Les projets approuvés

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, puis elles reçoivent jusqu'à cinq injections d'une combinaison de molécules activant les récepteurs TLR et jusqu'à dix injections d'un agent qui bloque l'arrivée des neutrophiles, avec quatre prises de sang à la mandibule. Les tumeurs peuvent atteindre 1 500 mm³ avant la mise à mort et se nécroser, et les molécules testées peuvent provoquer un épisode de fièvre. Le porteur affirme avoir déjà guéri des souris avec cette combinaison, et conclut que déterminer le rôle des neutrophiles "nous oblige à utiliser l'organisme vivant entier".

Objectifs

Dans une DAP précédente, nous avons pu démontrer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison de molécules activant des récepteurs (TLR) dans un modèle de cancer du côlon. Comme attendu, la réponse anti-tumorale était dépendante de l’activation du système immunitaire et nous avons pu démontrer que très rapidement après le début du traitement, les tumeurs étaient envahies par des cellules de l’immunité, les neutrophiles. Afin de pouvoir valider l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale de cette combinaison de molécules activant les TLRs, nous devons inhiber leur infiltration tumorale et regarder si nous conservons ou non cette activité thérapeutique. Le but de ce projet consiste donc à inhiber l’infiltration tumorale des neutrophiles et d’investiguer l’efficacité thérapeutique de notre combinaison de molécules activant les TLRs.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de mieux comprendre le mécanisme anti-tumoral de notre combinaison thérapeutique à base de molécules activant les TLRs. Connaitre le rôle des neutrophiles dans l’efficacité thérapeutique de la combinaison est essentielle pour que les oncologues puissent déterminer quels sont les patients pouvant recevoir ce traitement, le but étant de pouvoir rapidement proposer cette thérapie aux patients porteurs de tumeurs du côlon.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (1 minute – 200 µL maximum) de combinaison de molécules activant les TLRs au maximum 2 fois par semaine, 5 injections maximum. - injection pendant 1 minute maximumde 200 µL de l’agent 1 (tous les 2 jours sur 20 jours maximum) ou de l’agent 2 (2X par semaine, maximum 5 injections) inhibant le recrutement des neutrophiles dans les tumeurs. Les prélèvements de sang à la mandibulaire (100 µL maximum pendant une durée maximale de 1 minute) seront réalisés sous anesthésie générale, 4 fois sur 3 semaines et en faisant bien attention à ce qu’il y ait une alternance de côté de prélèvement.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales et lors des prélèvements sanguins , , ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le volume tumoral peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées et les prélèvements sanguins à la mandibule) pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les molécules activant les TLR sont utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. Ces molécules peuvent induire un léger épisode fébrile (

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro avant de tester notre combinaison thérapeutique chez la souris et de constater sa très grande efficacité (souris guéries). La compréhension du mode d’action de cette thérapie et plus particulièrement la détermination du rôle des neutrophiles dans celle-ci nous oblige à utiliser l’organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris. Les souris ayant un système immunitaire déficient (déplétion des neutrophiles), elles sont donc plus sensibles aux infections et seront hébergées sous couvercle filtrant. L’injection des cellules tumorales et les prélèvements de sang à la mandibule seront réalisés sous anesthésie et en tenant compte d’une alternance pour la mandibule prélevée. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids (maximum 15%), des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection des molécules activant les TLRs, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Si la tumeur atteint une taille supérieure à 1500 mm3, en cas de perte de poids supérieure à 15% ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. L’efficacité anti-tumorale de la combinaison de molécules activant les TLRs ayant été démontrée dans la souris, nous utiliserons la même souche de souris. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 90 d'entre elles soumises pendant vingt semaines à une alimentation riche en graisses destinée à les rendre obèses. Chacune est identifiée par poinçonnage de l'oreille, mise à jeun six puis douze heures avant deux tests métaboliques, gavée d'une solution sucrée puis d'huile, incisée au bout de la queue pour dix prélèvements de sang, puis reçoit une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie. Les tumeurs sont ensuite palpées chaque jour, puis mesurées sous anesthésie tous les trois jours. Le porteur espère qu'un régime riche en oméga-3 réduira l'inflammation liée à l'obésité et améliorera l'immunothérapie, en renvoyant toute application humaine à des recherches ultérieures.

