Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Évaluation de la capacité du microbiote intestinal de donneurs humains, de différents niveaux d’entraînement physique, à moduler la susceptibilité et la sévérité d’une colite induite par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Vidées de leur flore intestinale par un cocktail d'antibiotiques à large spectre, gavées du microbiote fécal de donneurs humains, puis exposées au dextran sulfate de sodium pour déclencher une colite, 67 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si le microbiote de donneurs plus ou moins entraînés physiquement change la gravité de la colite, la souris servant d'intermédiaire entre une étude clinique menée sur des humains et ses conclusions. Le porteur écrit que "Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement", puis qu'aucun soin pharmacologique n'est possible et que les souris atteignant un point limite seront tuées.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comprenant la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent environ 7 millions de personnes dans le monde. Elles se caractérisent par des lésions digestives discontinues pour la première et une inflammation colique continue pour la seconde. Leur origine reste partiellement inconnue, mais elles résultent d’une réponse inflammatoire inappropriée chez des individus génétiquement prédisposés, influencée par des facteurs environnementaux, une dysbiose du microbiote intestinal et une altération de la barrière intestinale. L’activité physique (AP) est aujourd’hui reconnue comme un levier thérapeutique, notamment dans la prévention des maladies chroniques, et influence également le microbiote intestinal. Plusieurs études, dont une de notre laboratoire, ont montré un lien entre niveau d’entraînement et signatures microbiennes. Une AP modérée à élevée est associée à une plus grande diversité microbienne et à une production accrue de métabolites bénéfiques, tandis que la sédentarité ou un entraînement très intensif peuvent altérer ces fonctions. Cependant, le rôle exact de l’AP dans le développement et l’évolution des MICI reste encore mal compris. Dans ce cadre, nous menons une étude clinique visant à caractériser le microbiote intestinal en lien avec la capacité cardiovasculaire et le profil métabolique à l’exercice chez des individus de niveaux d’activité variés. En parallèle, une étude préclinique repose sur la transplantation de microbiote fécal de ces participants chez des souris, suivie de l’induction d’une colite chimique. Afin de de permettre l’étude du rôle causal du microbiote intestinal dans la susceptibilité aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, les souris recevront dans un premier temps un cocktail d’antibiotiques à large spectre. Cette étape permet une déplétion importante du microbiote résident, réduisant la variabilité interindividuelle et créant une niche écologique disponible pour une recolonisation contrôlée. Puis, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d’établir des microbiotes expérimentaux différenciés. Enfin, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d'établir des microbiotes expérimentaux différenciés.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation existe entre une signature bactérienne et fonctionnelle retrouvée chez les populations de différents niveaux d’entraînement et la susceptibilité de la réponse à une colite induite. Sur le plan de la santé, cette étude permettra d’identifier des profils ayant des signatures bactériennes et fonctionnelles pour 1) mieux comprendre les mécanismes d’apparition ou non des MICI et 2) développer des stratégies de prévention et de prise en charge personnalisées de ces maladies, fondées sur la modulation du microbiote intestinal.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute), un prelèvement sanguin de 100 μL et un prelèvement terminal intra-cardiaque avant la mise à mort. Les animaux subiront également le gavage oral pour la transplantation du microbiote fécale (FMT) des sujets humains et l’induction de la colite par le Dextran Sodium Sulfate.
Impact sur les animaux
Le traitement par antibiotiques à large spectre est administré à des doses extrapolées de celles utilisées en clinique humaine et ajustées au modèle animal. Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement. Ils comprennent, pour le traitement antibiotique, une déplétion du microbiote intestinal pouvant entraîner une modification temporaire du transit et une diminution de la fermentation bactérienne. Le gavage de suspension de microbiote peut induire un stress aigu transitoire lié à la manipulation ainsi qu’une possible fausse route. Enfin, l’induction de la colite par DSS entraîne des effets dose-dépendants incluant une perte de poids, une modification du transit intestinal (diarrhée), et une inflammation colique transitoire associée à une altération de la barrière épithéliale Les procédures de gavage peuvent engendrer un stress transitoire chez les animaux. Le traitement au Dextran Sodium Sulfate (DSS) peut induire des troubles gastro-intestinaux tels qu’une diarrhée et une inflammation intestinale transitoire, pouvant entraîner une perte de poids et une diminution de la prise alimentaire. Ces effets sont attendus, surveillés et limités dans le temps.
Devenir
A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses histologiques et moléculaires sur ces tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions dynamiques entre le microbiote intestinal de différentes signatures fonctionnelles et bactériennes et la réponse à la colite induite sur la physiogie de la barrière intestinale de l’hôte. Ces phénomènes impliquent des réponses systémiques, des interactions multi-organes et des adaptations physiologiques complexes. Il n’existe, à ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire fidèlement ces interactions intégrées et mimer la colite. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de permettre la mise en évidence d’une différence de sévérité de la colite entre les groupes expérimentaux, évaluée à partir de critères cliniques incluant la perte de poids, la consistance des selles et la présence de saignements. L’étude comprend cinq groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, le donneur de microbiote est considéré comme l’unité de réplication biologique. Plusieurs souris recevront le microbiote d’un même donneur, ce qui permet de prendre en compte la variabilité technique liée à la transplantation tout en réduisant le nombre total d’animaux. Par ailleurs, une procédure pilote sera réalisée sur 9 animaux (3 par groupe) afin d’évaluer la faisabilité du modèle et d’ajuster les conditions expérimentales. Cette étape permettra notamment de suivre la tolérance, la cinétique de perte de poids et la sévérité clinique, sans objectif de démonstration statistique. Elle vise à réduire le risque d’échec de la procédure principale et à éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 2 animaux par cage. Des jouets seront introduits afin de minimiser le stress induit par les différents traitements. Le raffinement est complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Un questionnaire pour mesurer le niveau d’inconfort des rongeurs est mis à disposition dans les locaux. En cas de souffrance ou inconfort constaté, toutes les mesures nécessaires pour réduire la souffrance seront mises en place. Compte tenu de la pathologie développée dans ce projet et de l’impossibilité de recourir à des soins pharmacologiques, les animaux présentant un inconfort lié à au moins l’un des points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle approprié pour l’étude du microbiote et de la barrière intestinale en raison : •De sa facilité de manipulation •De son homogénéité génétique Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre ainsi qu’une transplantation du microbiote fécal du l’Homme vers l’animal chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation. Pour étudier l'effet de la flore intestinale sur la susceptibilité de la réponse à la colite induite, il faut disposer d'animaux adultes dont le développement de la barrière intestinale et du système immunitaire est stabilisé.
