Les projets approuvés

Une partie des souris utilisées sont des NSG, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes. Les interventions déclarées se résument à une ou deux injections, quatre prélèvements sanguins sur animal éveillé et un prélèvement sous anesthésie, réparties entre deux établissements. Le porteur admet que l'une des procédures "peut induire des douleurs non prévues" parce que la toxicité des molécules testées n'est pas connue, sans en dire davantage sur le contenu de ces études d'oncologie et de maladies auto-immunes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles molécules innovantes pouvant être utilisées pour le traitement de maladies auto-immunes ou dans le cadre du cancer. L’objectif principal sera donc de réaliser, chez la souris, une analyse toxicologique de ces molécules mais également étudier leurs effets sur le développement de différents types de cancer chez la souris. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, ; les deux premières procédures, dans le premier établissement utilisateur et les trois dernières dans le deuxième établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer si les molécules innovantes nouvellement identifiées permettent notamment d’inhiber ou de ralentir le développement de différents types de tumeurs chez la souris. L’ensemble des résultats obtenus sera crucial pour envisager l’utilisation de ces molécules en clinique chez l’homme.

Procédures

1 ou 2 injections (

Impact sur les animaux

Les procédures correspondantes au projet peuvent induire du stress et une angoisse liés à la manipulation/ contention des animaux. Les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur légère de courte durée chez celles-ci. Une des procédures peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait que la toxicité des nouvelles molécules n'est pas connue. Les manipulations des souris lors des prises de sang effectuées peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur de courte durée chez celles-ci. L'utilisation d'un phénotype dommageable, les souris NSG.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, des prélèvements d'organes sont réalisés sur ces animaux et des analyses ex-vivo sont effectuées sur ces derniers.

Remplacement

L'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Avant l’expérimentation sur animal, les molécules sont testées au préalable sur différents modèles bio-informatiques (modélisation des structures des molécules et d'affinités pour les cibles thérapeutiques choisies) in vitro (lignées de cellules tumorales et cellules non tumorales) afin d’évaluer leur activité. L'utilisation du modèle souris permet l’étude de différentes pathologies in vivo. Afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes modèles de l’Homme. L’utilisation de modèles de souris permet d’étudier la physiologie de ces pathologies au sein d’un organisme vivant dans tout son ensemble.

Réduction

Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes. Dans les procédures expérimentales définies (études précliniques de pharmacocinétiques, de toxicité et d'efficacité), les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans un milieu enrichi et amélioré. Des analgésiques peuvent être administrés aux souris. L’utilisation d’une grille unique de score est mise en place ainsi que l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. La grille de score est décrite dans chacune des procédures L’aspect général des animaux ainsi que le suivi pondéral seront transcrits dans la grille de score. Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Des points limites pour lesquels les animaux seront mise à mort ont été défini. Il n'y a pas d'échanges d'animaux entre les deux établissements utilisateurs, pas de transports d'animaux entre ces deux sites.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal qui permet d’élargir nos connaissances sur le développement, la physiopathologie de différentes pathologies mais aussi tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son utilisation permet de connaitre la physiologie in vivo des différentes pathologies chez des modèles de souris. ​Le choix de l'espèce se porte sur le fait que cette espèce est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique.​ Jeunes adultes entre 5 à 8 semaines pouvant finir leur croissance. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule.

Opérées pour une dénervation musculaire, parfois alors qu'elles sont gestantes, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour l'analyse de leurs tissus. Les animaux subissent des injections, des chirurgies sous anesthésie, des tests comportementaux d'une heure, un électromyogramme et une mesure de force, la chirurgie pouvant provoquer douleurs, infection et boiterie. Le projet étudie la jonction entre le nerf et le muscle, en vue de comprendre des maladies neuromusculaires rares comme les syndromes myasthéniques congénitaux. Le porteur décrit ces syndromes comme touchant une personne sur 250 000, situant le bénéfice attendu à distance de l'atteinte infligée.

Objectifs

La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.

Procédures

Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.

Devenir

L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.

Remplacement

L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.