Objectifs

Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.

Procédures

Une identification par poinçonnage de l’oreille pour les 120 souris. • 90 souris recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • 2 mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées dans un tube (- de 2 min/souris). 16 semaines entre les mesures. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6h avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (- d’1 min/souris, contention incluse). Une incision à l’extrémité de la queue (- de 1 mm) sera réalisée pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces tests seront effectués avec une 1 semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi : - Avant l’injection des cellules, une injection d’anesthésiques sera réalisée chez toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur (toutes les souris vigiles, 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum) - Traitement : 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection d’anesthésique pour toutes les souris (quelques sec/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie pour toutes les souris (30 sec/souris). MODIFICATION DU 30-09-2025 : Après l’anesthésie locale et générale et avant l’injection des cellules tumorales, une incision de 3mm autour du mamelon sera réalisée afin de repérer précisément la glande mammaire pour injecter les cellules. L’incision sera refermée par 4 points de suture résorbables. Six heures après toutes les souris recevront une injection complémentaire d’un antidouleur.

Impact sur les animaux

La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 : Avant l'incision cutanée, un anesthésique sera appliqué au niveau de la zone d'incision. Les points de sutures peuvent entraîner une douleur post-opératoire localisée au niveau de l’incision et des sutures, ainsi qu’un tiraillement transitoire lié à la cicatrisation. L'injection supplémentaire d'un antidouleur après l’intervention implique une manipulation supplémentaire pouvant générer stress et douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.

Raffinement

Pour éviter les gavages, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont ajoutés à la nourriture. Seules 2 personnes expérimentées manipuleront les souris tout au long de l’étude. Une surveillance de tous les animaux sera mise en place 2X/semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7jrs/7 après injection. A chaque passage une vérification de l’état général des souris (apparence et comportement) sera réalisée. Un suivi du poids sera réalisé 1X/semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite 2X/semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un antidouleur. Ensuite, une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les 3 jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera 4 semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux. MODIFICATION DU 30-09-2025 L’incision est réduite au strict minimum (≈ 3 mm) et réalisée sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur pendant la procédure. Les sutures sont résorbables, évitant une intervention pour leur retrait. Un antidouleur est administré avant et après l’intervention. Une surveillance rapprochée des animaux est mise en place pour détecter toute complication locale.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.

Greffées de fibrosarcomes sous anesthésie générale, 320 souris reçoivent une injection unique d'un anesthésique testé pour ses effets anti-tumoraux, puis leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever tissus et organes. Le porteur rappelle qu'un travail antérieur a permis de guérir 50 % des souris en associant cet anesthésique à une immunothérapie, et 75 % en injection intratumorale, puis affirme qu'il est "indispensable" d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Les points limites qui déclenchent la mise à mort sont annoncés comme définis et strictement appliqués, sans que le résumé indique lesquels ni à quelle taille de tumeur ils s'appliquent.

Objectifs

Notre récent travail a permis de démontrer l'effet anti-tumoral d'un anesthésique. Il permet une réduction significative de la croissance tumorale. Associée à l'immunothérapie, il permet de guérir 50% des souris et de générer une mémoire immunitaire. Injectée directement en intratumoral,il permet de guérir 75% des souris. De très nombreuses études précliniques ont pu observer la présence de récepteurs impliqués à la surface de nombreuses lignées tumorales. Afin de démontrer que l'action anti-tumorale de ce médicament repose sur des récepteurs spécifiques, nous réaliserons des expériences dans lesquelles des souris porteuses de fibrosarcomes ou de fibrosarcomes modifiés dont les cellules seront déficientes pour ces récepteurs seront traitées avec de l'anesthésique étudié.

Bénéfices attendus

Démontrer que l'action antitumorale de l'anesthésique repose sur les récepteurs spécifiques étudiés. Ce résultat pourrait amener à des essais randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement ces agents sont utilisés comme complément analgésique per-opératoire et n'ont aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique.

Procédures

Greffe de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes), traitement par injection (1 fois, durée 1 minute), anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections uniques de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress léger et transitoire chez l’animal et les croissances tumorales en sous cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées.

