est-à-dire que l'ensemble des caractères observables d'un individu n'a pas de conséquence sur l'animal) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent de répondre à de nombreuses questions scientifiques en biologie, avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (ex: autisme). Les prélèvements de l’extrémité de la queue peuvent être réalisés entre P13 (animaux agés de 13 jours) et P28 (animaux agés de 28 jours), à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Rôle des astrocytes dans les déficiences intellectuelles
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie d'une heure sous anesthésie et des injections répétées cinq jours de suite attendent une partie des souris, les autres passant six jours de tests comportementaux à raison de trois à quatre sessions quotidiennes. 304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 132 d'entre elles et modéré pour 172. La lignée employée porte un phénotype dommageable qui affecte son comportement et son vieillissement, et l'objet déclaré du travail est de comprendre le dialogue entre neurones et astrocytes dans la déficience intellectuelle. Le porteur annonce ces tests comportementaux étalés sur six jours sans indiquer lesquels, et justifie le maintien du modèle animal par le fait que ces paramètres ne pourraient pas être mesurés autrement.
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d'un autre type cellulaire au moins aussi abondant appelé astrocytes. Alors que le rôle des neurones dans le fonctionnement cérébral est largement reconnu et étudié, le rôle des astrocytes et leurs interactions avec les neurones reste largement méconnu. Néanmoins, les données récentes suggèrent qu’ils seraient aussi impliqués dans le contrôle des états comportementaux et des fonctions cognitives en conditions physiologiques ainsi quedans certaines situations pathologiques. Notre étude s’intéresse aux interactions complexes qu’il existe entre les astrocytes et les neurones dans la mise en place d’une pathologie du développement, la déficience intellectuelle. Nous cherchons à mettre en évidence des anomalies de dialogue entre les neurones et les astrocytes et à plus grande échelle des anomalies de communication dans un réseau neuronal complexe du cerveau, tel que l’hippocampe. Cette structure possède des caractéristiques bien établies dans le dialogue entre les astrocytes et les neurones, faisant d'elle une référence de choix pour notre étude dans le contexte pathologique de la déficience intellectuelle.
Bénéfices attendus
L’étude de la fonction du gène impliqué et des mécanismes sous-jacents permettra une meilleure compréhension du rôle des astrocytes dans les déficiences intellectuelles, ce qui pourrait avoir des applications à visées thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux s’étendant sur 6 jours. Un seul test sera effectué par jour. Certains tests incluent plusieurs sessions le même jour (10 à 20 minutes), généralement 3 à 4, espacées d’environ 15 minutes. Une chirurgie sera effectuée sur certains animaux anesthésiés; cette procédure dure environ 1 heure et sera réalisée une seule fois. Certains animaux seront traités par injection, cette procédure dure 5 minutes par animal et sera répétée pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Certains animaux seront soumis à une chirurgie, ce qui engendre une douleur modérée de courte durée. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress léger sans douleur chez les animaux pendant la durée des tests. La souris de laboratoire utilisée dans ce projet présente un phénotype dommageable impactant certains paramètres comme leur comportement et leur vieillissement. Enfin, le traitement par injection engendre un stress léger et peut provoquer une douleur légère de courte durée chez les individus.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau seront collectés afin de permettre des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Nous voulons investiguer l’existence des anomalies de dialogue entre différents types de cellules cérébrales et à plus grande échelle des anomalies de communication dans un réseau complexe du cerveau pour ainsi caractériser et tester leur potentiel thérapeutique via des mesures comportementales. Ainsi, le remplacement du modèle animal n'est pas possible dans ce projet puisque ces paramètres ne peuvent pas être mesurés autrement.
Réduction
En se basant sur la littérature, des tests statistiques et l’expérience du personnel du laboratoire, un nombre minimal d’animaux sera utilisé. De plus, nous allons réaliser plusieurs analyses sur les mêmes souris, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les expériences invasives, comme les chirurgies seront réalisées avec une anesthésie et un traitement anti-douleur appropriés. Les souris recevront un régime alimentaire enrichi additionnel. Les souris seront inspectées quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Des point limites précoces pour prévenir toute souffrance ou stress de l’animal seront mis en place : animal prostré, fourrure ébouriffée, yeux plissés, perte de poids excessive. Les animaux seront mis à mort si aucune amélioration n'est constatée après deux jours de traitement. De plus, la souris employée de ce projet est utilisée dans le laboratoire depuis longtemps, ce qui nous permettra d’anticiper ses points limites et de faciliter la détection précoce des signes de souffrance, lors de son hebergement, en attente d'être utilisé pour experimentation.
Choix des espèces
La génétique de la souris est bien connue, ce qui permet de créer des modèles robustes pour l'étude des pathologies humaines. De plus, la souris est un mammifère où les processus qui régissent son développement sont les mêmes que chez les mammifères supérieurs. Enfin de nombreuses lignées sont disponibles chez cette espèce, ce qui nous intéresse tout particulièrement pour étudier les altérations pouvant conduire à une déficience intellectuelle. Notre but est d'étudier le gène impliqué dans les mécanismes sous-jacents de la déficience intellecuelle au cours du developpement, dès le stade juvénile. Les expériences seront donc réalisées chez la souris juvénile jusquà l'âge adulte pour étudier le rôle de ces altérations.
Etude comportementale de souris mutantes, modèles d’une maladie maladie génétique rare caractérisée par une déficience intellectuelle MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Placées dans des dispositifs qui mesurent leur activité, leur motricité, leur anxiété, leur sociabilité et leur mémoire, 360 souris porteuses de mutations liées au syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cette version du projet ajoute un test de rotarod, où l'animal court sur un cylindre tournant jusqu'à trois cents secondes, sans augmenter l'effectif. Le porteur écrit pourtant que le seul effet indésirable potentiel sera le stress lié à la nouveauté de l'environnement, et qualifie le phénotype de non dommageable. L'encéphale de chaque souris est prélevé après la mise à mort, au cas où des modifications anatomiques échapperaient à l'observation du comportement.
Objectifs
L’ajout d’un nouveau test comportemental (rotarod) sans ajout d’animaux nécessite une modification du projet initial. Le syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf est une maladie génétique humaine identifiée à ce jour sur une centaine de personnes à travers le monde, souvent chez de jeunes enfants. Ces malades souffrent généralement d'une déficience intellectuelle, d'un retard développemental, de syndromes autistiques ainsi que de modifications comportementales plus ou moins sévères. De plus,cette pathologie est souvent associée à des troubles de la vision. Chez la souris, trois lignées mutantes ont été générées afin d'être au plus près des mutations rencontrées chez l'Homme. L'objectif principale est d'étudier le comportement (activité générale,motricité, apprentissage, mémoire, anxiété, sociabilité) de ces animaux afin de déterminer quel est le modèle (la mutation) le plus proche de l'Homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont importants car cela permettra de valider le modèle animal et de choisir la mutation génétique la plus proche de l'Homme afin de mieux étudier ensuite le neurodéveloppement dans ce modèle et éventuellement de proposer des thérapies comportementales afin de permettre une évolution favorable de ce syndrôme.