Réduction

Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.

Choix des espèces

Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.

Les souriceaux visés ont 1 à 3 jours, âge auquel l'os du crâne reste assez souple pour y enfoncer une aiguille sans incision. 972 souris nouveau-nées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit en cours d'étude si les points limites sont franchis, soit à la fin pour prélever leurs tissus. Chacune reçoit une injection intracérébrale de composé candidat sous anesthésie gazeuse, avec pour risques déclarés un retard de croissance, une absence de prise de poids jusqu'au sevrage, un rejet par la mère et une atteinte des mouvements spontanés ou du comportement de recherche de la tétée. Les mères et les souriceaux non traités, qui ne comptent pas dans les 972, sont soit utilisés pour la formation à des gestes techniques, soit basculés vers un autre projet d'évaluation de composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques dès la naissance ou l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), comme les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (Developmental Epileptic Encephalopathies ou DEEs). Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. Les composés étudiés, sélectionnés après des tests in silico et in vitro, sont testés chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. Les meilleurs candidats sont retenus et testés chez la souris nouveau-née (phases de développement cérébral similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois) afin d’évaluer leur effet dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et destinés à être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois). Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgées de 1 à 3 jours par voie intracérébrale. En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés par voie intracérébrale sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration sous-cutanée des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration intra-péritonéale des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique Intra péritonéales en amont de la perfusion intra-cardiaque. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress.  De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré.  De l’administration de composés par voie intra-cérébrale sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. Une potentielle source de nuisance peut survenir lors :  D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée)  Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : 60 jours).

Devenir

Tous les souriceaux inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche.

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Phase d’administration (20 min max de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) sous anesthésie générale gazeuse sur couverture chauffante. Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple chez un souriceau de 1-3 jours. Observation des souriceaux effectuée durant la phase de réveil et lors du replacement dans la cage avec la mère après un réveil complet. Une grille de score spécifique réalisée par une analyse comportementale (1h, 3h, 6h et 24h après administration) établira un score de tolérabilité des candidats médicaments. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites définis par la grille de score, sera euthanasié. Suivi de l’état général des animaux réalisé quotidiennement (durée max de 60 jours). Le suivi du poids sera réalisé 1 à 2 fois par semaine pendant les 10 premiers jours post-administration afin de limiter au maximum le rejet de la mère. Une estimation visuelle de la bonne croissance des souriceaux administrés sera effectuée en regard d’un animal contrôle non-administré. Pour diminuer les risques de rejet: - Mise en contact de la femelle gestante, dès son arrivée et jusqu’au début des études, avec les odeurs qu’elle rencontrera sur les nouveau-nés (solutions désinfectantes, gants…) - La cage d’une femelle qui vient de mettre bas ne devra pas être nettoyée pendant 2 semaines. Si un nettoyage ou un changement de litière est nécessaire au cours des premiers jours, le nid entier sera transféré dans la nouvelle cage. - Les administrations seront faites sur une première moitié de la portée puis sur la seconde afin que la mère ait toujours des nouveau-nés avec elle - Avant la réintroduction des souriceaux dans la cage de la mère après administration, ils seront frottés avec le nid souillé afin d’en être réimprégnés de l’odeur. L’hébergement sera enrichi : bâtonnet de coton et sizzle pad pour le nid en plus d’un tube en plexiglass et d’un bâtonnet en bois La phase de prélèvement se déroulera sous analgésie (buprénorphine 0.1ml/10g ou méthadone 10mg/kg en SC) et anesthésie profonde (kétamine 120mg/ml et de xylazine 12mg/ml en IP).

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des épilepsies rares infantiles, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau-nées.

