Les projets approuvés

75 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit par voie rectale un produit destiné à provoquer une inflammation du côlon, subit des coloscopies et des IRM sous anesthésie, puis l'administration orale ou rectale d'un anticorps. Le porteur indique que l'induction de l'inflammation peut entraîner saignements, douleurs, diarrhées et déshydratation, et que les animaux sont tués par injection intracardiaque en fin de protocole. Il décrit le mini-porc comme le "modèle le plus adapté" pour tester une nouvelle forme orale d'un médicament déjà commercialisé en perfusion.

Objectifs

L’inflammation chronique de l’intestin et du côlon (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Selon l'Association François Aupetit (AFA), 8000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année en France. Les traitements conventionnels des MICI sont à base d’antiinflammatoires (acide 5-amino-salicylique, Pentasa®), de corticoïdes ou d’immunosuppresseurs (Azathioprine). Dans cet arsenal thérapeutique, l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-TNF en monothérapie s’avère être efficace, notamment sur les cas compliqués. Ce sont les molécules les plus puissantes disponibles actuellement en clinique. En 2014, 3 formes de ce médicament à base d’anti-TNF ont obtenu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en France pour le traitement des MICI administré par perfusion. Leurs indications ciblent le traitement de la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique modérée à sévère chez les patients réfractaires aux traitements conventionnels cités ci-dessus. Cependant, les effets secondaires de ces nouveaux médicaments sont parfois importants pour les patients, notamment l’apparition des saignements liées à l’injection répétée par voie intraveineuse de ce médicament. De façon intéressante, nous avons développé une autre forme de ce médicament de manière à l’administrer par voie orale. Cette voie permettra ainsi d’éviter ces effets secondaires. Cependant, l’efficacité de ce médicament administré par voie orale reste à démontrer. Cette recherche préclinique chez le mini-porc permettra de valider d’une part la faisabilité et la tolérance de la voie orale pour l’administration de ce médicament et d’autre part, l'efficacité thérapeutique de son activité anti-inflammatoire dans un contexte pathologique. Cette étude comportera deux grands objectifs : (1) Valider un modèle animal (mini-porc) qui développe la maladie de l’inflammation chronique de l’intestin et du colon, (2) confirmer la sécurité et l’efficacité du traitement administré par voie orale par rapport à la voie parentérale (perfusion) et rectale.

Bénéfices attendus

Notre étude apportera la validation préclinique d’une formulation pharmacologique innovante permettant d’administrer un traitement anti-TNF par voie orale. De manière générale, cette étude apportera un intérêt clinique majeur chez les patients souffrant de pathologies chroniques et déjà sous traitement parentérale (perfusion). L’utilisation d’une nouvelle forme galénique innovante s’accompagnera d’une meilleure tolérance et d’une action d’installation plus rapide que les traitements actuellement mises sur le marché. Les bénéfices attendus par l’utilisation d’un bio-médicament avec une nouvelle forme galénique administrée par voie orale sont nombreux : 1. Une libération locale ciblée de la substance active au site d'action. 2. Réduction des infections à répétitions. 3. Une meilleure observance du traitement liée à un mode d’administration plus simple, sans les contraintes de stockage et de stérilisation retrouvées avec les formes injectables. 4. diminution importante de la charge hospitalière (soulagement du système économique de la santé) 5. La fabrication d'une forme galénique sèche (comprimé) est simple et moins couteuse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection par voie intra-rectale (induction de l’inflammation par 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) et le Dextran Sulfate Sodium (DSS) + injection du traitement en solution ou dispersion), un gavage (administration des comprimés) et deux examens d'imagerie pour l’évaluation et le suivi du traitement (coloscopie + IRM avec injection de produit de contraste sous anesthésie générale). L’administration du médicament par voie orale à travers la sonde nasogastrique et par voie rectale à l’aide d’une canule rectale (dispositif médical) après fixation d’une seringue va durer approximativement 10-15 min. Une surveillance rapprochée des animaux sera effectuée afin de s’assurer de la tolérance des interventions.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux notamment ceux inclus dans les phases 1 (sauf lot 1.1 : contrôle négatif), 2 et 3 (modèle de MICI), seront soumis à une injection d'un produit pouvant être irritant par voie rectale, afin de déclencher une inflammation colique. Cette intervention nécessite une anesthésie générale et l'utilisation d'une procédure de coloscopie. Cette intervention peut entrainer un saignement du colon, les animaux peuvent ressentir des douleurs, rarement une modification du poids (+/- 10%), des diarrhées pouvant entrainer une déshydratation. Par ailleurs, un stress lié à l'administration du traitement orale sera remédié avec une prémédication. Le traitement peut nécessiter une courte sédation de l'animal car le comprimé de 5 mm de diamètre ne doit pas être croqué (comprimé enrobé). Les animaux seront euthanasiés par l'injection létale intracardiaque du T61 à la fin du protocole expérimental ou lorsqu’un des points limites sera atteint.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à chaque date (Mois 3 : Phase 1 et 2, Mois 12 : Phase 3), puis une autopsie (évaluation macroscopique des tissus) et des prélèvements de tissus biologiques pour une analyse moléculaire et histologique seront effectués. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas d’apparition d’un point de limite.