Devenir

Euthanasie des animaux pour études sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les effets des traitements anticancéreux impliquent des processus multiparamétriques impliquant des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que la dexmedetomidine induit une réponse anti-tumorale médiées par les récepteurs alpha2 adrénergiques présents sur de nombreuses lignées tumorales. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements sur la réponse anti-tumorale. La confirmation de cette activité anti-tumorale in vivo ouvrirait la possibilité d'utiliser systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction des cellules tumorales résiduelles.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes déterminés par calcul statistique pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés par des méthodes statistiques. L’étude sera arrêtée si une procédure invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver l'efficacité de potentiels nouveaux agents anti-tumoraux afin d'augmenter la réponse anti-tumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitement. Le modèle souris permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler, et suffisamment grand pour pouvoir avoir des injections de cellules tumorales. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, nous réaliserons donc les études sur des adultes.

Modifiées pour n'exprimer qu'un récepteur humain à la place du récepteur murin, 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales de côlon ou de pancréas sous anesthésie générale, puis des chimiothérapies une fois par semaine pendant trois semaines et jusqu'à cinq injections de la molécule testée. Les tumeurs peuvent gêner leurs mouvements et se nécroser, et les souris sont tuées quand la tumeur atteint une taille limite ou en cas de perte de poids. La molécule a déjà été administrée à des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques, où elle a été bien tolérée, mais le porteur indique qu'elle active le récepteur chez la souris alors qu'elle l'inhibe chez l'humain, ce qui le conduit à construire un modèle murin porteur du récepteur humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de la combinaison thérapeutique de chimiothérapies et d’une molécule bloquant un récepteur humain et rechercher le mécanisme mis en jeu. Ce projet a comme origine un essai clinique de phase I réalisé avec cette molécule sur des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques. Cette molécule s’est révélée être bien tolérée par les patients, ne pas présenter de toxicité et il y a eu stabilisation de la maladie pour certains des patients inclus. L’étude de l’effet anti-tumoral de cette molécule avait été réalisée dans des modèles de rongeurs, or il s’est avéré que cette molécule qui active le récepteur chez la souris, au contraire inhibe ce même récepteur chez l’Homme. Ce projet a donc comme but d’élucider le mécanisme anti-tumoral de cette molécule dans un modèle de souris exprimant le récepteur humain et non murin. Nous chercherons également à montrer l’intérêt d’associer cette molécule à des chimiothérapies pour augmenter l’efficacité anti-tumorale de cette thérapie. En effet, un nouvel essai clinique est en projet et inclura des patients porteurs de tumeurs coliques ou pancréatiques traitées par des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Afin de pouvoir finaliser la mise en place d’un nouvel essai clinique chez les patients porteurs de cancers pancréatiques et coliques, il est nécessaire de déterminer l’efficacité thérapeutique de ces combinaisons dans ce modèle de souris exprimant uniquement un récepteur humain, ainsi que de comprendre le mécanisme mis en place. A l’issu de ce projet, l’essai pourra débuter et à terme nous comptons bien pouvoir proposer un nouveau type de traitement pour les patients atteints de ce type de tumeurs.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection des chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines - injection de la molécule, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales, ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées des traitements pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - La molécule est également utilisée à des doses déjà bien établies dans les modèles murins et induit un léger épisode fébrile qui ne devrait pas être présent dans ces souris humanisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur pourra être prélevée.

Remplacement

L’effet de la molécule combinée ou non à des chimiothérapies a déjà fait l’objet de nombreuses expériences in vitro en utilisant des cellules cancéreuses et immunitaires humaines, porteuses du récepteur humain. Cependant pour démontrer l’efficacité anti-tumorale de ces combinaisons, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant l’ensemble des cellules présentes dans les tumeurs : cellules immunitaires, fibroblastes, vaisseaux sanguins… De plus, cette démonstration nécessite aussi que ces organismes présentent un récepteur humain d’où ce modèle de souris humanisées pour ce récepteur.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage. En cas de nécroses sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, un produit cicatrisant sera utilisé. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection de la molécule, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Le fait que la molécule, ciblant le système immunitaire, a un mode d’action différent sur le récepteur humain de ce qui est retrouvé sur le récepteur murin nous oblige à utiliser un modèle de souris modifiées pour n’exprimer que le récepteur humain. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tumeurs et de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, jusqu'à seize injections de traitement en deux mois et une irradiation localisée de douze minutes sous anesthésie générale. Le porteur annonce une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité et des modifications du comportement social liées à la croissance des tumeurs et aux traitements. Il promet en retour un "nouveau paradigme" de radio-immunothérapie et une "transformation significative" des stratégies thérapeutiques, alors que le projet en est au stade de combiner trois traitements chez la souris.