Evaluation d’une source de protéines alternative sur l’état physiologique, immunitaire et le microbiote intestinal de la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Pour tester une protéine issue de fermentation destinée à remplacer une partie de la farine de poisson dans l'alimentation d'élevage, 180 truites arc-en-ciel sont nourries pendant 77 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont sorties de l'eau neuf fois en trois mois pour être pesées, et subissent deux collectes d'excréments obtenues par pression de l'abdomen, qui enflamment l'anus, ainsi qu'un prélèvement de sang. Un jeûne de 36 heures précède leur mise en bassin, et toutes sont tuées à la fin pour des prélèvements de tissus. Le bénéfice mis en avant tient à la durabilité de l'aquaculture et à une moindre dépendance à la farine de poisson et au soja, l'objet immédiat restant la validation d'un ingrédient pour la filière des aliments d'élevage.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer une nouvelle source de protéines issue de la fermentation pour l’alimentation des poissons d’élevage. L’objectif est de vérifier si cette source peut remplacer partiellement les protéines classiques, comme la farine de poisson qui provient de captures sauvages, tout en maintenant de bonnes performances de croissance et la santé des animaux. L’étude permettra également d’examiner ses effets sur la digestion, le fonctionnement de l’intestin et l’équilibre du microbiote, afin de mieux comprendre son impact global sur l’organisme. À terme, ce projet a pour objectif de contribuer au développement d’aliments plus durables, en identifiant des solutions alternatives permettant de réduire la dépendance aux ressources marines et végétales tout en garantissant l’efficacité et la sécurité des régimes alimentaires en aquaculture.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer une nouvelle source de protéines issue de levures pour l’alimentation des poissons d’élevage. Les résultats attendus permettront de vérifier que cette solution maintien de bonnes performances de croissance et un bon état de santé des animaux. L’identification d’une telle source protéique pourrait réduire l’utilisation de farine de poisson et limiter le recours au soja, contribuant ainsi à rendre l’aquaculture plus durable et moins dépendante de ressources limitées. Sur le plan environnemental, ces ingrédients issus de biotechnologies pourraient diminuer l’impact de la production aquacole, notamment en réduisant la pression sur les ressources marines et les rejets dans l’environnement. Plus largement, ce projet participe au développement de solutions nutritionnelles innovantes pour répondre à la demande croissante en protéines animales tout en améliorant la durabilité des systèmes de production.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 77 jours. Les animaux seront sortis hors de l'eau [[pour leur pesée ]] 9 fois en trois mois ; moins de 30 secondes. La collecte des excretas réalisée par pression délicate de l’abdomen, (3 passages, moins de 10 secondes) à raison de deux collectes par animal au cours de l’étude avec 1 semaine de récupération entre les deux collectes. Cette procédure sera effectuée sous anesthésie afin de limiter le stress et l’inconfort. Douleur transitoire à l’endroit du prélèvement de sang. Une mise à jeun de 36 h, correspondant aux pratiques standards de gestion en aquaculture des salmonidés, est appliquée afin de diminuer le stress métabolique avant la mise en place des animaux.
Impact sur les animaux
Stress dû à la capture et à la sortie des bassins pour la pesée et la collecte des excréta. Inflammation de l’anus dû à la compression de l’intestin pour la collecte des excreta. Saignement mineur et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement sanguin.
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus.
Remplacement
Au moment de la réalisation de la procédure expérimentale il n'existe aucun modèle in vitro ou in silico capable de reproduire tous les facteurs cellulaires et acellulaires impliqués dans les processus digestifs, l’absorption intestinale et les interactions avec le microbiote. De ce fait, la procédure est nécessaire et ne peut être remplacée par une autre stratégie qui n'implique pas l'utilisation d'animaux vivants.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux sont définies de sorte que la densité d'animaux, les paramètres environnementaux (température, luminosité), l'enrichissement des bassins (bâche semi-opaque simulant un refuge, aérateur stimulant les poissons) et la qualité de l'eau offrent un confort maximal aux animaux et restent conforme à la législation en vigueur. Aucun animal ne sera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, afin de minimiser l'anxiété et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou échantillonnage de sang ou de excréta) au cours de cette étude, les truites arc-en-ciel seront anesthésiées. La capture et le stress liés à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et le prélèvement seront réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l'utilisation de mousse humide pour placer l'animal sur le support de contention et un point de pression sur le site de prélèvement L’inconfort dû à la collecte des excréta est réduit par la mise en place d’une période de récupération d’une semaine entre les deux collectes.
Choix des espèces
Les truites utilisées dans cette étude pèseront environ 90 g au début du nourrissage et atteindront approximativement 346 g à la fin de la période expérimentale. Ces stades correspondent à la phase juvénile tardive / sub-adulte, reconnue comme particulièrement pertinente pour l’étude des réponses physiologiques, immunitaires et digestives chez les salmonidés. En effet, plusieurs travaux scientifiques montrent que cette gamme de poids (environ 50 g à 350 g) correspond à une phase de forte activité métabolique et de développement fonctionnel, notamment au niveau du système immunitaire et du microbiote intestinal. Durant cette période, les poissons présentent une sensibilité accrue aux facteurs nutritionnels, ce qui permet d’évaluer de manière fiable l’influence des matières premières sur l’homéostasie physiologique, la réponse immunitaire et l’équilibre du microbiote Ainsi, la gamme de poids utilisée dans ce protocole se situe dans une fenêtre physiologique optimale pour caractériser les effets d’un nouvel ingrédient sur l’état de santé global et la robustesse des animaux, dans des conditions d’élevage standard.
Traitement du microbiote intestinal et des intestins pour prévenir la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes mises à mort pour prélever leur cerveau et leurs intestins. Chacune est maintenue trois minutes par jour dans un dispositif de contention pour recevoir de la lumière rouge puis infrarouge sur l'abdomen, quatre à huit semaines pour les souris exposées au pesticide, cinq jours par semaine pendant seize mois pour les souris transgéniques. Une pompe implantée sous la peau du dos délivre la roténone, les souris sont mises à jeun jusqu'à douze heures, isolées jusqu'à huit heures sans eau ni nourriture pour la collecte des selles, gavées si elles refusent de boire les solutions de test, et les transgéniques développent à partir de douze mois une réduction locomotrice pouvant aller jusqu'à la paralysie. Le porteur annonce trois tests moteurs et des tests olfactifs sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative touchant 270 000 personnes en France. Elle se caractérise par la mort progressive et irréversible de certains neurones. Cette perte entraîne l’apparition de troubles moteurs (tremblements, lenteur des mouvements, rigidité musculaire) et non-moteurs (constipation, perte d’odorat, troubles du sommeil), invalidant progressivement les personnes atteintes jusqu’à conduire à leur décès. A ce jour aucun traitement curatif n’existe. La photobiomodulation (PBM) est un traitement innovant qui repose sur l’exposition des tissus à une lumière rouge et/ou proche infra-rouge. Des études précliniques sur la MP ont montré que l’application de la PBM à l’intérieur du cerveau permet une protection des neurones et une préservation des fonctions motrices. Cependant, cette technique est invasive et limite son application en clinique pour tous les patients. Des études récentes, ont montré l’importance de l’axe intestin-cerveau dans la MP, car des dysfonctionnements intestinaux (inflammation, déséquilibres de la flore intestinale et constipation) apparaissent souvent plusieurs années avant les symptômes moteurs et pourraient contribuer au déclenchement et la propagation de la maladie. L’objectif de ce projet est de déterminer si la PBM administrée au niveau de l’abdomen, influence la flore intestinale de manière à prévenir et ralentir la MP. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 modèles de souris de la MP : 1) Un modèle induit par l’exposition à un pesticide, la roténone, qui reproduit des caractéristiques majeures de la MP, telles que l’apparition de troubles moteurs et la dégénérescence de certains neurones tout en induisant des perturbations intestinales. Il permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de la PBM abdominale administrée précocement pour prévenir ou limiter les altérations de la MP induites par des facteurs environnementaux. 2) Un modèle génétiquement modifié, exprimant une des mutations génétiques humaines présente dans une forme familiale de la MP. Ce modèle présente un avantage majeur pour l’étude des stades précoces (avant l’apparition des symptômes moteurs) de la maladie. Sa cinétique lente offre un cadre privilégié pour tester l’efficacité préventive de la PBM abdominale, visant à moduler la flore intestinale dans le but de retarder ou empêcher l’installation de la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de la flore intestinale dans le développement de la maladie de Parkinson, d’identifier d’éventuels effets secondaires de la photobiomodulation et d’optimiser la fenêtre thérapeutique avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Ces travaux permettront à la fois de renforcer nos connaissances sur la maladie de Parkinson tout en favorisant l’émergence d’un nouveau traitement pour les patients.