4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, orale ou intraveineuse jusqu'à une fois par semaine pendant quinze mois, subissent jusqu'à deux injections intracérébrales sous anesthésie, des prélèvements sanguins toutes les trois semaines pendant trente semaines et une privation totale d'eau pouvant atteindre vingt-quatre heures. L'objectif déclaré est de fabriquer puis de valider des modèles de maladies neurologiques rares, en vérifiant que les souris développent bien tremblements, incoordination motrice, dermatites et perte de poids. Celles qui se dégradent sont tuées en cours d'étude, les autres à la fin, pour prélever fluides et tissus. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable", une majorité des aspects d'une maladie ne pouvant selon lui être reproduits in silico ou in vitro.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares, et en particulier les maladies rares neurologiques, sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple dans l’amyotrophie spinale infantile ou l’épilepsie infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. II est possible de reproduire en partie les symptômes de la pathologie chez la souris à la suite d’une altération de son génome, d’une modification de son environnement (mise à jeun hydrique) ou encore en lui administrant des agents ou préparations biologiques destinées à modifier le fonctionnement du système nerveux central. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, l’ajout du gène humain dans le génome de la souris permet la création de lignées génétiquement modifiées. Ces souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence un phénotype pathologique (tremblements, altération du poids…) ainsi que l’identification de nouveaux bio-marqueurs et de nouvelles cibles qui contribuent au développement de meilleurs traitements des maladies neurologiques rares. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui de générer des nouveaux modèles de pathologies humaines chez le rongeur et de les caractériser afin de déterminer s’ils peuvent ou non devenir des modèles pertinents pour évaluer des composés issus de notre recherche sur leur capacité à ralentir ou arrêter la progression de ces maladies, dans le but de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner le meilleur modèle transgénique ou la meilleure méthode d’induction conduisant aux modèles de neuro-physiopathologies les plus pertinents sur une cible donnée dans le cadre de la recherche contre les maladies rares neurologiques.

Procédures

•Administration des médicaments vétérinaires analgésiques et anesthésiques par voie sous cutanée ou intra-péritonéale (contention d’une durée maximale de 30s) •Administration de composés de référence ou véhicule par voie intra-péritonéale, sous-cutanée, per os ou intra-veineuse (chez la souris vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 15 mois maximum) OU sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique par voie intra-cérébrale (durée maximale de 25 minutes – 2 fois maximum espacé de 14 jours) •Administration de substrat de bioluminescence selon la procédure expérimentale mise en oeuvre par voir intra-péritonéale (chez la souris vigile par contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par mois pendant 15 mois maximum) •Prélèvement de sang répété sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : oContention d’une durée maximale de 2min oPiqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes oPrélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques réalisées en Sous cutanée, Intra péritonéal. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. De l’administration d’agents inducteurs ou de composés de référence réalisées chez la souris vigile en Sous cutanée, Intra péritonéale, Intraveineux et Per Os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. OU selon la procédure mise en oeuvre, de la phase chirurgicale (2 chirurgies maximum séparées de 14 jours minimum d’une durée d’environ 20 minutes chacune) et du suivi post-opératoire. Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale ou saphène de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. D’une perte de poids potentielle limitée à 20% du poids de l’animal. Des signes cliniques observables associés à l’injection des agents inducteurs (troubles du comportement, altération de l’état général). La mise à jeun hydrique complète d’une durée maximale de 24h. Au-delà de 12h de jeun hydrique, les animaux peuvent présenter une perte de poids (

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal mimant la physiologie de la pathologie humaine. Il est donc nécessaire de valider les modèles physiopathologiques avant que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sain ou génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité des agents inducteurs aboutissant à la mise en place des modèles physiopathologiques plus relevant que les modèles in vitro existants, pour le traitement de maladies neurologiques rares. L’identification de modèles physiopathologiques qui récapitulent précisément les symptômes retrouvés chez les patients est critique afin de tester l’efficacité des nouvelles thérapies sur ces mêmes altérations. Le recours à l’animal est indispensable étant donné qu’une majorité des aspects physiopathologiques d’une maladie ne peuvent être récapitulés in silico ou in vitro.