Procédures
Les animaux seront soumis à differents tests comportementaux pour étudier leur activité générale; leur motricité, le niveau d'anxiété, le niveau de sociabilité ainsiq ue leur capacité d'apprentissage et de mémorisation
Impact sur les animaux
Le seul effet indésirable potentiel sera le stress que peuvent engendrer certains tests, les animaux étant mis dans un environnement nouveau.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et l'encéphale sera prélevé pour d'éventuelles études in vitro à postériori. En effet, si des modifications comportementales sont enregistrées, il sera peut-être nécessaire d'étudier anatomiquement la structure de l'encéphale. Ce n'est pas parce que le phénotype est non dommageable et que le comportement semble normal qu'il n'y a pas des modifications au niveau anatomique ou cellulaire possibles
Remplacement
Les conséquences de certaines mutations sur le comportement ne peuvent pas être testées in vitro. Les interactions sociales, motivationnelles, les capacités motrices et mnésiques ne peuvent être étudiées que sur l'animal vigile. Afin de s'assurer que les résultats soient transférables à l'humain, les expériences seront menées sur la souris qui est un excellent modèle génétique.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé selon un testde puissance (80%) et d'après notre propre expérience afin d'obtenir des résultats robustes. Cela nous permet d'utiliser le strict minimun d'animaux, cad 20 animaux par groupe. Nous utiliserons les mâles et les femelles car il n'a pas été rapporté de différences comportementales entre sexe dans de précédentes études de ce gène.
Raffinement
L'hébergement sera effectué dans l'animalerie où les conditions d'élévage sont parfaitement définies pour un bienêtre animal. Les tests comportementaux seront effectués entre 9:00 et 17:00, avec un seul test par jour pour limiter le stress. Un suivi quotidien des animaux ( week-end et jours fériés inclus) est effectué soit par les animaliers, soit par l'expérimentateur. Les animaux seront amenés en salle d'expérimentation 30 minutes minimum avant le début du test pour s'habituer à la pièce et diminuer le stress. Les expérimenteurs pourront venir éventuellement le weekend afin de travailler dans des conditions optimales. Les animaux ne seront pas soumis à plus de 3 tests par semaines. Si besoin, suite à une évolution du score de la grille d'évaluation, et en accord avec le vétérinaire de l'institut, des mesures seront prises pour traiter l'animal. L'analyse comportementale sera faite par un système d'analyse vidéo automatique afin d'avoir un bon niveau de raffinement des résultats et de permettre d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Une application stricte des points limites durant toute la vie de l'animal sera mise en place pour ce projet. Dans le test de rotarod, lors d'une session, si l'animal arrive à 300s lors d'un essai, il ne fera pas les essais suivants dans la mesure où il aura atteint la réponse maximale.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. La souris est un excellent modèle génétique afin d'étudier le comportement suite à la mutation des gènes connus chez l'Homme comme impliqués dans notre syndrome. Ces mutations sont maintenant bien identifiées et les animaux sont en élévage chez les prestataires d'élévage. Les tests comportementaux seront effectués sur des animaux adultes permettant ainsi d'avoir une maturité corticale suffisante.
Etude du développement cérébral chez des souris modèle de déficience intellectuelle d’origine génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris utilisées ici portent une mutation qui supprime la protéine RSK2 et reproduit le syndrome de Coffin-Lowry, avec ses retards d'apprentissage et ses déficits de mémoire. 586 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Biopsie de la queue vers sept jours, injections intrapéritonéales de marqueurs de neurogenèse, open-field, rotarod, puis piscine de Morris pendant sept jours à raison de huit essais quotidiens d'une minute de nage, un protocole que le porteur ramène à un stress léger limité aux premières minutes. Soixante reproductrices seront réutilisées pour des travaux pratiques, les autres tuées pour analyser leur cerveau.
Objectifs
Le projet consistera à étudier le développement de certaines structures cérébrales importantes pour la cognition chez une souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry. Les patients atteints de ce syndrome présentent une sévère déficience intellectuelle associée à des retards psychomoteurs qui se mettent en place au cours de l’enfance. Selon des études génétiques, cette pathologie est due à des mutations d’un gène qui conduisent notamment à l’absence d’une protéine appelée RSK2. Pour mieux comprendre les altérations qui se mettent en place lors du développement du cerveau en l’absence de RSK2, nous utilisons des souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry qui n’expriment pas RSK2. Au cours des projets précédents, nous avons montré que ces souris modèles présentent de nombreuses altérations comportementales et cognitives comme des retards d’apprentissage et des problèmes de mémoire. Ceci est en accord avec les signes cliniques observés chez les patients. Pour ce projet, nous souhaitons désormais étudier le développement de certaines structures cérébrales qui sont impliquées dans les altérations comportementales et cognitives identifiées chez la souris modèle. Ces structures cérébrales continuent de se développer après la naissance, au moment où apparaissent les problèmes comportementaux et cognitifs. Ainsi, nous étudierons chez la souris modèle, les altérations cellulaires et moléculaires qui impactent le développement de ces structures cérébrales au cours de la période postnatale. De plus, nous envisageons désormais de mettre en place des stratégies thérapeutiques afin de corriger au plus tôt ces altérations dans le but de compenser, voire d’éviter la mise en place des problèmes cognitifs chez la souris. Nous testerons notamment si un enrichissement comportemental partiel (3h/jour pendant 3 semaines) dès le plus jeune âge peut être bénéfique pour restaurer le retard de développement du cerveau et restaurer les fonctions cognitives à long terme.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux le rôle de la protéine RSK2 dans le développement cérébral et dans les fonctions cognitives. Nous comprendrons notamment pourquoi, en l'absence de RSK2, le développement du cerveau est retardé au cours de la période postnatale, et analyserons plus particulierement le développement postnatal de deux strucutures cérébrales qui sont impactées dans le syndrome de Coffin-Lowry et qui poursuivent leur développement apès la naissance. De plus, pour la première fois, nous testerons une stratégie thérapeutique (enrichissement comportemental) qui devrait permettre de compenser les déficits cognitifs au plus tôt, ou d'éviter leur mise en place. Le modèle animal nous permettra de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Procédures
Pour être génotypés, tous les animaux subiront une biopsie de la queue vers l'âge de 7 jours. Pour le projet, une partie des animaux recevra des injections de marqueurs de neurogenèse. Pour chaque injection, l'animal est maintenu en contention pour effectuer la piqure en intrapéritonéale (durée max 10 secondes). Apres différents délais, ces souris seront euthanasiées afin d'analyser leurs cerveaux. Les prélevements de cerveaux sont réalisés post mortem. Une autre partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée en open-field (duree 20 minutes) et la coordination motrice en rotarod (6 essais sur 3 jours de 3 minutes maximum), ce qui ne génére aucune nuissance. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un leger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 7 jours, à raison de 8 essais par jour (2 blocs de 4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.
Impact sur les animaux
Pour les génotypages, une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors de la biopsie de la queue. Les injections qui nécessitent de prendre l’animal en contention peut générer un stress ponctuel de quelques minutes. Lors des tests de comportement, les souris pourraient ressentir un leger stress pendant les premières minutes.
Devenir
Pour la procédure 1, certains reproducteurs pourront être utilisés pour participer à des études comportementales en travaux pratiques. Il s’agit de tests d'exploration, locomotion, d’apprentissage et de mémoire qui n’engendrent aucun stress chez l’animal et reposent sur les comportements spontanés (eg., openfield, exploration d’objets). Les souris des procédures 2, 3 et 4 seront euthanasiées pour étudier leur cerveau.
Remplacement
Notre problématique de recherche consiste à comprendre les altérations du developpement cerébral impliquées dans la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certains mécanismes pourraient être décrits sur des cultures neuronales, il est ensuite absolument nécessaire de valider le rôle des protéines dans le développement cérébral et dans les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales, d'apprentissage et de mémoire.
Réduction
Le nombre d’animaux correspond aux effectifs nécessaires pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 6-8 souris (analyse de la neurogenèse) à 8-15 souris par groupe (comportement) sont nécessaires. Des tests de puissance seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=5), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé (c'est à dire 8 souris dans chaque lot).