Procédures
Toutes les souris seront entraînées progressivement à entrer et rester pendant 3 minutes dans un système de contention en vue d’être traitées par photobiomodulation. L’abdomen des souris qui recevront le traitement, sera exposé pendant 3 minutes à une lumière rouge puis infrarouge de faible intensité tous les jours pendant 4 semaines minimum et 8 semaines maximum pour le modèle exposé à un pesticide et 5 jours par semaine pendant 16 mois pour le modèle génétique. Pour exposer les souris au pesticide, celles-ci seront opérées sous anesthésie générale avec administration d’antalgique afin de placer sous la peau de leur dos, une mini-pompe qui délivrera le produit en faible quantité sur 4 semaines. Les fonctions motrices des souris seront évaluées à l’aide de 3 tests moteurs avant et pendant l’exposition au pesticide et tous les mois à partir de l’âge d’apparition des troubles moteurs (11 mois) pour le modèle génétique. Des tests olfactifs pourront être effectués tous les 6 mois pour le modèle génétique. Afin de déterminer si les souris présentent des troubles gastrointestinaux, elles seront entraînées pendant 3 jours à boire volontairement différentes substances. Dans le cas où cette procédure échouerait, l’administration se fera par gavage. Avant chaque test gastrointestinal, les souris pourront être mises à jeun pendant 4h. Pour évaluer le temps de transit, elles boiront un mélange contenant un pigment rouge et seront ensuite isolées dans des cages jusqu’à l’apparition d’une selle rouge ou pour une durée maximum de 8h. Pour évaluer la perméabilité intestinale, les souris boiront un mélange contenant une substance fluorescente. Quelques heures plus tard, un prélèvement sanguin (maximum 5 minutes) sera effectué soit en vigile dans un système de contention soit sous anesthésie générale. Pour récolter les selles et évaluer la constipation, les souris seront placées dans des cages individuelles sans eau ni nourriture pendant 1h. Les tests gastrointestinaux seront réalisés deux fois avant la chirurgie puis toutes les semaines après la chirurgie pour le modèle utilisant le pesticide ; et tous les 3 mois pour le modèle génétique. Une IRM d’une durée d’une heure pourra être réalisée une fois sous anesthésie générale pour toutes les souris. Pour évaluer la vidange gastrique, les souris seront mises à jeun une fois pendant 12h puis placées dans des cages individuelles avant d’être replacées dans leur cage d’origine avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont les suivants : • Le placement des souris dans un système de contention pendant 3 minutes peut provoquer un stress aigu ce qui pourra affecter temporairement leur bien-être physiologique et comportemental. • L’anesthésie des animaux peut entraîner du stress et des effets physiologiques transitoires notamment lors de l’induction et du réveil. • Pour les animaux opérés, l’implantation d’une pompe en sous-cutanée peut engendrer du stress, un inconfort, une faible perte de poids, de la douleur temporaire et un risque d’infection et d’inflammation au site d’incision. • Les tests gastrointestinaux nécessiteront l’isolement des animaux (8h maximum), des restrictions alimentaires pouvant aller jusqu’à 12h, et une administration de substances par boisson volontaire qui pourront entraîner du stress, des modifications physiologiques et comportementales chez les souris. Dans le cas où les souris refuseraient de boire volontairement les substances proposées, elles seront gavées ce qui pourra provoquer du stress, de l’inconfort, et occasionner des douleurs et blessures. • Le prélèvement sanguin peut provoquer une douleur aiguë mais brève ainsi qu’un stress transitoire principalement lié à la contention et à la manipulation. • Les tests de comportement pourront induire un stress transitoire lié à la manipulation et à l’exposition à un environnement nouveau. • Concernant les souris transgéniques, les animaux développeront progressivement, à partir de l’âge de 12 mois, une réduction des fonctions locomotrices pouvant conduire à une paralysie.
Devenir
Afin de déterminer l’efficacité de la photobiomodulation au niveau cellulaire, notamment pour évaluer l’effet protecteur du traitement sur les neurones et les changements induits sur le microbiote intestinale, toutes les souris seront mises à mort en fin d’expérience afin de prélever en post mortem leur cerveau et leurs intestins.
Remplacement
Les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire sont essentielles pour étudier la photobiomodulation (l'utilisation de la lumière à des fins thérapeutiques). Elles permettent de contrôler précisément différents paramètres, comme la couleur de la lumière, son intensité, la durée d'exposition ou encore le type de cellules étudiées. Cela permet d'observer directement les effets de la lumière sur les cellules, sans les nombreuses influences qui existent dans un organisme vivant. Des études précédentes réalisées sur des cellules intestinales et des bactéries du microbiote intestinal ont permis de déterminer les réglages de lumière les plus efficaces pour réduire l'inflammation et aider le microbiote à mieux résister au stress. Ces travaux ont également amélioré notre compréhension des interactions entre les cellules de l'intestin et les bactéries qui y vivent. Dans notre étude, qui s'intéresse aux liens entre l'intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson, l'utilisation de modèles animaux est nécessaire. En effet, ils permettent d'étudier les échanges complexes entre le cerveau et le microbiote intestinal, qui ne peuvent pas être reproduits avec de simples cultures cellulaires. Grâce aux connaissances obtenues lors des études en laboratoire, les modèles animaux permettront d'évaluer si les effets de la photobiomodulation sur l'intestin et le microbiote peuvent aussi avoir un impact sur le comportement, les capacités motrices, le fonctionnement du cerveau et la santé intestinale dans le contexte de la maladie de Parkinson. À l'heure actuelle, les modèles animaux restent les seuls outils permettant d'évaluer de manière globale l'efficacité d'un traitement sur les symptômes moteurs et non moteurs d'une maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un logiciel de statistique afin qu’il soit réduit au minimum tout en permettant de pouvoir observer un effet significatif du traitement.