Réduction

Les phases de caractérisation et de validation des modèles permettent d’appréhender le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour les études d’efficacité de traitements pharmacologiques. Aucun animal ne sera utilisé pour des études d’efficacité si le modèle d’induction n’est pas validé préalablement. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, un accompagnement par le service des Biostatistiques sera assuré dans le but d’affiner le design expérimental. Pour les procédures dans lesquelles plusieurs paramètres seront testés (temps de traitement, durée de la modification environnementale...), les conditions les moins invasives seront testées en priorité pour conclure sur la validité du modèle établi dans ces conditions et éviter l’utilisation de cohortes supplémentaires. Les conditions expérimentales sont basées sur l’expérience et les données disponibles dans la littérature. Le prélèvement de sang répété, peu invasif et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans le projet, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant différentes analyses biochimiques et/histologiques. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque modèle étudié.

Raffinement

Dans les modèles dont l’induction le nécessite ou lors de l’administration de certains composés de référence, les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Les souris seront hébergées en groupe dès l’arrivage et pendant toute la durée de l’étude, sauf si les caractéristiques liées à la souche ne le permettent pas (agressivité entre congénère…) et en accord avec les recommandations de la Structure de Bien-Être Animal. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Lors des injections de vecteurs viraux, il sera possible de suivre l’expression des protéines d’intérêt grâce à l’appareil IVIS Lumina. Il permet de réaliser une lecture de bioluminescence et de vérifier la qualité de l’injection intracérébrale. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Être Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale ou saphène de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur de possibles biomarqueurs. Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales (7 jours consécutifs) et pour les souris génétiquement altérées, réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Les recueils d’urine pour les examens biologiques seront réalisés sur litière hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux. Ce projet bénéficie d’une expérience interne et de données déjà existantes sur de nombreux modèles, tels que les « seeds » et les vecteurs viraux, mis en œuvre dans le cadre de plusieurs projets. Ainsi, cela constitue un socle de connaissance solide sur lequel nous nous appuyons afin de définir des mesures de raffinement cohérentes.

Choix des espèces

- La souris présente comme le rat une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. En particulier, sur le plan comportemental, de nombreux modèles d’induction et de tests ont été développés chez la souris, en miroir des fonctions cognitives, sensori-motrices, et des états émotionnels de l’Homme. - Les procédures d’induction et d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les modèles d'induction par agents biologiques chez la souris sont plus largement décrits dans la littérature que les modèles rat et notre expertise actuelle pour la souris est plus avancée que pour le rat. - La souris est génétiquement modifiable et ce avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), offrant une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neurodégénératives. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. L’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.

7 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines, génétiquement modifiées, reproduisent des maladies neurologiques rares et développent troubles moteurs, dégradation de l'état général et perte de poids, tandis que des candidats médicaments leur sont administrés jusqu'à treize semaines, avec pose de mini-pompes sous la peau et prélèvements sanguins répétés. Le porteur fixe un point limite à 20 % de perte de poids, seuil qui déclenche la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il affirme que seul l'animal possède un répertoire comportemental et neurophysiologique intégré permettant de tester l'efficacité des composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques, handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple l’amyotrophie spinale infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui d’identifier des composés issus de notre recherche capable de ralentir ou d’arrêter la progression de ces maladies, afin de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont testés in vivo chez la souris saine ou génétiquement modifiée afin d’évaluer leur effet dans le traitement des maladies rares neurologiques, et destinés à être administrés chez l’homme par différentes voies de traitement. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, le remplacement total ou partiel dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées génétiquement modifiées. Nous avons également recours à des souris génétiquement modifiées répondant en tant que modèle de physiopathologie humaine récapitulant une partie des caractéristiques pathologiques observées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner des candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques.

Procédures

• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) • Administration de composés testables, de référence ou véhicule (selon la voie d'administration) : animal vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 13 semaines maximum ou sous anesthesie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 25 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) ou encore avec mise en place d’une mini-pompe pour l’administration continue de composé implantée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 10 min – 1 fois par mois si nécessité de changer la mini-pompe) • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : Contention d’une durée maximale de 2min ; Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes ; Prélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -de l’administration de composés testés réalisée dans la première procédure chez la souris vigile avec une contention de 30s et une injection d’environ 10s qui peuvent également générer du stress. -Ou, dans la seconde procédure de la phase chirurgicale nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). -De signes cliniques liés à l’expression des altérations génétiques : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice), une altération de l’état général, des dermatites, de la perte de poids.