Raffinement
Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre à des tâches d’apprentissage, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et pour les habituer à sa présence. La mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela une grille d'évaluation sera utilisée.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Afin d’étudier le développement cérébral et notamment la formation des neurones qui continuent de se mettre en place au cours des premières semaines après la naissance, toutes les souris utilisées seront âgées de 0 à 60 jours. Il sera nécessaire également d’utiliser quelques embryons pour suivre la mise en place de certaines structures cérébrales qui s’installent au cours de la période embryonnaire. Des analyses de comportement seront également effectuées à l'âge adulte (vers 60 jours) afin de vérifier les effets bénéfiques de nos enrichissements environnementaux sur les fonctions cognitives à long -terme.
Essai de traitement préclinique sur un modèle de déficience intellectuelle et d’autisme liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester si un composé administré par voie orale corrige les déficits comportementaux d'un modèle murin d'autisme et de déficience intellectuelle liés au chromosome X : 64 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une puce RFID implantée sous la peau sous anesthésie gazeuse, avec couverture antalgique, puis un prélèvement de sang à la veine temporo-superficielle. Les épreuves comportementales sont nommées, champ ouvert, labyrinthe en Y et reconnaissance du nouvel objet, et le porteur les décrit comme non invasives, sollicitant "principalement la curiosité et la mémoire de l'animal". Les souris qui perdent 15 à 20 % de leur poids ou qui montrent des signes de douleur, immobilité, poil hérissé, flancs creusés, sont mises à mort avant le terme.
Objectifs
Le projet vise à tester un composé chimique agissant sur des récepteurs des neurones, et dont l’action positiive a déjà été observée sur des modèles d’autisme. Au cours de ce projet on espère restaurer le phénotype comportemental trouvé défaillant chez le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène PTCHD1 par l’administration orale d’un composé chimique. On propose un protocole de caractérisation du modèle murin après un prétraitement et pendant l’administration de cette molécule. Nous allons focaliser notre analyse sur des déficits observés chez ces souris mutantes dans l’activité exploratoire dans le test de champ ouvert, la mémoire de travail dans le labyrinthe en Y et la mémoire de reconnaissance du nouvel objet ; tous ces tests sont non invasifs et sollicent principalement la curiosité et la mémoire de l’animal. Le gène Ptchd1 étant situé sur le chromosome X, seuls les males porteurs de mutation de ce gène développe la maladie. Ici nous réaliserons l’étude uniquement sur des males porteurs ou non de la forme mutée du gène et qui seront soumis ou pas au traitement.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous allons progresser dans la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires, associés à des retards mentaux et aussi pouvoir peut-etre proposer une molécule thérapeutique.
Procédures
Implantation d’une puce RFID par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse et avec une couverture antalgique (durée 30 minutesmaximum); un prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes)
Impact sur les animaux
L’injection de la puce RFID sous la peau et le prélèvement sanguin à la veine temporo-superficielle peuvent entrainer un stress ou une brève douleur chez l’animal
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour prélèvement d’échantillons
Remplacement
La souris est la seule espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. Il n’existe pas de méthodes alternatives pour observer l’effet de médicaments sur des processus comportementaux et mnésiques intégrés. Seul l’évaluation sur des animaux vivants conduit à conclure sur l’efficacité d’un traitement améliorant l’apprentissage et la mémoire. Nous savons déjà que le modèle de souris utilisé dans cette étude montre des déficits d’apprentissage dans les tests envisagés. Cette étude requiert ainsi l’utilisation d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Le nombre de 16 Individus par groupe a été estimé en fonction des expériences conduites précédemment et pour atteindre des résultats exploitables de manière statistique dans le cadre d’expérience d’évaluation comportementale. Pour avoir une bonne puissance du test statistique, un maximum de 16 animaux par génotype et par traitement est requis. Il prend en compte le fait qu’un petit nombre d’individus (1-3 par lots) pourrait ne pas faire les tests d’apprentissage. Par ailleurs, le gène PTCHD1 est porté par le chromosome X. Sa mutation a seulement des conséquences dans le sexe mâle chez l’homme. Aussi les traitements et les tests de comportement ne s’effectueront que sur les mâles, sexe dans lequel se déclare la maladie chez l’homme, et dans lequel on détecte les déficiences chez la souris.
Raffinement
Les animaux sont suivis pour des signes de douleur (immobilité, aspect rouge ou gonflé au niveau de l’insertion de la puce, traces de griffure ou de morsure, respiration difficile, hérissement du poil, attitude voûtée, déshydratation et flancs creusés). L’implantation de la puce RFID se fera sous anesthésie gazeuse et avec une couverture antalgique, suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Les animaux en souffrance ou présentant des signes de perte de poids (15 à 20%), seront mis à mort par un gradient progressif de CO2. Néanmoins nous n’attendons pas d’observer de tels effets avec ce composé et ce protocole qui a déjà été conduit dans un autre contexte de maladie génétique sans nuissance détectée sur le bien-être des animaux. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont très développées. La nécessité d'utiliser des animaux transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les animaux seront testés à l’âge adulte (8-11 semaines) après un traitement commencé à 6 semaines afin d’étudier des jeunes adultes capables de réaliser les tests cognitifs et restant dans un âge proche de celui dans lequel la maladie est observée et quantifié chez l’homme.
Etablissement d’une corrélation entre le génotype, la morphologie synaptique, la structure cérébrale et les déficits cognitifs de deux modèles murins porteurs de mutations associées chez l’Homme à de la déficience intellectuelle.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privées d'eau en dehors de dix minutes par jour du lundi au vendredi pour être "motivées" aux tests d'apprentissage, 135 souris mâles passent trois épreuves comportementales pendant quatre mois. 244 souris sont utilisées au total, 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 64 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Le porteur écrit qu'il y a "très peu d'effets indésirables attendus" et que les tests se font "sans aucune douleur ni peur induite", tout en précisant que la biopsie de queue et le tatouage des pattes sont pratiqués à sept jours sans sédation, au motif que "la nociception n'est pas encore opérationnelle" à cet âge. 100 souris sont déclarées réutilisées, les femelles gardées pour la reproduction restant en vie, les autres étant tuées, les mâles après les tests, l'apprentissage ayant selon lui "probablement modifié de nombreux paramètres cérébraux".
Objectifs
La déficience intellectuelle affecte entre 2 et 3 % de la population et de nombreuses mutations ont été identifiées dans plus de 300 gènes chez les patients. Dans ce contexte, nous nous intéressons particulièrement à un gène situé sur le chromosome X pour lequel une trentaine de mutations différentes ont été rapportées chez l’Homme. Toutes ces mutations mènent toujours à de la déficience intellectuelle (DI) mais aussi à une grande variété de traits physiques ou neuropsychiatriques associés, souvent différents d’un patient à un autre. De nombreux patients présentent par exemple des défauts morphologiques du cerveau et du cervelet (plus gros ou plus petits que la moyenne) ou des structures mal formées. Afin de pouvoir proposer des stratégies thérapeutiques adaptées, il est nécessaire de comprendre cette diversité de signes cliniques. Nous souhaitons donc comparer deux modèles souris qui portent deux mutations différentes d’un même gène. L’une d’entre elle est responsable d’une déficience intellectuelle modérée à sévère sans autre trait clinique, alors que la seconde mutation est responsable d’une déficience sévère associée à des traits autistiques, de l’anxiété, de l’auto-agressivité et des anomalies morphologiques du cerveau. Nous analyserons les différences observées au niveau des capacités d’apprentissage et de mémoire de ces animaux ainsi que les différences morphologiques du cerveau observées par IRM et par microscopie électronique (structure très fine des neurones).