Remplacement

Pour réaliser cette étude préclinique, nous utiliserons un modèle de maladie inflammatoire chronique intestinale (MICI) chez le mini-porc pour mimer la pathologie chez l’homme. Il s’agit d’un modèle animal le plus adapté d’une part par les ressemblances anatomiques et processus physiopathologiques du tube digestif avec l’homme, et d’autre part par sa corpulence proche de la taille humaine. Cette étude comporte la sécurité et l’efficacité de la forme galénique du traitement antiinflammatoire des MICI ciblant la partie distale de l’intestin. De ce fait, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation du modèle animal par une évaluation in vitro ou ex vivo ou un modèle d’intestin artificiel « in silico ». Une administration des comprimés à taille humaine chez la souris ou le rat n’est pas réalisable, elle ne reflèterait pas les conditions physiopathologiques observées chez l’Homme. De plus, ce mammifère est le plus couramment utilisé dans les évaluations pharmacologiques des MICI. A notre connaissance, aucune étude expérimentale n’a évalué à ce jour l’efficacité d’un bio-médicament sous une forme galénique par voie orale. L’utilisation chez le mini-porc d’un bio-médicament sous une nouvelle forme galénique (développé en collaboration avec un industriel) permettra de démontrer la preuve de concept in vivo (efficacité, tolérance et sécurité) dans le traitement des MICI avant la réalisation des premiers essais cliniques sur l'homme.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. De surcroît, le nombre des animaux choisis permet de réaliser une étude comparative entre les groupes d’animaux sains et avec un MICI induite. Ce qui permet de valider le modèle pathologique. Ensuite, une étude d’efficacité du traitement selon le mode d’administration « orale versus intra-rectal » sera réalisée pour comparer les groupes traités avec les non-traités « placebo ». Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une évaluation efficace de l'induction ciblée de l'inflammation au niveau du colon. Il est prévu d’évaluer l'efficacité des formes galéniques innovantes pour une période de 5 ans sur 75 mini-porcs, soit 15 mini-porcs par an en moyenne. Nous envisageons de faire des groupes de 6 à 7 mini-porcs. Ce nombre est le minimum possible, puisqu’il tient compte des analyses statistiques et des éventuelles pertes de mini-porcs pendant l'anesthésie ou des procédures liées à l’induction de l'inflammation. Nous allons réaliser des tests statistiques de comparaison entre les différents groupes de type « Mann-Whitney » non paramétrique. Les différences entre les groupes seront jugées statistiquement significatives lorsque la valeur P est inférieure à 0.05.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les mini-porcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE. La douleur liée aux interventions chirurgicales est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'induction de l'inflammation pour visualiser tout signe de complications post-opératoires imprévues qui nécessiteraient l’euthanasie de l’animal. Ainsi, les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo chez l'animal, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins, chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux (analgésiques en pré- et post-opératoire et médication spécifique pour limiter les éventuelles douleurs induites par l'inflammation). Les membres de l'équipe possèdent la formation "concevant et réalisant" et la formation de chirurgie chez l'animal (AUEC).

Choix des espèces

Le modèle d'induction de l'inflammation chronique de l'intestin (MICI) chez le mini-porc sera utilisé pour évaluer et caractériser l’efficacité in vivo de nouvelles formes galéniques. C’est l’un des meilleurs modèles d’étude des MICI puisqu’il permet de s'approcher aux conditions physiopathologiques observées chez l'homme (similitudes de l’anatomie de l'appareil digestif, de la composition de la flore intestinale et du temps de transit). De surcroît, ce modèle permettra d’utiliser des technologies perfectionnées utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme (IRM, coloscopie) dans le diagnostic, le contrôle, le traitement et le suivi de la maladie. Cette étude préclinique permettra ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI et leur traitement. L’objectif est de confirmer la preuve de concept in vivo avant de passer aux études cliniques chez l'Homme. - Dans un premier temps, les mini-porcs seront utilisés pour valider l’induction de l’inflammation chronique intestinale chez le groupe non-traité et le groupe traité par voie intra-rectale avec le bio-médicament. Ce dernier est administré soit en solution ou en dispersion d’un comprimé broyé contenant la dose thérapeutique de l’anticorps monoclonal afin de montrer d’abord son efficacité locale. L’induction de la maladie et l’efficacité locale du bio-médicament seront évaluées par le calcul des scores Wallace (étude macroscopique : extension des lésions) et Ameho (étude microscopique : immuno-histologie) et par le dosage des marqueurs biologiques (réponses inflammatoires, dosage des cytokines, MPO, TNFα, numération formule sanguine, …). -Dans un deuxième temps, les mini-porcs seront utilisés dans le cadre d'efficacité de la thérapie par voie orale. - Puis, afin de se rapprocher de la clinique en termes de taille et de structure anatomique de l'appareil digestif humain, le modèle du grand mammifère mini-porcs de type Gottingen adultes (40 à 60 kg) sera utilisé pour évaluer l’efficacité, la sécurité et la répétabilité de la thérapie à long terme (6-12 mois).