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sains et génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Dans un premier temps, une caractérisation des composés de référence est réalisée afin de déterminer la dose pharmacologiquement pertinente, choix basé sur les données de la littérature et les brevets issus de la concurrence (3 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Les effets toxiques potentiels des traitements pharmacologiques seront évités en administrant aux doses définies dans la littérature ou après détermination de la première dose toxique par l’équipe de toxicologie. A l’issue des premiers résultats obtenus, nous pouvons tester à la dose identifiée les candidats médicaments avec un faible effectif (3 à 5 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Ce premier filtre vivo permet de discriminer les composés afin de sélectionner uniquement les candidats pharmacologiquement intéressants. Ils seront ensuite évalués à différentes doses et différents temps post-administration à l’aide d’une approche descriptive (pas de tests statistiques). Les meilleurs candidats seront testés dans des études nécessitant plus d’animaux (pharmacocinétique / pharmacodynamie, …), une modélisation non linéaire et une approche statistique multi-critères est effectué en collaboration avec le service statistique dédié. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. La technique de prélèvement de sang dite par microsampling, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés par projet de recherche.

Raffinement

Les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Seules les souris opérées pour l’implantation d’une mini-pompe (type pompe alzet) seront remises en groupe après la phase de chirurgie si les caractéristiques de la souche le permettent. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Etre Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées). Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales, pour les souris génétiquement altérées, et/ou soumises à une étude pharmacologique chronique (procédure 2), réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Un suivi particulier sera réalisé pour les animaux faisant l’objet d’une administration de composés par voie intracérébrale. Plus précisément, un suivi post injection sera assuré dès le réveil de l’animal et par l’intermédiaire d’une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les animaux disposeront d’enrichissement dans leurs hébergements bâtonnets de coton ‘cocoon’ et de sizzle pad pour se construire un nid ou de morceau de bois à ronger dans leur cage d’hébergement et d’un tube en plexiglass.

Choix des espèces

La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. La souris est génétiquement modifiable, avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), et offre une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neuropsychiatriques. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. Quel que soit le modèle, l’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour bloquer localement l'expression d'un gène ou implanter une canule, puis des séances d'imagerie fonctionnelle, une partie ayant les vibrisses d'un côté coupées pendant deux semaines. Le porteur indique que le blocage de ces gènes peut provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs, et que la privation des vibrisses induit de l'anxiété et une altération de la mémoire à court terme. Il présente ce travail comme un moyen de mieux comprendre des maladies rares comme les syndromes de Rett, d'Angelman ou de l'X fragile, les souris étant tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont des pathologies très sévères et handicapantes et particulièrement mal comprises. Mieux comprendre les symptômes observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur des pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett, le syndrome d’Angelman, le syndrome de l’X fragile et la maladie de Niemann-Pick de type C. Ces maladies se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (des troubles cognitifs, moteurs, sensoriels ou épileptiques notamment). Les traitements existants sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier par différentes techniques de neuroimagerie l’impact du blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris. Cette étude permettra à la fois de répondre à des questions cruciales concernant le rôle respectif des gènes d’intérêt dans ces maladies, et de disposer de modèles animaux ainsi que de biomarqueurs d’imagerie permettant l’évaluation de futurs candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du systeme nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs grâce à l’identification des paramètres qui sont altérés de manière significative en imagerie.