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la déficience intellectuelle et des défauts neurologiques associés, les approches thérapeutiques sont assez rares. Il est cependant communément admis qu’une médecine personnalisée est nécessaire afin d’adapter l’approche thérapeutique à chaque cas individuel au vu de la diversité des tableaux cliniques observés. Ce projet nous permettra de faire une véritable étude comparative de deux modèles souris aussi bien au niveau des défauts d’apprentissage et de mémoire qu’au niveau de l’organisation structurelle du cerveau. Cette étude nous permettra d’établir une corrélation précise entre les défauts que nous observons in vitro, les défauts cellulaires ou tissulaires et les défauts d’apprentissage…. Nous pourrons donc mieux comprendre le rôle de notre protéine d’intérêt dans le fonctionnement « normal » du cerveau ainsi que les défauts provoqués par les mutations décrites chez les patients. Nous avons pour but de mieux définir quelques paramètres (capacités d’apprentissage, morphologie de certaines zones du cerveau) qui pourraient nous permettre d’évaluer facilement dans le futur l’efficacité thérapeutique de nouvelles approches, pharmacologiques par exemple.
Procédures
Tous les animaux subissent une biopsie de queue à l'âge de 7 jours afin de réaliser le génotypage. Ainsi les animaux mâles peuvent être répartis en mélangeant les deux génotypes au sein d'une même cage au moment du sevrage. Les animaux mâles seront manipulés pour réaliser les tests d'apprentissage. Nous avons prévu de réaliser 3 tests comportementaux distincts, chacun étant effectué sur un lot de 45 souris (total de 135 souris) et pendant une durée maximale de 4 mois. Ces tests comportementaux nécessitent une restriction hydrique pour que les animaux soient motivés pour réaliser le test. Les souris ont cependant de l’eau à volonté pendant 10 minutes par jour à la fin des essais quotidiens et les biberons d’eau sont remis à disposition chaque vendredi et ré-enlevés le dimanche midi. Une partie des animaux sera anesthésiée à l'âge adulte en vue d'une chirurgie terminale qui a pour but le prélèvement post-mortem du cerveau et son étude anatomique.
Impact sur les animaux
Il y a très peu d’effets indésirables attendus chez les animaux. Les tests comportementaux sont réalisés sans aucune douleur ni peur induite. La seule nuisance légère est la restriction hydrique qui est nécessaire pour garantir un bon niveau de motivation des souris pour les tests cognitifs. Pendant cette période, les biberons sont mis à disposition pendant 10 minutes par jour du lundi au vendredi et pendant toute la journée les samedis et dimanches. En ce qui concerne les lots d’animaux qui seront utilisés pour l’analyse morphologique du cerveau, la chirurgie terminale est réalisée après administration d’analgésique et d’anesthésique. En accord avec notre vétérinaire référent, le prélèvement de queue pour réaliser le génotypage ainsi que l'identification par tatouage des pattes sont réalisés de façon précoce (à 7 jours) sans sédation car le système neurologique se met à peine en place et la nociception n’est pas encore opérationnelle. »
Devenir
A l'issue de la procédure de génotypage, les femelles pouvant servir à la reproduction sont maintenues en vie et celles qui ne peuvent pas être utilisées seront mises à mort. Tous les mâles seront maintenus en vie pour réaliser les tests comportementaux à l’âge adulte ou pour faire partie de l’étude morphologique du cerveau. A l'issue des tests comportementaux, les animaux seront mis à mort car ils ne pourront pas être réutilisés dans une autre étude, les tests d'apprentissage ayant probablement modifié de nombreux paramètres cérébraux. Les analyses morphologiques fines du cerveau nécessitent la fixation des tissus et donc la mise à mort des animaux.
Remplacement
Nous ne pouvons pas analyser la microcéphalie, l’agénésie du corps calleux ou encore l’impact d’une mutation sur les capacités cognitives sans modèle animal ; Aucune expérience in vitro ne peut donner des informations équivalentes. En revanche, toutes les étapes de caractérisation des défauts biochimiques et cellulaires induits par ces mutations sont réalisées au préalable dans des études in vitro (activité enzymatique de la protéine, interactions protéiques avec les partenaires, morphologie et migration cellulaires). Nous conservons l’utilisation des modèles animaux uniquement pour les analyses plus intégrées de type comportement.
Réduction
Pour la procédure des tests comportementaux, sur la base des études publiées et de notre expérience, nous avons estimé à 10 le nombre minimum d’animaux nécessaires par génotype dans chaque groupe (deux génotypes mutés et un groupe de WT issus des deux lignées). Avec ces premiers résultats, nous effectuerons un test de puissance afin de savoir si nous devons augmenter le nombre de souris à 12 puis à 15. Pour l’analyse, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons (
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont visités quotidiennement par l’équipe de zootechnie. Les évaluations des fonctions cognitives ne nécessitent pas d’isolement des animaux, sauf au moment de la tache comportementale. Afin de s’assurer que la restriction hydrique nécessaire n’altère en rien leur santé et leur bien-être, chaque souris est pesée et évaluée chaque jour à l’aide d’une grille individuelle d’observation. Sur cette grille, différents items (apparence, hydratation, poids …) sont scorés. Les performances cognitives des souris pouvant être altérées par un mal-être, si le score total dépasse 5, l’animal est retiré des tests et sa restriction hydrique est terminée.
Choix des espèces
La souris possède un génome relativement identique à celui de l’homme, les mécanismes moléculaires et cellulaires sont similaires, ainsi que de très nombreux mécanismes cognitifs. Par ailleurs, cet animal permet des approches génétiques puissantes. Enfin, les spécificités de notre gène dont deux variants sur quatre n’existent que chez les mammifères nous obligent à choisir comme modèle animal une espèce mammifère. De plus, la transgenèse permettant de reproduire les mutations humaines n’existe actuellement que chez la souris. Nous utiliserons uniquement des souris adultes. Les tests cognitifs commencent lorsque les animaux ont 2,5 mois. Nous cherchons dans un premier temps à corréler les défauts cognitifs au génotype et aux altérations morphologiques du cerveau observées après les étapes de développement. Les animaux utilisés pour l'analyse morphologique du cerveau seront âgés également de 2 à 3 mois.
Impact de mutations humaines du gène GRID1 associées à une déficience intellectuelle sur les propriétés anatomiques et fonctionnelles du cerveau de souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour reproduire des mutations humaines du gène GRID1 liées à une déficience intellectuelle, 324 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles, les 24 autres étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux de trente à quarante-cinq minutes, un prélèvement de liquide céphalorachidien, un prélèvement sanguin et une amputation de deux millimètres de queue pour génotypage, toutes étant tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit une perte de poids et une douleur de vingt-quatre à quarante-huit heures après chirurgie, ainsi qu'un risque de détresse respiratoire ou d'arrêt cardiaque sous anesthésie, et qualifie ces chirurgies d'"indispensables" à son projet. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour éviter, écrit-il, la souffrance qu'entraînerait leur réveil après la ponction de liquide céphalorachidien.