1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages quotidiens pendant deux à treize semaines, des prélèvements de sang à la queue et une colite déclenchée par un agent chimique, qui provoque perte de poids et lésions du côlon, pour tester des bactéries censées protéger contre le diabète et l'inflammation intestinale. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule le système digestif et son microbiote, et conclut que le recours aux souris est "nécessaire". Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements des maladies inflammatoires de l'intestin, restent à l'état d'objectif.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes et des antigènes alimentaires. Les bactéries y jouent un rôle crucial pour le développement et le maintien d’un système immunitaire sain. Un déséquilibre du microbiote a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Les MICI sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Ces dernières années la prévalence du diabète a été multipliée par quatre et les dépenses de santé liées au diabète dépassent les 850 trillions de dollars au niveau mondial. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans ces maladies. Nos travaux montrent l’impact de certaines souches bactériennes sur une voie de l’immunité innée associée à l’obésité. Nous émettons l’hypothèse que l’activation de cette voie par des bactéries intestinales pourrait impacter la santé, notamment la mise en place du diabète et le développement des MICI. L’objectif de notre projet est donc d’explorer les propriétés protectrices de souches bactériennes qui activent cette voie immunitaire sur: i) l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance dans un modèle in vivo de prédiabète induit par un régime riche en graisse, ii) l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite et dans ce même modèle de colite induite après un régime riche en graisse. Ces expérimentations seront réalisées à chaque fois sur deux lignées de souris : des souris transgéniques chez lesquelles la voie imunitaire étudiée a été inactivée (et des souris ne présentant aucune mutation qui seront utilisées comme contrôles. Sur 5 ans, nous testerons 6 bactéries sur des souris contrôle et modifiées pour la voie immunitaire d’intérêt, recevant un régime riche en graisses ou/et soumises à une colite.

Bénéfices attendus

Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) ou de maladie métabolique comme l’obésité ou le diabète. Il est essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux traitements.

Procédures

Pour mesurer la glycémie des 360 animaux, 6 goutes maximum de sang seront prélevées sur une durée de quelques secondes. Un prélèvement de sang sera effectué une seule fois au moment de la mise à mort sur une durée de 10 à 15 secondes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. La récolte de fèces sera réalisée lors de l’émission naturelle de fèces par la souris (avant traitement puis en fin de procédure) pour une durée de quelques minutes. L’intégralité des animaux est soumise à ce prélèvement. Les gavages, effectués quotidiennement sur une période de 2 à 13 semaines, nécessitent une contention pendant moins de 10 secondes et seront également réalisés sur l’ensemble des animaux.

Impact sur les animaux

Lors des gavages aucune nuisance n’est attendue hormis le stress dû à la contention (10 secondes maximum). Les animaux soumis aux tests glycémiques subirons un stress léger de très courte durée lors de l’incision au bout de la queue pour les prélèvements de sang (1 seconde). Le prélèvement de sang final sera réalisé juste avant la mise à mort en causant un stress modéré sur 10 à 20 secondes. Les effets indésirables dû à l’agent inducteur des la colite sont perte de poids, lésions coliques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de realiser les prelevements d'organes et de tissus necessaires.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte

Réduction

Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des tests statistiques (10 animaux par lot) sans nécessitée de répétition ultérieure de l’expérience.

Raffinement

Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés tous les jours durant la phase d’adaptation afin de diminuer leur stress lors des prélèvements. Toutes les souris auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l’ajout d’un abri obscur en polycarbonate. Les souris seront 5 par cage pour éviter l’isolement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de façon appropriée si un problème survenait. Les équipements utilisés sont adaptés à la physiologie du petit animal telle que l’utilisation de lecteur de glycémie performant (rapide et nécessitant un volume de sang faible). Enfin, des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie ainsi que sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. De plus ce modèle nous permet d’appréhender la réponse immunitaire dans son ensemble et plus particulièrement la réponse de la voie d’intérêt. Des données publiées par un groupe britannique a montré l’importance du gène impliqué dans la voie immunitaire étudiée dans ce projet dans l’équilibre intestinal en utilisant ce modèle, justifiant de l’utilisation de ces mêmes souris pour nos expériences. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en fin de croissance de 8-10 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.