Raffinement
Afin de réduire le stress lié au maintien des animaux dans un système de contention pour le traitement par photobiomodulation, les animaux seront habitués progressivement sur une semaine à entrer et rester de plus en plus longtemps, jusqu’à 3 minutes maximum, dans le système de contention. Pour l’implantation de la pompe, les animaux recevront un antalgique avant l’anesthésie générale. Pour prévenir toute baisse de température, les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et ce jusqu’au réveil sous une surveillance continue. Les animaux seront surveillés étroitement pendant 3 jours suivant la chirurgie et l’état général des animaux sera évalué selon une grille de score. Le traitement antalgique pourra être prolongé si besoin. Pour les tests de comportement, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation et à la pièce d’expérimentation afin de réduire au maximum tout stress occasionné. L’administration de substances guidée par micropipette sera précédée d’une période d’entraînement sur 3 jours afin que les souris apprennent à boire volontairement les solutions proposées pour les tests gastrointestinaux. Pendant les restrictions alimentaires et l’isolement des animaux, une surveillance attentive des animaux sera effectuée. Avant la mise à mort des souris, celles-ci recevront un antalgique puis seront soumises à une anesthésie générale. Les traitements antalgique et anesthésique se feront dans une pièce différente de la salle d’hébergement et d’euthanasie pour réduire et éviter la transmission d’un stress aux autres animaux. Un mois avant l’apparition des troubles moteurs, soit à partir de l’âge de 11 mois, l’état clinique des souris transgéniques sera évalué toutes les semaines à l’aide d’une grille de score afin de prévenir toutes souffrances.
Choix des espèces
La souris a une grande proximité génétique et biologique avec l’être humain, notamment au niveau des circuits nerveux impliqués dans la maladie de Parkinson. Environ 85 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, ce qui permet de reproduire certaines mutations responsables de la pathologie et d’observer leurs effets sur le cerveau. Les modèles de souris, qu’ils soient génétiques ou induits par des toxiques, reproduisent des caractéristiques essentielles de la maladie, notamment la dégénérescence de certains neurones et les troubles moteurs et non-moteurs. Par ailleurs, la souris est particulièrement adaptée à l’étude du microbiote intestinal, car sa flore intestinale peut être contrôlée, modifiée ou même remplacée, ce qui permet d’analyser précisément l’influence du microbiote sur l’inflammation et la communication entre l’intestin et le cerveau dans la maladie de Parkinson. Pour le modèle avec le pesticide, les souris utilisées seront adultes et auront entre 2 et 5 mois. La maladie de Parkinson touchant uniquement les adultes, l’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour reproduire les mécanismes de la maladie liés à l’âge et évaluer l’efficacité ainsi que la tolérance de la photobiomodulation dans un contexte biologique comparable à celui des patients. Les souris transgéniques seront utilisées entre l’âge de 1 et 17 mois car elles développent des troubles gastrointestinaux dès l’âge de 2 mois et le traitement par photobiomodulation doit commencer au moins un mois avant l’apparition des troubles gastrointestinaux pour pouvoir évaluer son effet préventif.
Utilisation du microbiote intestinal sur modèle murin femelle comme intervention thérapeutique dans la Maladie de Charcot.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Gavées quotidiennement pendant sept jours, soumises à des tests moteurs, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des examens d'imagerie avec traceur radioactif, 240 souris femelles vont être utilisées dans des procédures dont la moitié classées sévères. Elles développent une forme de la maladie de Charcot, avec perte de poids et parfois mort prématurée. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que ces modèles ne ressentent aucune douleur, alors qu'il classe 120 des 240 souris en souffrance sévère. Toutes sont tuées en fin d'étude pour prélever cerveau, moelle épinière, intestin et muscle.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénerative grave qui touche progressivement les neurones responsables des mouvements. Avec le temps, elle entraîne une perte de la force musculaire et de la mobilité. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de stopper l’évolution de la maladie. Cette maladie ne concerne pas uniquement le cerveau et la moelle épinière : elle s’accompagne aussi de dérèglements du système immunitaire, du métabolisme et de la gestion de l’énergie par l’organisme. De plus en plus d’études montrent que les bactéries présentes naturellement dans l’intestin, appelées microbiote intestinal, jouent un rôle important dans la santé globale. Elles participent notamment à la digestion, au bon fonctionnement du système immunitaire et à la communication entre l’intestin et le cerveau. Des modifications de ce microbiote ont été observées chez les patients atteints de maladie de Charcot, suggérant qu’il pourrait influencer l’évolution de la maladie. Ce projet a pour objectif d’étudier si le transfert de microbiote intestinal provenant de souris jeunes et en bonne santé peut avoir un effet bénéfique dans des modèles de souris atteintes d’une forme de la maladie de Charcot. L’idée est de rééquilibrer le microbiote intestinal afin d’agir indirectement sur les mécanismes impliqués dans la maladie, comme l’inflammation et les troubles du métabolisme. Nous faisons l’hypothèse qu’en restaurant un microbiote plus équilibré, il serait possible de réduire l’inflammation, d’améliorer certaines fonctions de l’organisme et de ralentir la progression de la maladie. Pour cela, les souris seront suivies dans le temps afin d’évaluer leur comportement, leur motricité et différents paramètres biologiques. L’utilisation de plusieurs modèles de souris (3 au total) permettra également de mieux comprendre pourquoi la maladie de Charcot se manifeste différemment d’un individu à l’autre, et d’identifier des mécanismes communs reliant le microbiote intestinal, le métabolisme et la dégénérescence du système nerveux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de suivre dans le temps les effets d’un transfert de microbiote intestinal chez des souris modèles de la maladie de Charcot. Cela permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes impliques dans cette maladie. L’étude s’intéressera à plusieurs aspects de la maladie, notamment l’évolution du microbiote intestinal, le fonctionnement du métabolisme, les réactions inflammatoires, les capacités motrices et le comportement des animaux, ainsi que les altérations observées dans le système nerveux. En combinant ces différentes observations, les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment l’intestin et le cerveau communiquent entre eux dans le contexte de la maladie de Charcot, et comment un rééquilibrage du microbiote intestinal pourrait influencer l’évolution de la maladie. L’utilisation de plusieurs modèles de souris représentant différentes formes de la maladie de Charcot permettra également de prendre en compte la diversité de la maladie. Cette approche aidera à comprendre pourquoi les symptômes et la progression de la maladie de Charcot peuvent varier d’un individu à l’autre, et à identifier des mécanismes communs pouvant être ciblés par de futures stratégies thérapeutiques. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation du microbiote intestinal, en complément des traitements existants. Il contribuera ainsi au développement de pistes de recherche innovantes susceptibles d’améliorer la prise en charge future des patients atteints de maladie de Charcot.