Objectifs

Les agonistes des récepteurs étudiés sont des peptides intestinotropes connus pour leurs effets bénéfiques sur la barrière intestinale et leurs capacités immunomodulatrices. Comparés aux traitements immunologiques classiques, ils présentent un profil de tolérance favorable, tout en modulant efficacement l'inflammation locale et en préservant l'intégrité épithéliale intestinale. Parallèlement, l'irradiation intestinale à faible dose apparaît comme une approche innovante capable de remodeler le microbiote intestinal, d'activer les cellules dendritiques et d'induire un effet immunitaire antitumoral à distance (effet abscopal). Toutefois, malgré les succès notables des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire, leur efficacité reste limitée dans les tumeurs dites "froides" ou peu immunogènes. Le projet actuel vise précisément à explorer la synergie thérapeutique potentielle entre ces différentes stratégies dans un modèle murin de cancer colorectal. Cette approche multidimensionnelle pourrait ouvrir la voie à une nouvelle génération de thérapies combinatoires, dépassant les limites actuelles des immunothérapies classiques, souvent entravées par un microenvironnement tumoral immunosuppressif et une toxicité intestinale significative. En établissant clairement le bénéfice thérapeutique de cette combinaison innovante, ce projet pourrait conduire à une transformation significative des stratégies thérapeutiques actuelles, notamment en réduisant les effets secondaires et en augmentant significativement les taux de réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à explorer une stratégie innovante combinant la radiothérapie intestinale à faible dose, un agoniste de récepteur et une immunothérapie, afin de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d'améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette approche multimodale vise non seulement à optimiser la réponse immunitaire antitumorale, mais également à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation du microenvironnement intestinal. À travers une conception expérimentale rigoureuse et des analyses multi-paramétriques approfondies, ce projet ambitionne de poser les bases d’un nouveau paradigme de radio-immunothérapie ciblant l’axe microbiote – barrière intestinale – immunité adaptative, tout en réduisant les effets secondaires associés aux traitements combinés. En décryptant les mécanismes synergiques entre ces trois stratégies :modulation du microbiote et activation locale, la réparation de la muqueuse intestinale et réduction de l'inflammation et l’activation de lymphocytes T cytotoxiques, cette étude fournira une base translationnelle solide pour le développement de futurs essais cliniques combinés, alliant efficacité thérapeutique et toxicité minimale.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés comme les injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques injectés en intra-péritonéale. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’effet thérapeutique combiné de l’irradiation intestinale à faible dose (ILDR), d’un inhibiteur du point de contrôle immunitaire (anti-PD-L1) et d’un modulateur immuno-métabolique, un agoniste du récepteur GLP-2 (GLP-2RA), sur la réponse tumorale. Étant donné que l’ILDR, le blocage de PD-L1 et le GLP-2RA agissent sur un réseau complexe d’interactions entre l’hôte, la tumeur et le microbiote intestinal, l’étude de ces mécanismes nécessite un système immunitaire intact, un microenvironnement intestinal fonctionnel et un état métabolique stable. Cette complexité multifactorielle ne peut être reproduite de manière fiable ni par des cultures cellulaires (in vitro), ni par des modèles informatiques (in silico). Par conséquent, afin de caractériser avec précision les mécanismes d’action et l’efficacité thérapeutique de cette approche combinée, le recours à un modèle animal vivant, immunocompétent et métaboliquement intact, est indispensable.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, (avec G*Power) afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie (isoflurane/Lidocaïne) adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections intrapéritonéales. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.

Tester si un composé qui désintègre la membrane des cellules retient mieux son effet antitumoral une fois mélangé à un hydrogel visqueux : 140 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à deux injections de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections du traitement sur trois jours, et sont manipulées tous les trois jours pour mesurer la tumeur. La croissance tumorale peut provoquer une gêne mécanique et une perte de poids modérée. Le porteur qualifie l'association de très prometteuse et espère prouver son efficacité chez les patients, tout en justifiant l'expérimentation par l'impossibilité actuelle de reconstituer un système immunitaire in vitro.