Objectifs
Les protéines impliquées dans la communication entre les neurones jouent un rôle important dans le fonctionnement du cerveau, et des mutations humaines de ces protéines sont associées à la schizophrénie et à l'autisme. Il a récemment été identifié des mutations de ces protéines liés à une déficience intellectuelle avec paraplégie spastique, avec ou sans glaucome. L'expression de ces mutants dans des cultures neuronales de souris entraîne une altération de la physiologie du neurone et des connexions entre neurones. Il a également été généré une lignée de souris mutantes comportant une de ces mutations. Ce projet vise à : i) caractériser les altérations de ces souris mutantes aux niveaux neurophysiologiques, neurochimiques, anatomiques et génomiques afin de les comparer aux altérations observées par nos collaborateurs chez les patients humains, ii) caractériser l’impact de l’expression à l’âge adulte des récepteurs mutants susmentionnées sur les propriétés anatomiques et électrophysiologiques des neurones de souris sauvages pour en distinguer les effets aigus des effets neurodeveloppementaux. Ce projet permettra de caractériser les signatures pathologiques et les processus physiopathologiques liés aux mutations humaines de ces récepteurs.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des pathologies liées aux variants des récepteurs du glutamate chez l’humain (schizophrénie, autisme, déficience intellectuelle, paraplégie spastique) et à identifier des cibles pour de futures thérapies visant à les soigner.
Procédures
Les animaux subiront une des trois interventions suivantes : 1) Prélèvement sanguin sur animaux adultes de 2 mois sous anesthésie générale gazeuse et sous anesthésie locale. Cette procédure dure 5-10 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 2) Prélèvement de liquide céphalorachidien sur animaux adultes de 2 mois sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 3) Injections intracérébrales de vecteurs viraux sur animaux de 4-6 semaines sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4-6 semaines après l’injection, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire (15 min).4) Prélèvement caudal (2mm de long) à des fins de genotypage durée : 15min
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent d’exprimer les récepteurs d’intérêt à l’âge adulte dans des régions cérébrales spécifiques afin d’en distinguer les effets aigus et locaux des effets neurodeveloppementaux ou indirects. Durant les phases d’anesthésie, les animaux pourraient subir un stress thermique, une détresse respiratoire ou un arrêt cardiaque. Pour les besoins de genotypage, les souris subiront un prélèvement caudal qui pourrait causer un stress ou une douleur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques génomiques, anatomiques et fonctionnelles du tissu cérébral, soit afin de valider le protocole de prélèvement post-mortem du liquide céphalorachidien, soit encore afin d’éviter la souffrance au réveil après prélèvement du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale.
Remplacement
Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude de l’impact sur les structures et les fonctions cérébrales d’une mutation bi-allélique responsable de déficience intellectuelle et de paraplégie spastique chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été calculé considérant l’expérience des utilisateurs de l’équipe en chirurgie, électrophysiologie, histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire et des données de la littérature, et sur la base d’un seuil de significativité et d’un calcul de puissance. Compte tenu de l’expérience des utilisateurs de l’équipe et des taux de succès indiqués dans la littérature, le nombre d’animaux utilisés a été réduit aux besoins minimaux d’apprentissage et de test et à la détection d’une différence significative entre les souris sauvages et mutantes. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nbre total d'animaux:324
Raffinement
Les animaux sont hébergés en accord avec la directive 2010/63/EU . Ils sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. Ils sont visités chaque jour. Ils seront acclimatés 5 à 7 jours dans la zone d’hébergement et manipulés chaque jour pour réduire le stress le jour de la procédure. Pour les procédures avec chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les points limites seront : a) une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire, b) modification du comportement caractéristique d'une douleur, détresse ou souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté), c) perte de poids supérieure ou égale à 20 pour cent. Une pesée sera effectuée avant l’anesthésie puis quotidiennement pendant 3 jours après. Les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une dose létale d’euthanasiant. L’euthanasie des animaux par décapitation, exsanguination ou injection d’une dose létale d’euthanasiant sera effectuée par une personne experte.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation du récepteur du glutamate liée à un syndrome associant pathologie nerveuse centrale et périphérique. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Des animaux adultes seront utilisés afin d’évaluer l’impact sur l’animal de la mutation du récepteur du glutamate et de comparer les altérations biochimiques et génomiques avec celles observées par nos collaborateurs sur des patients adultes porteurs de cette mutation et sur des neurones corticaux matures issus de cellules souches pluripotentes humaines portant la même mutation. Des animaux de 4 semaines seront utilisés afin de permettre l’expression des transgènes par les vecteurs viraux (4 à 6 semaines) avant de réaliser les expériences sur les animaux d’âge adulte.
Etude d’un modèle murin d’autisme et de déficience intellectuelle (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter une mutation liée à l'autisme, elles sont génotypées, une partie des femelles gestantes tuée pour prélever les embryons et d'autres perfusées sous anesthésie terminale, pour caractériser l'effet de cette mutation sur le développement du cerveau. Le porteur signale que la lignée présente un "phénotype dommageable", avec une mort subite entre quatre et six mois sans signe annonciateur, un poids réduit et un cœur plus petit. Il affirme que seule une étude in vivo permet d'identifier l'effet de la mutation et qu'aucun autre modèle ne reproduit la maladie.
Objectifs
La mise en place des connections entre les neurones (synapses) sont des évènements critiques pour le développement et la fonction du cerveau. Nous travaillons sur un gène qui est essentiel pour le développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Ce gène est un nouveau gène à risque pour l’autisme et la déficience intellectuelle. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles du spectre autistique. Pour mieux comprendre l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo permettra d’identifier comment elle perturbe le développement normal du cerveau. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de cette mutation. Nous allons caractériser cette souris d’un point de vue morphologique et comportemental. De telles connaissances seront essentielles pour mieux comprendre les étapes du développement neuronal perturbés par la mutation, qui pourraient expliquer l’autisme et la déficience intellectuelle des patients. Cela permettra d’améliorer la prise en charge médicale des patients et d’identifier des cibles thérapeutiques pour cette pathologie pour laquelle il n’existe aucun traitement. Le but du projet est de comprendre si les problèmes de comportement et d’apprentissage observés chez les patients sont dus à l’impact de la mutation sur le développement neuronal embryonnaire qui aboutirait à des connections neuronales non fonctionnelles. Ce projet se déroulera dans deux Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Le modèle transgénique que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine de l’autisme. C’est le premier modèle de cette pathologie particulière. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de la mutation identifiée chez les patients sur le développment neuronal embryonnaire et chez l’adulte. Personne ne connait les étapes du développement du système nerveux affectées par cette mutation. Une meilleure compréhension de l’effet de cette mutation aura un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients et sur la recherche de cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux en élevage seront soumis uniquement à un tatouage pour identification et une biopsie pour génotypage. Une observation approfondie de leur bien-être sera réalisée. Types d'interventions auxquels seront soumis certains animaux: i) isolement temporaire des mâles (maximum 3 semaines). Leur environnement sera enrichi (coton, cabane) pour diminuer leur inconfort; ii) prélèvements d'embryons avec mise à mort de la femelle gestante. Cela concerne 210 femelles; iii) perfusion sanguine réalisée sous anesthésie terminale. Cela concerne 84 animaux.
Impact sur les animaux
Cette lignée nouvellement créée présente un phénotype dommageable. En effet, nous avons observé une mort subite chez ces animaux, dont nous ne connaissons pas la cause. Cette mort subite intervient entre 4-6 mois d'âge, mais les animaux ne présentent aucun signe avant-coureur permettant de prédire leur décès. On peut noter que les souris ont un poids inférieur à la normale, ainsi qu'un coeur plus petit. Pour les gestations datées, les mâles seront isolés de façon temporaire (maximum 3 semaines).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront transférés sur les sites d'expérimentation. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés, car nous prélèverons des organes afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 1200 souris sur une période de 5 ans, ce qui représente le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux produits et non-utilisés.
Raffinement
Les souris seront hébergées selon la règlementation obligatoire. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement , ce qui permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, tous les gestes techniques seront réalisés par un personnel formé. Les animaux que nous allons perfuser recevront d'abord une anesthésie générale.