Procédures

La quasi-totalité des animaux utilisés dans l’étude auront une unique intervention de chirurgie stéréotaxique, toujours sous anesthésie générale et analgésie d’une durée d’1h30 environ pour permettre : - L’injection stéréotaxique d’un vecteur permettant le blocage de l’expression d’un gène - Et/ou l’implantation stéréotaxique d’une canule pour l’imagerie par photométrie à fibre A la suite de cette intervention de chirurgie stéréotaxique des souris seront utilisées pour un unique examen d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui est non-invasif mais réalisé sous anesthésie générale (durée d’une heure). D’autres souris seront utilisées pour un total de deux examens d’imagerie fonctionnelle ultrasonore, toujours sous anesthésie générale, séparés par deux semaines. Pendant ces deux semaines, ces souris seront anesthésiées tous les deux jours pendant 5 minutes par isoflurane ; des souris auront les vibrisses coupées du côté gauche pendant cette anesthésie. Enfin, les souris implantées avec canule seront utilisées pour un unique examen d’imagerie photométrique, avec pour la plupart un examen de tomographie par émission de positons réalisé dans la foulée. La photométrie et la captation du radiotraceur se font chez la souris éveillée et libre de ses mouvements, puis l’imagerie par tomographie se fait chez la souris anesthésiée (pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le blocage de l’expression des gènes en question sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que dans une petite zone (contrairement aux patients) nous prévoyons des troubles légers survenant quelques jours après l’injection, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires (par exemple des atteintes transitoires des réflexes, ou encore des troubles de la mémoire et des interactions sociales dans des modèles rongeurs du syndrome de Rett avec déficience localisée du gène). Concernant la privation des vibrisses d’un côté pour une des procédures, il est rapporté qu’une privation chronique des vibrisses droites et gauches produit des symptômes légers d’anxiété et d’altération de la mémoire à court terme. Des symptômes similaires pourraient survenir durant les 2 semaines de privation que nous envisageons. Les chirurgies telles que l’injection stéréotaxique des vecteurs ou l’implantation de la fibre peuvent causer une douleur, elles seront donc réalisées dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie.

Devenir

De part la nécessité de prélever les cerveaux pour des analyses post-mortem, tous les animaux à la fin des procédures seront mis-à-mort.

Remplacement

La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude (l’efficacité des séquences shRNA est notamment évaluée au préalable sur des cultures cellulaires). Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures. De plus, ces travaux permettront d’établir des modèles animaux et des biomarqueurs in vivo pour l’évaluation de futurs candidats-médicaments, dont l’efficacité devra être vérifiée chez l’animal avant passage à l’humain.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique et nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie. Puis les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests statistiques selon les paramètres évalués. La validation du déficit local d’expression des gènes d’intérêt sera systématiquement effectuée au démarrage de l’étude pour vérifier l’impact des vecteurs sur les gènes d’intérêt avant toute utilisation des animaux en imagerie. Les mêmes animaux effectueront les examens d’imagerie comme la photométrie et la Tomographie par Emission de Positons de manière à réduire le nombre d’animaux final.

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce a une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce pour laquelle l’impact comportemental d’une inactivation des gènes d’intérêt est connu, parfois en lien avec des régions particulières du cerveau, ce qui nous apporte des informations précieuses sur les régions à cibler dans notre approche locale, et permettra une comparaison des données de la littérature avec nos propres résultats. A l’inverse, nos résultats seront intéressants pour la communauté scientifique car ils apporteront des informations spatiales et temporelles plus précises sur le rôle des gènes d’intérêt. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. Des études précliniques ont montré que l’inactivation tardive de certains gènes chez la souris adulte produit un décours de la pathologie similaire à une inactivation embryonnaire. Pour d’autres gènes, plusieurs arguments suggèrent également une importance du maintien à l’âge adulte de ces gènes notamment pour le maintien de la plasticité synaptique. Cette question est cruciale sur le plan clinique étant donné que le diagnostic de ces pathologies survient habituellement tardivement par rapport au stade de développement du cerveau. Il est donc important de savoir si corriger le déficit d’expression du gène après une maturation avancée du cerveau peut suffire à améliorer la qualité de vie des patients. C’est pourquoi nous souhaitons utiliser des souris adultes afin de mieux caractériser le rôle de ces gènes d’intérêt à ce stade. Notre approche par injection locale de vecteurs est particulièrement adaptée à cette problématique puisqu’elle permet de contrôler à la fois la localisation et le moment où le gène devient déficitaire.