Procédures
Les souris utilisées développent spontanément une maladie neurodégénérative. D'après les connaissances scientifiques actuelles, cette affection n'est pas associée à une douleur chez l'animal. Au cours du projet (environ 12 semaines par groupe), les animaux feront l'objet de différentes interventions : génotypage, administration de traitements, suivi régulier, prélèvements et examens d'imagerie. Administration du traitement : toutes les souris recevront soit un transfert de microbiote intestinal, soit un traitement contrôle, donné par la bouche à l'aide d'une sonde souple adaptée. Cette intervention sera réalisée une fois par jour pendant 7 jours consécutifs et durera environ 1 à 2 minutes par animal. Elle sera effectuée sur des animaux éveillés (240 souris). Suivi et observations : les animaux seront pesés une fois par semaine. Des tests permettant d'évaluer leurs capacités motrices et leur comportement seront réalisés toutes les deux semaines. Chaque session durera environ 30 à 45 minutes par souris, avec des périodes de repos. Ces observations concernent 216 souris suivies dans le temps. Prélèvements sanguins : de petits volumes de sang seront prélevés une fois par mois, avec un maximum de trois prélèvements par animal. Une courte anesthésie gazeuse sera réalisée avant chaque prélèvement, d'une durée d'environ 4 minutes. Le prélèvement lui-même durera 2 à 3 minutes. Ces procédures concernent 216 souris. Examens d'imagerie : chaque souris bénéficiera de deux examens, au début et à la fin de l'étude. Ces examens nécessitent l'administration de substances permettant de visualiser certaines fonctions du cerveau. Une injection sera réalisée sur animal éveillé, et une autre sous anesthésie. Chaque session durera environ 40 minutes, incluant l'anesthésie et le réveil. Ces examens concernent 216 souris. Fin de l'étude : les animaux seront euthanasiés de manière encadrée par une administration de produit anesthésiant à forte dose, puis des prélèvements d'organes seront réalisés.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris utilisés développent spontanément un phénotype neurodégénératif mais il est établi et largement reportée dans la littérature qu’aucune douleur n’est ressentie par les animaux. Une perte de poids et un dysfonctionnement intestinal pouvant entraîner un décès prématuré pourront être observé dans l’un des modèles. Les nuisances liées aux procédures expérimentales sont les suivantes : • Gavage oral : légère gêne ou stress pendant la manipulation et risque d’une légère inflammation de l’œsophage transitoire (quelques minutes) • Imagerie : stress lié à la manipulation et à l’induction de l’anesthésie. De plus, légère douleur ou inconfort au site d’injection du traceur radioactif et possible formation d’un hématome suite à l’injection du traceur radioactif ciblant la neuroinflammation. • Prélèvements sanguins : douleur ou risque d’hématome selon le site (veine sublinguale) et un possible stress temporaire peut être engendré lors des contentions. • Tests comportementaux et moteurs : stress lié à la manipulation et aux contraintes physiques. Les animaux seront habitués aux manipulations pour réduire le stress.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement d’organes (cerveau, moelle épinière, intestin, muscle) nécessaires aux analyses finales.
Remplacement
Les méthodes alternatives réalisées en laboratoire, sans utilisation d’animaux, ne permettent pas d’étudier le fonctionnement de l’organisme dans son ensemble. Or, la maladie de Charcot ne concerne pas uniquement le système nerveux : elle s’accompagne aussi de modifications au niveau de l’intestin, du métabolisme et du système immunitaire. Des travaux scientifiques antérieurs, menés par notre équipe et par d’autres, ont montré que cette maladie est associée à un déséquilibre des bactéries présentes dans l’intestin, ainsi qu’à des perturbations du fonctionnement global de l’organisme et à une inflammation. Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre plusieurs organes, avec des échanges permanents entre l’intestin, le cerveau et le reste du corps. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites dans des modèles simplifiés en laboratoire, comme des cultures de cellules. De plus, l’approche utilisée dans ce projet consiste à transférer l’ensemble des bactéries intestinales d’un individu à un autre. Cette méthode entraîne des modifications globales et naturelles de l’équilibre des bactéries intestinales. Un tel processus ne peut pas être reproduit en laboratoire, ni en utilisant uniquement des bactéries isolées. L’utilisation de souris est donc nécessaire pour étudier l’impact de ces modifications à l’échelle de l’organisme entier. Ce modèle permet d’observer simultanément les effets sur le cerveau, l’intestin et les autres fonctions de l’organisme, ce qui est indispensable pour comprendre comment ces différents éléments interagissent et influencent l’évolution de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé afin d’en utiliser le moins possible tout en garantissant des résultats fiables. Sur la base d’études scientifiques antérieures portant sur la maladie de Charcot, un effectif de 12 souris par groupe est considéré comme suffisant pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes étudiés. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour analyser les résultats et vérifier leur fiabilité. À cet effectif s’ajoutent 3 souris par groupe, qui seront utilisées uniquement au début de l’étude afin de vérifier que le transfert des bactéries intestinales a bien fonctionné. Ces animaux ne seront pas suivis sur la durée. En raison des différences possibles entre les animaux et du risque de décès prématuré lié à la maladie, le nombre de souris par groupe est porté à 20. Cela permet de conserver un nombre suffisant d’animaux jusqu’à la fin de l’étude, sans avoir à utiliser de nouveaux groupes. Pour chacune des trois lignées de souris étudiées, quatre groupes seront constitués : des souris malades recevant le transfert de bactéries intestinales, des souris malades recevant un traitement contrôle, des souris saines recevant le transfert, et des souris saines recevant le traitement contrôle. Chaque groupe comprendra 20 souris, soit un total de 240 animaux pour l’ensemble du projet. Le nombre total d’animaux est également réduit grâce au suivi des mêmes souris tout au long de l’étude. Plusieurs types de mesures (comportement, analyses biologiques et examens d’imagerie) seront réalisés sur un même animal. Cette approche permet d’obtenir un grand nombre d’informations sans multiplier les groupes d’animaux, et contribue ainsi à limiter leur utilisation.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours avant le début de l’étude. Durant cette période, ils seront habitués à la manipulation afin de réduire leur stress : ils seront pris doucement dans les mains, caressés et autorisés à se déplacer librement. Plusieurs mesures seront mises en place pour limiter la souffrance et améliorer leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement dans leur environnement. Une alimentation adaptée sera fournie. Certaines souris pouvant présenter des troubles digestifs recevront une nourriture sous forme gélifiée dès les premiers stades de la maladie afin de prévenir les complications. Pour tous les animaux, cette alimentation sera également proposée dès les premiers signes de maladie afin de limiter la perte de poids. Ils y seront habitués progressivement en la recevant comme une récompense. En cas de difficultés à se déplacer, la nourriture sera placée directement dans la cage pour en faciliter l’accès. Les animaux seront également habitués aux différentes manipulations nécessaires aux procédures, notamment à être pris en main et placés dans les dispositifs utilisés pour l’anesthésie. Leur état de santé sera surveillé régulièrement (trois fois par semaine) à l’aide d’une grille d’évaluation et par la mesure de leur poids. En cas de douleur ou de blessure, un traitement antidouleur sera administré et les soins nécessaires seront réalisés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous une courte anesthésie afin de limiter l’inconfort. Des critères précis permettront d’identifier rapidement toute dégradation de l’état de santé. En cas de signes de mal-être, une surveillance renforcée sera mise en place. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas rapidement ou devient sévère, il sera euthanasié de manière encadrée afin d’éviter toute souffrance. Certains critères incluent notamment une perte de poids importante ou des difficultés à se redresser. Lors des examens d’imagerie, les animaux seront anesthésiés. Leur respiration et leur température seront surveillées en continu et une protection des yeux sera assurée.