Objectifs

Le développement d’inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICIs) est une des principales avancées dans le traitement contre le cancer. Ils permettent de stimuler les Lymphocytes T qui vont s’infiltrer dans la tumeur et tuer les cellules cancéreuses. Cependant, un nombre limité de patients présentent une réponse durable à ce type de traitement, majoritairement dû à un manque d’infiltrat de cellules T dans les tumeurs de beaucoup de patients. Des composés ont donc été développés ; leur mode d’action est simple : ils désintègrent la membrane plasmique des cellules. Cela entraîne la libération de signaux de danger ainsi qu’un large spectre d’antigènes tumoraux, qui vont activer notamment les cellules dendritiques. Cette activation va stimuler l’afflux de cellules T dans la tumeur. Notre composé fait partie des derniers composés développés et est conçu pour traiter localement des tumeurs profondes. Il a montré un fort pouvoir anti-cancéreux dans une grande variété de modèles expérimentaux, tel que le cancer du foie ou il stimule l’infiltration des lymphocytes T. Dans des modèles expérimentaux, il s’est avéré sûr et bien toléré. Pour l’améliorer, il a été associé à un hydrogel, augmentant ainsi la rétention du médicament dans la tumeur (en raison de la viscosité de l'hydrogel). Nous souhaitons donc vérifier si notre composé associé à l’hydrogel améliore son effet anti-tumoral.

Bénéfices attendus

Notre composé couplé a un hydrogel est très prometteur. En effet, l’hydrogel, avec sa viscosité, retiendra le composé dans la tumeur et devrait donc permettre d’améliorer ses effets. Sur le long terme, nous espérons pouvoir prouver son efficacité sur les patients en étude clinique et l’utiliser sur toutes les tumeurs solides de façon ciblée et très efficace, par la suite.

Procédures

Les souris recevront une à deux injections en sous cutanée de cellules tumorales (2min) sous anesthésie générale puis trois injections de traitements sous anestrhésie locale (durée moins d’une minute sur 3 jours). Ils seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peut stresser transitoirement et légèrement les animaux. Il peut apparaitre une irritation au niveau du point d’injection induisant un prurit léger. La croissance des tumeurs peut provoquer une gêne mécanique et induire une perte de poids modérées.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire (afflux de lymphocyte T), il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour analyser les résultats obtenus. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé avec une approche statistique.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie générale. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : D’une part, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue et d’autre part, notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Par ailleurs, la souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

3 800 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune pouvant recevoir des injections tous les deux jours et jusqu'à sept prélèvements sanguins hebdomadaires. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après un dernier prélèvement de sang. Il s'agit de valider chez l'animal vivant des anticorps couplés à un agent cytotoxique contre le cancer du pancréas, après des essais en éprouvette jugés concluants. Le porteur présente cette étape comme le préalable à des essais sur "des animaux de plus grande taille", eux-mêmes préalables aux phases cliniques.

Objectifs

Malgré de récentes avancées pour le traitement du cancer, il reste encore de nombreux besoins médicaux non couverts, notamment dans le cancer du pancréas. Nous avons développé de nouvelles approches thérapeutiques (notamment des Anticorps couplés à un cytotoxique (ADC)) dans le traitement du cancer. Suite à des études in-vitro concluantes, nous devons montrer l’efficacité in-vivo pour validation préclinique, sur plusieurs modèles de cancer. L’objectif est de valider in vivo l’efficacité du traitement, déterminer les concentrations, fréquences et modes d’injection avant de les réaliser sur des animaux de plus grande taille. Une comparaison sera réalisée avec une molécule de référence qui peut être un traitement par chimiothérapie ou un ADC de référence déjà sur le marché.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, il sera établi si l’anticorps et ses variants ADC ont bien la capacité d’inhiber la croissance tumorale. La dose efficace pourra être établie. Ces résultats pourront déboucher sur une étude sur de plus grands animaux en vue de la préparation des phases cliniques. Le bénéfice à long terme est la mise au point d’un nouveau traitement d’immunothérapie pour les cancers.