Choix des espèces
Seuls les modèles murins génétiquement modifiés permettent de cibler l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous étudierons ce modèle du stade embryonnaire tardif jusq'à l'adulte
Etude d’un modèle murin d’autisme et de déficience intellectuelle (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet étant mené dans le second établissement du même projet. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles sont génotypées, une partie des femelles gestantes tuée pour prélever les embryons et d'autres perfusées sous anesthésie terminale, pour caractériser l'effet de cette mutation sur le développement cérébral. Le porteur signale un "phénotype dommageable" avec mort subite entre quatre et six mois, poids réduit et cœur plus petit. Il affirme que seule une étude in vivo identifie l'effet de la mutation et qu'aucun autre modèle ne reproduit la maladie.
Objectifs
La mise en place des connections entre les neurones (synapses) sont des évènements critiques pour le développement et la fonction du cerveau. Nous travaillons sur un gène qui est essentiel pour le développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Ce gène est un nouveau gène à risque pour l’autisme et la déficience intellectuelle. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles du spectre autistique. Pour mieux comprendre l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo permettra d’identifier comment elle perturbe le développement normal du cerveau. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de cette mutation. Nous allons caractériser cette souris d’un point de vue morphologique et comportemental. De telles connaissances seront essentielles pour mieux comprendre les étapes du développement neuronal perturbés par la mutation, qui pourraient expliquer l’autisme et la déficience intellectuelle des patients. Cela permettra d’améliorer la prise en charge médicale des patients et d’identifier des cibles thérapeutiques pour cette pathologie pour laquelle il n’existe aucun traitement. Le but du projet est de comprendre si les problèmes de comportement et d’apprentissage observés chez les patients sont dus à l’impact de la mutation sur le développement neuronal embryonnaire qui aboutirait à des connections neuronales non fonctionnelles. Ce projet se déroulera dans deux Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Le modèle transgénique que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine de l’autisme. C’est le premier modèle de cette pathologie particulière. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de la mutation identifiée chez les patients sur le développment neuronal embryonnaire et chez l’adulte. Personne ne connait les étapes du développement du système nerveux affectées par cette mutation. Une meilleure compréhension de l’effet de cette mutation aura un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients et sur la recherche de cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux en élevage seront soumis uniquement à un tatouage pour identification et une biopsie pour génotypage. Une observation approfondie de leur bien-être sera réalisée. Types d'interventions auxquels seront soumis certains animaux: i) isolement temporaire des mâles (maximum 3 semaines). Leur environnement sera enrichi (coton, cabane) pour diminuer leur inconfort; ii) prélèvements d'embryons avec mise à mort de la femelle gestante. Cela concerne 210 femelles; iii) perfusion sanguine réalisée sous anesthésie terminale. Cela concerne 84 animaux.
Impact sur les animaux
Cette lignée nouvellement créée présente un phénotype dommageable. En effet, nous avons observé une mort subite chez ces animaux, dont nous ne connaissons pas la cause. Cette mort subite intervient entre 4-6 mois d'âge, mais les animaux ne présentent aucun signe avant-coureur permettant de prédire leur décès. On peut noter que les souris ont un poids inférieur à la normale, ainsi qu'un coeur plus petit. Pour les gestations datées, les mâles seront isolés de façon temporaire (maximum 3 semaines).
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront transférés sur les sites d'expérimentation. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés, car nous prélèverons des organes afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 1200 souris sur une période de 5 ans, ce qui représente le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux produits et non-utilisés.
Raffinement
Les souris seront hébergées selon la règlementation obligatoire. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement , ce qui permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, tous les gestes techniques seront réalisés par un personnel formé. Les animaux que nous allons perfuser recevront d'abord une anesthésie générale.
Choix des espèces
Seuls les modèles murins génétiquement modifiés permettent de cibler l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous étudierons ce modèle du stade embryonnaire tardif jusq'à l'adulte
Etude pilote pour évaluer le phénotype d’une lignée de souris porteuses d’une mutation humaine du gène TAF8
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent une mutation humaine du gène TAF8 associée à une déficience intellectuelle, et sont génotypées par rognage de phalanges avant l'âge de dix jours puis observées jusqu'à seize semaines. Le porteur n'attend aucun effet indésirable mais surveille l'alimentation et d'éventuelles crises d'épilepsie chez les nouveau-nés. Il présente cette étude pilote comme un préalable qu'il juge impossible à remplacer, seize souris étant conservées jusqu'à seize semaines et les autres tuées au sevrage.
Objectifs
L'initiation de la transcription par l'ARN polymérase II (Pol II) est contrôlée par l'assemblage séquentiel des facteurs généraux de transcription (GTF) au niveau des promoteurs. TFIID est le premier GTF à se lier au promoteur. Chez les métazoaires, TFIID est composé de la protéine de liaison à la boîte TATA (TBP) et de 13 facteurs associés à TBP (TAFs). Il est intéressant de noter que si de nombreuses cellules ont besoin du complexe TFIID canonique, d'autres sont moins affectées par la déplétion de certaines sous-unités TAFs. Le développement du système neuronal requiert particulièrement la présence de TFIID, car des mutations dans les gènes codant pour les sous-unités TFIID ont été associées à des troubles neurologiques et à une déficience intellectuelle chez des patients humains. Chez la souris, la perte de fonction de Taf8 est létale au stade de l'implantation [1]. Nous avons récemment identifié une mutation homozygote (c.781-1G>A) du site d'épissage de TAF8 (intron7/exon8) chez une patiente présentant une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie [2]. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation. Des analyses effectuées sur des fibroblastes dérivés de cette patiente ont montré de façon surprenante que, bien que la protéine TAF8 mutante ne soit pas détectable et que l'assemblage du TFIID soit altéré, la transcription par la Pol II n'est pas significativement affectée. D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été identifiés (données non publiées de nos collaborateurs): tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilepsie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez ces patients. Le but général de notre projet est d'analyser les conséquences moléculaires de cette mutation humaine au cours du développement et de la différenciation mais aussi d'étudier le phénotype comportemental en utilisant la souris comme modèle (mutation Taf8H). Dans un premier temps, nous souhaitons valider l'absence de phénotype dommageable des souris homozygotes adultes avant d'initier dans un deuxième temps un projet d'analyse comportementale. [1] doi.org/10.1242/dev.127.24.5449 [2] doi.org/10.1093/hmg/ddy126
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet préliminaire qui nous permettra de confirmer l'absence de phénotype dommageable chez les souris homozygotes Taf8H/H. Une fois, l'absence de phénotype dommageable avérée, nous soumettrons une autre saisine pour l'analyse des capacités intellectuelles des animaux mutants. A terme, ces projets apporteront des connaissances fondamentales sur le fonctionnement de la transcription et permetteront de mieux comprendre la cause de déficiences intellectuelles chez l'homme.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés par rognage de phalanges avant l'âge de 10 jours.
Impact sur les animaux
La patiente qui a été étudiée au laboratoire présente une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation (âgée de 4,5 ans au moment de l'étude). D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été récemment identifiés (données non publiées de nos collaborateurs). Tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilespie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez deux des trois patients. Aucun effet indésirable n'est attendu chez les animaux Taf8H/H mais une attention sera portée au suivi de l'alimentation et à l'occurence éventuelles de crises d'épilepsie chez les nouveaux nés et du développement moteur.