Choix des espèces
Il existe peu de modèles animaux permettant d’étudier la maladie de Charcot dans des conditions adaptées à ce projet. Trois lignées de souris ont été sélectionnées car elles développent la maladie de manière progressive, ce qui permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Ces modèles présentent également des différences importantes, notamment dans la vitesse d’évolution de la maladie, les mécanismes biologiques impliqués et les symptômes observés, y compris au niveau digestif. Ces différences sont essentielles pour mieux représenter la diversité de la maladie observée chez les patients. Elles permettent d’étudier comment une modification des bactéries intestinales peut influencer l’évolution de la maladie dans différents contextes. Les méthodes alternatives réalisées en laboratoire, sans animaux, ne permettent pas de reproduire les interactions complexes entre l’intestin, le système nerveux, le métabolisme et l’inflammation à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation de ces modèles animaux est donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Les souris utilisées seront des femelles adultes. Pour les trois lignées étudiées, le début de l’étude correspond à une phase où les animaux ne présentent pas encore de signes visibles de la maladie. Cela permet d’observer l’apparition et la progression des symptômes au cours du temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de l’étude afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et d’obtenir des données complètes sur l’évolution de la maladie.
Rôle du microbiote intestinal au cours de la spondylarthrite du rat transgénique pour le HLA-B27
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
288 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue, pour étudier le rôle du microbiote dans une forme de rhumatisme inflammatoire. Chaque animal reçoit six administrations orales de composés bactériens puis est suivi six mois, développant diarrhée, arthrites des pattes arrière et, spontanément, une inflammation des testicules. Le modèle transgénique est présenté comme le "seul" à reproduire l'ensemble des atteintes de la maladie. Le porteur juge son usage "indispensable" pour disséquer les mécanismes, en vue d'une application chez l'humain.
Objectifs
La Spondylarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent au sein de la population adulte française. Le gène d’intérêt est fortement associé au développement de la maladie et constitue le facteur génétique principal multipliant le risque de développer cette maladie par 40. Malgré une association démontrée il y a plus de 50 ans, les raisons pour lesquelles ce gène confère cette prédisposition sont encore peu connues. L’identification des mécanismes impliqués dans l’association gène/maladie est importante car c’est une maladie fréquente, touchant 0,45% de la population adulte en France. De manière importante, il n’existe aucun traitement curatif, seulement des thérapies ralentissant la progression de l’état inflammatoire et de la maladie. Les modèles in vitro ne permettent pas d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques car ils ne récapitulent pas la complexité d’un organisme. Ainsi, l’étude du rat surexprimant le gène d’intérêt constitue le seul modèle récapitulant toutes les atteintes de la SpA.: une inflammation articulaire chronique, une inflammation intestinale et des atteintes inflammatoires de la peau et des griffes. Le développement de ces symptômes cliniques nécessite une un ensemble normal des microbes (bactéries surtout) vivant naturellement dans un organisme (par exemple dans l’intestin), ainsi ces rats élevés en condition stérile ne développent pas de SpA. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer l’influence des constituants du microbiote intestinal sur l’activation des cellules du système immunitaire du rat conduisant au développement de la SpA et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Une meilleure compréhension du rôle pathogène de ces microbes et de leurs constituants pourra conduire à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos expériences consisteront d’abord à administrer des ces microbes à des rats puis à évaluer l’activation des cellules du système immunitaire et s’ils sont capables d’induire la SpA. L’ensemble de ces approches permettra de révéler les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal et ses composants influencent l’activation des cellules immunitaires au cours de la SpA, dans l’objectif final d’identifier et tester de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La spondylarthrite (SpA) est une maladie complexe qui résulte à la fois de facteurs héréditaires et de l’environnement. Elle provoque une inflammation anormale dans l’organisme, entraînant des douleurs importantes et un handicap, souvent chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la maladie, seulement des traitements pour en atténuer les symptômes. Mieux comprendre comment le système immunitaire interagit avec les micro‑organismes vivant naturellement dans l’intestin (le microbiote) pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques. L’utilisation d’un modèle animal chez le rat est indispensable pour étudier ces mécanismes en détail et analyser des tissus touchés par la maladie, comme les articulations, qui ne peuvent pas être prélevés régulièrement chez l’être humain. De plus, les études visant à modifier le microbiote doivent d’abord être réalisées chez l’animal avant toute application chez l’Homme. De telles recherches ont déjà permis, par le passé, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, dont certaines sont aujourd’hui utilisées avec succès en pratique clinique.
Procédures
Lors de la procédure, les rats recevront 6 administrations de composés bactériens par voie orale (durée 15 secondes). Les animaux seront suivis ensuite pendant 6 mois pour le développement de la SpA. Des prélèvements de selles fraîches seront effectuées au cours de l’expérimentation à raison de 1 fois toutes les 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent les rats qui développent de manière spontanée une inflammation testiculaire en conditions stériles. À la suite de la colonisation par des bactéries les rats peuvent développer une SpA. Le premier symptôme est la survenue d’une inflammation intestinale se traduisant par une diarrhée qui sera accompagnée par des arthrites (inflammation au niveau des articulations) aux pattes arrière. Ces arthrites évoluent au cours du temps et certaines se résorbent complètement (environ 20% des cas). Les administrations par voie orale et la collection des selles présenteront un léger inconfort aux animaux le plus souvent associé à la contention de l’animal. En cas de douleur, un traitement antalgique par voie sous-cutanée sera mis en place.
Devenir
Tous les animaux issus de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure. Les organes et tissus seront ensuite collectés pour des analyses biologiques et histologies et ajoutés dès que possible à une biobanque limitant des ajouts futurs d’animaux
Remplacement
Les cultures cellulaires in vitro ne sont pas adaptées pour étudier l’interaction hôte–microbiote dans ce contexte, car la maladie étudiée est complexe et implique plusieurs organes (intestin et articulations). Ces modèles simplifiés risquent de ne pas reproduire les mécanismes biologiques pertinents et ne permettent pas de maintenir les conditions anaérobies nécessaires au microbiote. Il est donc nécessaire de recourir à un organisme vivant. Des tests in vitro sont néanmoins réalisés en amont pour vérifier l’absence de toxicité des substances testées.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est strictement limité tout en garantissant que les conclusions tirées d’une étude sont fiables et peuvent être considérées avec confiance afin de respecter le principe de réduction. Plusieurs tests statistiques préalables nous permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet réel, fiable et peu probable d’être dû au hasard. Des tests pour déterminer l’effet sur le développement et la sévérité de la SpA nécessitent des effectifs plus élevés (6 animaux par groupe) Ce projet s’inscrit dans une thématique importante avec des projets similaires menés dans d’autres établissements. Enfin, les analyses seront faites à la fin de chacune des expériences et permettront le cas échéant de ne pas effectuer une expérience supplémentaire si la significativité est atteinte
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement sont mises en œuvre pour garantir le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour l’administration par voie orale de composés du microbiote, nous utiliserons une canule en plastique adaptée à l’animal et à son poids, afin de diminuer la douleur liée à la procédure. Les changes des cages seront plus fréquents chez les animaux dont l'inflammation intestinale est présente. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel compétent, permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou d’inconfort. Ces observations sont effectuées par le personnel de zootechnie, par le vétérinaire lors des contrôles réguliers et par les expérimentateurs. L'administration d'un médicament analgésique est prévue pour limiter les douleurs liées à la SpA. En cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, l’alimentation humidifiée avec de l’eau sera mise à disposition dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Des points limites ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est le rat, en raison de sa pertinence préclinique et de son adéquation expérimentale mimant la SpA. Les rats surexprimant le gène d’intérêt permettent ainsi d’évaluer l’efficacité des traitements en fonction des atteintes cliniques. Les analyses cellulaires, moléculaires, histologiques et cliniques permettent d’appréhender le bénéfice fonctionnel global, tout en respectant les principes des 3R. Ainsi, l’utilisation des rats surexprimant le gène d’intérêt est essentielle afin de disséquer les mécanismes pathogéniques de la SpA. Par ailleurs, les expérimentations de modulation du microbiote doivent être réalisées chez le rat en vue d’une application chez l’Homme. Les animaux utilisés dans ce projet seront des rats à différents stades de développement allant de 3 semaines d’âge (correspondant au sevrage chez le rat : période de colonisation bactérienne) à l’adulte. Ce choix permet d’évaluer le rôle des composant du microbiote lors du développement de la SpA du rat.