Procédures

- Injections (environ 2 secondes), tous les deux jours aux maximums, sur souris vigile. - Injections (environ 2 secondes), tous les trois jours aux maximums, sur souris vigile. - injection ( environ 5 secondes), sous anesthésie générale. - Prélèvements sanguins sous anesthésie, , toutes les semaines,e sept prélèvements au maximum. - Prélèvements sanguins, 2 prélèvements en 24h, sous anesthésie générale à l’isoflurane. Prélèvement de sang sous anesthésie générale, avant la mise à mort. Mesure des volumes tumoraux

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires, mais nous serons vigilants aux éventuelles détresses respiratoires. Les injections des molécules et les randomisations peuvent créer du stress chez les animaux. Les injections répétées peuvent éventuellement créer une petite irritation ou inflammation aux sites d’injections. Les traitements pourront éventuellement entrainer une perte de poids. Nous attendons à une possible gêne de la motricité à cause de la croissance tumorale, Nous ne nous attendons pas à une toxicité des molécules testées, mais comme il s’agit de molécules expérimentales nous seront vigilants sur ce point. Les souris immunodéficientes peuvent développer plus facilement des infections.

Devenir

La croissance tumorale, ainsi que le prélèvement de sang final justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’est disponible pour tester l’effet des anticorps thérapeutiques sur un système mammifère vivant entier. Les modèles in vitro disponibles de types sphéroïdes ou organoïdes ne permettent pas de modéliser de façon suffisamment précise la pharmacocinétiques et pharmacodynamique des produits. L’utilisation de souris est donc nécessaire afin d’évaluer la pertinence pré-clinique des traitements antitumoraux.

Réduction

Une première validation de l’efficacité du traitement a été réalisée in vitro avec la détermination des indices d’efficacités qui sont compatibles avec les exigences attendues d’un traitement ADC. Cela réduit le nombre de conditions à tester pour la détermination de la quantité de produit à injecter. Les études pilotes (qui utilisent peu d’animaux, inclues la présente demande d’expérimentation) permettront de calibrer au plus juste le nombre de souris pour les études antitumorales tout en permettant une exploitation des résultats. Comme indiqué précédemment, pour chaque molécule testée, si les effets mesurés sont fiables d’un point de vue statistique au deuxième essai, nous n’en feront pas un troisième, ce qui permettra de limiter d’au moins 30% le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

La croissance tumorale sera mesurée trois fois (en fonction de la croissance tumorale) par semaine pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessive. Les animaux seront anesthésiés lors des prélèvements de sang et lors de l’injection des cellules tumorales. Les animaux auront un enrichissement dans les cages sous forme de tunnels et pourront avoir un complément alimentaire gélifié si nécessaire. Des point limites seront mis en place, suffisamment précoce pour limiter la douleur sans remerttre en cause les résultats du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes. Ce modèle permet la greffe de cellules tumorales humaines et le test des ADC. L’évolution de la croissance tumorale est ensuite évaluée en fonction des différents traitements testés. Les souris auront entre 6 et 9 semaines pour avoir un système immunitaire adulte et pouvoir répondre correctement aux traitements

Toutes ayant reçu des cellules cancéreuses, aucune ne peut être gardée en vie selon le porteur : les 180 souris de ce projet seront tuées, leurs tumeurs analysées après la mort. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis une injection de traitement tous les deux jours pendant trois semaines. Trois à quatre fois par semaine, la tumeur est mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé, maintenu par contention. Le projet teste des promédicaments censés ne s'activer qu'en présence des fortes concentrations de radicaux oxygénés propres aux cellules cancéreuses, sans que le RNT nomme ces molécules ni précise le type de cancer greffé.