Devenir
Le but de cette saisine est l'observation des animaux de leur naissance jusqu'à 16 semaines qui correspond à l'âge maximal prévu pour les analyses futures. Tous les animaux seront génotypés mais seules 8 souris Taf8H/H et 8 souris contrôles (+/+ ou H/+) seront conservées pour l'observation jusqu'à l'âge de 16 semaines: les autres souris seront euthanasiées au moment du sevrage. les animaux suivis seront eux euthanasiés à 16 semaines.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de vérifier qu'une mutation à l'état homozygote n'induit pas de phénotype dommageable ou affectant le bien être des souris, avant d'initier un projet d'analyse comportementale. Il n'est donc pas possible de remplacer ces animaux.
Réduction
Le nombre de 6 portées minimum pour obtenir au moins 8 animaux Taf8H/H homozygotes a été choisi pour nous assurer de l'absence de phénotype. Les mêmes animaux seront analysés tout au long de leur vie (naissance jusqu'à 16 semaines) pour minimiser le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Le but de cette saisine est de vérifier que la mutation Taf8H à l'état homozygote ne provoque pas de phénotype dommageable, même si aucun problème n'est attendu puisque les patients humains sont viables et se caractérisent principalement par une déficience intellectuelle. L'élevage des animaux sera fait par un personnel compétent dans des conditions du respect du bien être animal, par du personnel compétent sensibilisé à la possibilité de l'apparition d'un phénotype délétère chez les mutants. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux. A la naissance, la capacité d'alimentation de tous les souriceaux sera évalué par la présence de lait dans l'estomac. L'état des animaux sera évalué 3 fois par semaine (propreté, déplacement, vivacité et posture) jusqu'à l'âge de 16 semaines. En cas de souffrance animale, l'avis du vétérinaire sera démandé pour une éventuelle action avant euthanasie si aucune solution ne se présente.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser une mutation découverte chez l'homme et associée à des problèmes cognitifs. La souris est un modèle de choix qui nous permettra de dériver des lignées cellulaires utiles pour les études moléculaires in vitro tout en analysant le développement du système nerveux et le comportement des animaux mutants. Le but de cette saisine est de nous assurer de l'absence de phénotype délétère chez les homozygotes: les animaux seront donc observés de la naissance jusqu'à 16 semaines où ils seront euthanasiés.
Thérapie génique du syndrome de la déficience intellectuelle par sonoporation
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à modéré. Elles subissent l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés et microbulles jusqu'à trois fois, des séances d'imagerie et, pour 380 d'entre elles, une perfusion intracardiaque mortelle, afin de tester une thérapie génique du syndrome du X fragile. Le porteur indique que la sonoporation pourrait endommager le cerveau si les paramètres ne sont pas adaptés, risque qu'il estime inférieur à 10 % d'après le projet précédent. Il décrit la souris FMR1KO comme le modèle le plus proche de la maladie et juge le recours à l'animal "fondamental" pour étudier l'effet à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Le syndrome du X fragile est une maladie génétique héréditaire où l'expression de la protéine FMRP, codée par le gène FMR1, est fortement inhibée. Cette protéine a un rôle très important de transport et de transcription des ARN messager dans les cellules neuronales et les astrocytes. Son absence dans cette maladie provoque un déficit intellectuel et des troubles du comportement. Il n'existe pas de thérapie à l'heure actuelle, les seuls traitements étant symptomatiques. Ce projet vise à proposer une nouvelle stratégie thérapeutique par thérapie génique, c'est-à-dire en réexprimant la protéine manquante dans la maladie, ici FMRP, via l'expression d'un transgène. Si la thérapie génique a déjà fait ses preuves dans de nombreuses pathologies, aucune n'a pour l'instant été approuvé pour des maladies génétiques cérébrales. Cela est dû à la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui bloque le passage du sang vers le cerveau de la quasi-totalité des vecteurs ou molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous proposons de passer la BHE grâce à l'utilisation d'ultrasons focalisés associés à des microbulles de gaz, ces ultrasons faisant osciller les microbulles, provoquant l'ouverture de la BHE. Nous avons plusieurs objectifs dans ce projet. Nous souhaitons tout d’abord évaluer la sécurité, la reproductibilité et l'efficacité du passage dans le cerveau de vecteurs via des ultrasons focalisés combinés à des microbulles de gaz. Cette technique est connue sous le nom de sonoporation. Un second objectif dans ce projet consiste à analyser la biodistribution des molécules de vecteurs ainsi que des microbulles après la procédure de sonoporation. Nous souhaitons également suivre le niveau d’expression du vecteur dans le cerveau en fonction du temps. Enfin, nous souhaitons comprendre comment la restauration de l’expression du gène FMR1 peut modifier la communication neuronale et le comportement de la souris FMR1KO. Cela afin d'évaluer le potentiel de cette technique de thérapie génique pour traiter le syndrome du X fragile, dont les souris FMR1KO sont le modèle le plus proche et le plus utilisé. Ces souris sont génétiquement modifiées pour interrompre l'expression du gène FMR1 (dit Knock-out, ou KO pour le gène FMR1), reproduisant par conséquent plusieurs des phénotypes du syndrome du X fragile, dont les troubles de la sphère sociale et cognitive. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal apporté par ce projet sera la mise en place d’une preuve de concept d’un protocole de thérapie génique du syndrome du X fragile. Nous seront alors capable de faire exprimer un transgène dans le cerveau de manière sûre, reproductible et efficace pour restaurer les fonctions cognitives dans un modèle murin du syndrome du X fragile. Le syndrome du X fragile étant une maladie génétique qui provoque principalement une déficience intellectuelle. Cette avancée pourrait permettre dans le futur une avancée clinique pour le traitement de maladies cérébrales d’origine génétique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures de transfert de gène assisté par sonoporation, exclusivement sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être subite jusqu’à 3 fois par animal. Ils seront également soumis à des procédures d'imagerie échographique, photoacoustique, et optique, non-invasive et réalisées sous anesthésie, durant 15 à 30 minutes, cette procédure pourra être répété jusqu’à 3 fois par semaine pendant 3 semaine suivant la procédure de sonoporation. Jusqu’à 380 souris pourront également être soumises à une procédure de chirurgie pour la perfusion intracardiaque nécessaire à la procédure d’immunohistochimie, intervention qui ne pourra être subite qu’une fois car il s’agit d’une mise à mort, le décès de l'animal par arrêt cardiaque est constaté au bout de 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les seules nuisances attendues sont celles apportées par les injections et l'insertion du cathéter, ainsi que celles liées à l'anesthésie. Une simple gêne est ainsi induite au réveil au niveau de l'injection. Aucune nuisance liée à la sonoporation n’est attendue dans les conditions normales, cependant des dommages dans le cerveau pourraient être possibles dans le cas où les paramètres de la procédure ne seraient pas adaptés (de pression acoustique ou de dose d'Evans Blue principalement). Ces paramètres ont déjà étés déterminés sur le précédent projet sur des souris Balb/c et seront affinés de manière expérimentale, dans ce précédent projet cette nuisance n'est parvenue que dans moins de 10% des cas et nous estimons ce risque encore plus faible dans ce projet maintenant que nous avons gagné en expertise sur cette procédure.