MODIFICATION 2 Régulation des interactions Hôte-Microbiote et impact en santé inflammatoire et métabolique.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
10 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant subir un gavage oral quotidien pendant dix mois. Le projet étudie la régulation du microbiote intestinal et son rôle dans les maladies inflammatoires. Certaines approches induisent une inflammation intestinale chronique, un cancer colorectal ou un diabète chez les souris. La mise à mort finale sert à prélever les organes pour analyse.
Objectifs
Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer les facteurs environnementaux régulant le microbiote intestinal, ainsi que de caractériser les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal peut conduire au développement de maladies inflammatoires chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal est régulé, et l’importance de ce dernier dans les maladies inflammatoires
Procédures
MODIFICATIONS 2 texte en majuscules LES ANIMAUX SERONT SOUMIS À DES PRÉLÈVEMENTS DE SANGS DE 5 À 10µL PAR PRÉLÈVEMENT SUR ANIMAUX VIGILES. LES ANIMAUX SUBIRONT 4 PRÉLÈVEMENTS UNIQUES DE SANG POUR UNE DURÉE INFÉRIEURE À 1 MINUTE. MODIFICATIONS texte en majuscules LES ANIMAUX SUBIRONT 6 PRÉLÈVEMENTS MULTIPLES DE SANG SUR UNE DURÉE DE 2H, CHACUN DE CES PRÉLÈVEMENTS MULTIPLES SERONT SÉPARÉS D’AU MOINS UNE SEMAINE. LES ANIMAUX SUBIRONT AU MINIMUM 1 GAVAGE ORAL HEBDOMADAIRE ET AU MAXIMUM 1 GAVAGE ORAL QUOTIDIEN D’UN VOLUME MAXIMAL DE 200MICROL SUR PÉRIODE DE 10 MOIS. LES ANIMAUX SUBIRONT UN PRÉLÈVEMENT UNIQUE DE SANG EN FIN DE PROTOCOLE.
Impact sur les animaux
MODIFICATIONS 2 texte en majuscules Certaines approches induiront une inflammation intestinale chronique et/ou un cancer colorectal chez les animaux. De plus, certains animaux développeront des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse. Les facteurs alimentaires étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. ENFIN, LES SOURIS DIABÉTIQUES PRÉSENTERONT UNE SOIF EXCESSIVE ET UN BESOIN ANORMAL DE BOIRE DE GRANDES QUANTITÉS D’EAU INDUISANT UNE AUGMENTATION DE LA FRÉQUENCE DES MICTIONS. Aucun stress ni comportement anormal n’est anticipé. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures proposées, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en lien avec le développement de pathologies inflammatoires chroniques.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 15 souris par condition et par sexe était nécessaire être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès des biostatisticiens.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.
Choix des espèces
L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 3-8 semaines d’âge lors du démarrage des différentes procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser de jeunes animaux afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote.
Rôle d’un métabolite (D-sérine) produit par l’intestin et le microbiote dans le dialogue intestin–cerveau au cours des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises à une inflammation intestinale induite, à un gavage quotidien et à une distension colorectale répétée, 1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le RNT classe le test de la nage forcée comme sévère et décrit une inflammation pouvant provoquer perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles. Ce travail de recherche fondamentale explore le rôle d'un métabolite dans le dialogue intestin-cerveau, les perspectives thérapeutiques étant repoussées au "long terme". Toutes les souris sont mises à mort pour le prélèvement de tissus.
Objectifs
La finalité de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inflammation intestinale et les douleurs abdominales associées, dans le cadre de l’axe reliant le microbiote intestinal et le fonctionnement de l’organisme. Ce travail relève de la recherche fondamentale. Il vise à identifier comment certaines bactéries intestinales et certaines molécules naturellement présentes dans le corps peuvent influencer l’inflammation et la sensibilité de l’intestin. À court terme, le projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’apparition et le maintien de l’inflammation intestinale et des douleurs associées. À moyen terme, il permettra d’évaluer le potentiel de certaines bactéries dites « probiotiques » pour moduler l’inflammation et limiter les douleurs dans un modèle expérimental. À long terme, ces résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote intestinal afin d’améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires intestinales et des douleurs abdominales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes de communication entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau, en identifiant le rôle spécifique du métabolisme de la D-sérine et des acides aminés de configuration D dans les troubles inflammatoires intestinaux. Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des liens entre inflammation intestinale, dysbiose du microbiote et altérations des fonctions cérébrales associées (comportements anxio-dépressifs et troubles cognitifs). Ce projet fournira également des données translationales originales issues de modèles animaux et d’échantillons de patients, susceptibles d’identifier de nouveaux biomarqueurs liés au métabolisme de la D-sérine dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Enfin, l’évaluation de stratégies innovantes de modulation du métabolisme intestinal de la D-sérine, notamment via l’utilisation de probiotiques ciblés, ouvrira des perspectives thérapeutiques nouvelles pour la prise en charge des troubles intestinaux et de leurs comorbidités neuropsychiques.
Procédures
Les animaux peuvent être soumis aux interventions suivantes : Administration d’une substance dans l’eau de boisson afin d’induire une inflammation intestinale temporaire. Administration quotidienne par gavage oral d’une préparation probiotique pendant 7 jours. Réalisation de tests comportementaux (test de la nage forcée et test du labyrinthe en croix surélevé). Mesure de la sensibilité intestinale par distension colorectale. Prélèvements de selles. Mise à mort réglementaire en fin de procédure suivie du prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Inflammation intestinale induite : nuisance modérée, pouvant entraîner perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles pendant quelques jours (durée limitée à la période d’exposition). Gavage oral quotidien : nuisance légère à modérée, correspondant à un stress transitoire lié à la manipulation (quelques minutes par jour pendant 7 jours). Test du labyrinthe en croix surélevé : nuisance modérée, liée à un stress et une anxiété transitoires (durée du test : quelques minutes). Test de la nage forcée : procédure classée sévère, induisant un stress aigu lors de l’exposition à l’eau (durée limitée au temps du test). Distension colorectale : nuisance modérée à sévère, correspondant à un inconfort intestinal bref et répété (quelques secondes à quelques minutes lors de la mesure). Prélèvements de selles : nuisance faible, car réalisés sans geste invasif.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser différents prélèvements de tissus.