Objectifs

Les ROS (espèce réactives de l'oxygène) d'origine naturelle agissent comme des molécules de signalisation, par exemple pour stimuler la croissance des cellules. Cependant, lorsque la production de ROS augmente, des effets nocifs commencent à apparaitre sur des structures cellulaires importantes telles que les protéines, les lipides et les acides nucléiques. Les niveaux élevés de ROS sont une des caractéristiques typiques du cancer , ils favorisent la croissance et la progression de la tumeur. Mais, au-dessus d'un seuil ils deviennent toxique, le stress induit par les ROS peut entraîner l'apoptose ou la sénescence des cellules cancéreuses. Elles ont donc développé la capacité de s'adapter à des concentrations élevées de ROS en augmentant les niveaux d'antioxydants et donc à maintenir les niveaux de ROS en dessous d’un seuil toxique. Ces adaptations pouvent conduire à une résistance au traitement, entraînant ainsi une progression de la maladie ou une rechute. Des molécules thérapeutiques amplificatrices de ROS sont donc développées. Étant donné que les ROS sont hautement toxiques sur toutes les cellules, le défi dans l'application thérapeutique de ces médicaments est donc d'atteindre la spécificité des cellules cancéreuses pour éviter les effets néfastes attendus sur les cellules et les tissus normaux. Des agents ont été crées dans le but de s’activer uniquement en présence d’une concentration de ROS élevée, comme c'est le cas spécifiquement dans les cellules cancéreuses, et entraîner la mort de ces cellules. Nous souhaitons donc tester ces agents in vivo, pour vérifier leur effet ciblé anti-tumoral.

Bénéfices attendus

Les agents testés sont des promédicaments activés par les ROS. Les ROS sont surproduites par de nombreux cancers. Ainsi, ces agents peuvent tuer sélectivement les cellules cancéreuses. Nous souhaitons exploiter cette capacité afin de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques très ciblées avec le moins d'effet secondaire possible sur les cellules saines.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois sous anesthésie (une seule par souris). Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées tous les 2 jours, brièvement (1min) à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 1 injection de traitement sous anesthésie locale tous les deux jours pendant 3 semaines (n=10). L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 à 4 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer une contrainte légère chez l’animal. La croissance des tumeurs en sous-cutané et les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer des contraintes modérées dont une perte d’appétit et donc une perte de poids.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. L’analyse des tumeurs après traitement, post-mortem, nous informera sur la capacité de ces molécules à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Pour savoir si l'alimentation modifie l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses, 1 602 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous la peau des cellules tumorales alors qu'elles sont éveillées, développent une tumeur mesurée régulièrement, puis trois injections intrapéritonéales de traitement. Le porteur écrit que les groupes comptent dix-huit souris "sans recours à un test statistique pour définir ce nombre", en se fondant sur son expérience antérieure. Il indique que l'hypothèse testée, le rôle de nutriments végétaux dans la réponse immunitaire anti-tumorale, a d'abord été formulée en culture cellulaire, et affirme que le recours à la souris reste "indispensable" pour envisager une application clinique.

Objectifs

Ces dernières années, l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur, a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques. Cependant, seule une partie des patients répondent au traitement par immunothérapie, et de nombreux paramètres peuvent impacter l’efficacité du traitement. En particulier, les aliments peuvent avoir un impact important, en fournissant des nutriments qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire et en modifiant les bactéries de la flore intestinale. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’effet de la nutrition dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester des traitements permettant d’augmenter l’efficacité de l’immunothérapie via des interventions nutritionnelles.

Bénéfices attendus

Des études suggèrent que des modifications de l’alimentation pourraient apporter un bénéfice aux patients traités par immunothérapie. Cependant, l'effet sur les cellules immunitaires des tumeurs des produits dérivés de la nourriture demeure mal connu. Ce projet permettra donc d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour mieux comprendre l’interaction entre nourriture et cellules immunitaires, et plus particulièrement dans les réponses immunitaires anti-tumorales au cours des immunothérapies. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des immunothérapies par point de contrôle immunitaire.

Procédures

Les expériences visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 20 sec). Les animaux seront ensuite traités à 3 reprises à raison d’1 fois par jour (administration des traitements par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles, durée du geste inférieur à 10 sec), tous les 2-3 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. Nos résultats précédents montrent que le régime spécial utilisé n’affecte pas l’état général des animaux et ne modifie pas leur poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que des nutriments présents dans certains végétaux jouent un rôle dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo. Le projet doit étudier l’influence de ces nutriments sur la croissance tumorale et les réponses immunitaires anti-tumorales dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent être représentatifs, sans recours à un test statistique pour définir ce nombre. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Nous limiterons le nombre de souris utilisées en restreignant le nombre de lignées tumorales étudiées et en étudiant un seul type de thérapie pour l’analyse des mécanismes moléculaires. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, y compris le week-end lorsque cela est nécessaire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux sont mis à mort dès l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.