Devenir
À la suite de la procédure de sonoporation, seuls les animaux devant être analysé ex vivo en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires seront mis à mort afin de prélever leur cerveau. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour suivre l'efficacité de transfection ou suivre le comportement. Les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la suite de la procédure de comportement, les animaux pourront également être réutilisés une fois maximum pour suivre la procédure de sonoporation, à condition de l'absence de signes de souffrance et de l'absence d'expression du transgène. À la fin du projet, ils seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé afin d'être analysé en immunohistochimie ou avec d'autres analyses moléculaires.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental afin d'étudier l'impact de nos protocoles de thérapie génique au niveau de l'organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. De plus des études comportementales valideront l'efficacité du protocole thérapeutique, celles-ci ne peuvent être réalisées que chez l'animal vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum la quantité d'animaux utilisés des études in vitro ont été menées en amont du projet pour valider la technologie. En effet nous avons pu valider in vitro les propriétés de nos microbulles. Les caractéristiques de taille, de concentration et de formulation sont contrôlées au laboratoire, aucune toxicité n'a été observée sur ces agents lors des tests in vitro sur culture de cellules ou in vivo sur la souris WT (Wild-Type, c'est à dire des souris non modifiées génétiquement). Dans notre projet, un contrôle interne est présent dans chacune de nos expériences de sonoporation, nous permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux. En effet seule la partie du cerveau visée par les ultrasons focalisés exprimera le transgène, par conséquent les autres parties du cerveau serviront de contrôle négatif. Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Uniquement les expériences pertinentes seront répétées avec des animaux de groupes équivalents.
Raffinement
Les procédures seront réalisées sous anesthésie. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées par groupe de 5 maximum, avec de la nourriture, de l'eau, de la litière ainsi qu'un enrichissement de leur milieu afin de leurs assurer de bonnes conditions de vie. Afin de s'assurer de leur bien-être, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent. Une grille de score clinique sera renseignée pour les animaux en cours d'expérimentation prenant en compte l'aspect, le poids, et le comportement / la mobilité de l'animal. Des points limites seront mis en place si des animaux atteignent un point limite, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant une bonne représentation des phénotypes et a une similitude génétique importante avec l’Homme. De plus grâce à la faible épaisseur de son crâne, la souris est un bon modèle pour les études d’ultrasons thérapeutique dans le cerveau. Les outils génétiques développés chez la souris ont permis de générer la souris C57BL/6 Fmr1 KO, qui est le modèle le plus proche de la pathologie humaine. Il en reproduit plusieurs des phénotypes et c'est le modèle le plus utilisé pour étudier les phénotypes du syndrome du X fragile. Il s’agit du premier modèle à étudier avant de pouvoir passer à une étude sur de plus gros animaux. Ces souris ont un trouble de la sphère sociale et cognitive avec notamment de l'hyperactivité. Ce phénotype n'est pas dommageable car il ne génère aucune douleur et ces souris n'ont aucun problème pour se nourrir ou se reproduire. Nous utiliserons les souris au stade de jeunes adultes (8-10 semaines) où le comportement est supposé être stabilisé, et à un stade plus jeune (3-4 semaines). Cela nous permettra de déterminer l'efficacité de notre protocole à rétablir le phénotype sauvage à un stade avancé du développement et étudier le bénéfice d'un traitement au début du développement. En effet le syndrome du X fragile étant une maladie neurodéveloppementale nous voulons voir si la restauration du phénotype sera plus importante sur des souris jeunes.
Caractérisation des effets de la mutation dup24 du gène ARX sur le développement du cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
210 souris femelles gestantes vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures classees legeres. Chacune recoit une injection de BrdU a un stade de gestation defini, puis est tuee par dislocation cervicale entre deux et quarante-huit heures plus tard, ses embryons etant extraits et decapites pour etudier le developpement des neurones. Le porteur qualifie le phenotype de ces souris de non dommageable et presente la seule injection comme indolore, la gravite tenant a la mise a mort des meres et des embryons. Il affirme qu'aucune etude in vitro n'est possible, le gene etudie n'etant exprime que dans le cerveau.
Objectifs
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des neurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet vise non seulement à améliorer les connaissances au niveau fondamental sur le développement des neurones GABAergiques, mais également à mieux comprendre quel est le lien entre ces neurones et la motricité fine, dont l’altération conduit chez les patients ARX dup24 à des troubles du langage et de l’utilisation de la pince formée par le pouce et l’index. Quand et comment sont apparues ces compétences qui sont propres à l’homme, sont encore le sujet de débats mais ces questions devraient bénéficier de ce modèle d’étude unique qu’est la duplication de 24 pb d’ARX.
Procédures
Des femelles gestantes hétéozygotes (XmX) pour la mutation ARX dup24 seront soumises à une injection au BrdU à un stade particulier de la gestation (entre E13.5 et E16.5, c’est-à-dire 13.5 à 16.5 jours après accouplement). Ces souris seront ensuite euthanasiées de 2 à 48 heures plus tard pour récupérer les embryons qui seront également euthanasiés. Un maximum de 210 femelles gestantes (30 femelles/stade de gestation, voir en annexe) devrait être utilisé pendant la durée du projet.
Impact sur les animaux
Il n'y en a pas car le phénotype de ces souris est non dommageable. La seule expérimentation qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Devenir
Toutes les femelles gestantes ayant reçu une injection au BrdU seront sacrifiées 2 à 48 heures après l'injection par dislocation cervicale et tous les embryons seront rapidement extraits du placenta et décapités
Remplacement
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des interneurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients. Ce type de projet ne peut pas être mené in vitro car il n’existe pas de type cellulaire neuronal exprimant ARX de manière endogène et ce gène n’est exprimé que dans le cerveau, ne permettant pas de prélèvements chez les patients.
Réduction
Concernant la réduction du nombre d'animaux utilisés dans cette étude, il sera adapté au plus juste afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Pour les injections de BrdU, nous prévoyons d’utiliser maximum 30 portées pour chacun des stades (en fonction du nombre de coupes nécessaires à tester en histologie et en fonction du nombre d’embryons par portée). Ces chiffres peuvent paraitre élevés mais nous n’avons pas toujours la certitude de pouvoir avoir les 4 génotypes au sein d’une même portée et pour ce type d’expérience, il est très difficile de comparer des individus issus de portées différentes. Pour l’instant, nous prévoyons de tester différents stades embryonnaires (voir document en annexe) car nous ne savons pas exactement à quel stade nous pouvons nous attendre à voir des différences de nombre de progéniteurs neuronaux. Cependant, le nombre d’animaux utilisés dans cette étude sera adapté au plus juste en fonction des résultats obtenus au cours des 5 ans afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Le test de Student sera réalisé pour tester la significativité des résultats obtenus. Au total, nous prévoyons donc d'utiliser un maximum de 210 animaux sur la durée totale du projet (5 ans).
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages 1284L réglementaires, souvent avec leurs frères ou sœurs, avec de la cellulose et équipées d'igloos pour l'enrichissement au milieu. Ces souris portant la mutation c.429_452dup24 dans le gène ARX ont été générées à l'Institut Clinique de la Souris (Illkirch) qui leur a fait passer un grand nombre de tests de comportement. Les résultats obtenus (et publiés : Dubos et al., Human Molecular genetics, 2018) montrent que ces souris sont en bonne santé et que la mutation ARXdup24 n'entraîne pas de phénotype dommageable. La seule procédure qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Nous travaillons ici sur un modèle de souris transgénique (knock-in) pour lequel un fragment de l'exon 2 du gène de souris a été remplacé par un fragment du gène ARX humain contenant la mutation c.429_452dup24. La souris est un modèle approprié à l’étude des mécanismes moléculaires contrôlant le développement du cerveau car le développement de ce dernier est proche de celui de l'humain, en particulier aux stades embryonnaires étudiés. De plus, dans le cas de l'étude de maladies génétiques rares comme c’est le cas des pathologies associées aux mutations du gène ARX, ce modèle permet d'étudier plus en détail les mécanismes physiopathologiques liés à des mutations particulières grâce à l’étude des phénotypes observés chez l'animal. La majorité des animaux utilisés sera au stade embryonnaire car c'est la période à laquelle est surtout exprimé le gène ARX. Cela nécessitera de sacrifier des femelles gestantes afin de pouvoir récupérer les embryons.