Remplacement
Les mécanismes étudiés impliquent des interactions complexes entre l’intestin, le microbiote et l’organisme entier. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un modèle in vitro ou informatique. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les différentes analyses sont réalisées sur les mêmes animaux afin d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires.
Raffinement
Les procédures ont été conçues pour limiter le stress et l’inconfort. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation, d’un suivi clinique régulier et de points limites prédictifs permettant l’arrêt immédiat de la procédure si nécessaire. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinale et métabolique et immunitaire
Stratégies pour reproduire chez la souris la disparité interindividuelle constatée chez l’humain quant à la capacité du microbiote intestinal à métaboliser certains phytoœstrogènes
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tatoués à la naissance, adoptés par d'autres mères ou nourris chaque jour de suspensions bactériennes pendant la lactation, les souriceaux de 36 portées sont suivis en croissance puis tués pour accéder à leur contenu intestinal. Avec 72 femelles adultes, 346 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'objectif est de reproduire chez la souris la variabilité humaine du microbiote à transformer les isoflavones du soja. Les mères non retenues pour un recyclage sont elles aussi tuées, l'étude ne portant que sur les descendants.
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle préclinique reproduisant la disparité interindividuelle qui existe chez les humains quant à la capacité de leur microbiote intestinal à convertir certains composés végétaux – les isoflavones (IFs) qui constituent un sous-groupe des phytooestrogènes- en métabolites capables de mimer l’activité des oestrogènes. Chez l’être humain, cette disparité interindividuelle est supposée être à l’origine des susceptibilités variables vis-à-vis des pathologies hormono-sensibles (ex cancers du sein, de la prostate…). Or chez les rongeurs, par ailleurs cruciaux pour l’étude de ces telles pathologies, cette disparité n’est pas observée entre les individus appartenant à une même souche génétique mais elle a été constatée entre individus de souches différentes ou issus d’élevages différents. Les expérimentations menées dans ce projet auront donc 3 objectifs, chacun donnant lieu à une procédure. Il s’agit de : 1) sélectionner des souris de souches différentes ou issues d’élevages différents dont les microbiotes intestinaux présentent effectivement des capacités différentes à convertir les IFs (procédure 1); puis 2) en tirant parti de l'influence prouvée de la souris allaitante sur l'assemblage du microbiote intestinal de sa progéniture, vérifier que ces différences sont transmises durablement par adoption dès la naissance (procédure 2) ; et enfin, dans le scenario où les adoptions se révèleraient inefficaces, 3) tester si les différences peuvent être induites par l’administration orale précoce de souches bactériennes capables ou non de dégrader les IFs (procédure 3).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d’un modèle de souris plus représentatif de la physiopathologie humaine qui reproduira la disparité des capacités des microbiotes intestinaux individuels à convertir les IFs en molécules dotées d’activités biologiques mimant celles des œstrogènes. Un tel modèle constituera une avancée notable pour étudier le rôle de l’alimentation, en particulier végétale, dans les situations de perturbation endocrinienne et de cancers hormonodépendants et améliorer les stratégies de leur prévention primaire et secondaire.
Procédures
Les 72 souris femelles utilisées à l’âge adulte dans le cadre de la procédure 1 seront soumises à un suivi de poids vif, un test nutritionnel et, en une unique occasion, à un prélèvement sanguin sur animal vigile (
Impact sur les animaux
Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par les procédures consisteront en : - du stress induit par les adoptions (procédure 2), l’ajustement des portées et les suivis de croissance (procédures 2 & 3) ; - des contentions (> 2min) appliquées lors des prélèvements sanguins qui seront effectués sur les femelles adultes vigiles (procédure 1) et lors des biberonnages (procédure 3).
Devenir
La mise à mort des femelles incluses dans la procédure 1 et des descendants inclus dans les procédures 2 & 3 est rendue nécessaire par le besoin d’accéder aux contenus intestinaux (grêle et caeco-côlon). Les mères génitrices ou allaitantes utilisées dans les procédures 2 et 3 et non acceptées pour recyclage par les autres personnels seront également mises à mort puisque l’étude porte uniquement sur les descendants.
Remplacement
La nature des métabolites produits par le microbiote intestinal à partir des isoflavones (IFs) est la résultante entre le devenir digestif de ces IFs, déterminé en partie par la physiologie intestinale de l’animal étudié et les potentialités métaboliques du microbiote, déterminé par la nature des espèces bactériennes qui le composent, leurs interactions et les conditions physicochimiques intestinales qui régulent son activité. En conséquence, seule l’étude in vivo, qui rend pleinement compte des processus digestifs et absorptifs d’une part et de la physiologie des écosystèmes microbiens d’autre part, permet de mesurer la capacité du microbiote à métaboliser les IFs de façon pertinente.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en tenant compte du principe de réduction ainsi que des nombres d’individus nécessaires à l’obtention d’une conclusion significative, des risques de gestation non confirmée ou de taille de portée insuffisante. Les nombres d’individus nécessaires ont été déterminés par calcul statistique d’effectif à partir de concentrations plasmatiques en métabolites bactériens produits à partir des IFs, mesurées chez des souris placées en conditions favorisant ou non ce métabolisme. La procédure 1 repose sur le traitement de souris adultes, chacune constituant un individu statistique indépendant. De ce fait, 9 souris de chacun des 5 types (souche X élevage) seront commandées afin de permettre la comparaison entre chaque type. La procédure 2 repose sur le transfert de microbiotes depuis des mères allaitantes vers des souriceaux adoptés, l’individu statistique indépendant correspond donc à la portée. Ainsi, 20 souris saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 18 mères allaitantes à chacune desquelles seront confiés des portées issues de 18 femelles de fond génétique approprié. Ce nombre sera réduit de 10 dans le cas où les souris de fond génétique approprié constitueraient l’un des 2 types de souris sélectionnés à l'issue de la procédure 1. Les 108 (54 mâles + 54 femelles) souriceaux conservés à la mise-bas permettront d’inclure 2 stades de développement dans notre étude pour établir la durabilité des modifications du microbiote tout en limitant les biais éventuels (effets « portée » et « cage ») et en évitant l’isolement des animaux. La procédure 3 est basée sur l’administration à des souriceaux de suspensions bactériennes destinées à modifier durablement l’assemblage néonatal de leur microbiote intestinal.. Du fait de la période d’intervention, l’individu statistique indépendant correspond à la portée. Ainsi, 20 souris de fond génétique approprié, saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 18 mères allaitantes dont les portées auront été ajustées à 6 souriceaux. Les 108 souriceaux seront utilisés de la même façon que lors de la procédure 2. Avant leur mise à mort, les animaux devenus inutiles seront proposés pour d’éventuels projets ancillaires et un appel à mutualisation sera effectué en amont des dissections post-mortem, afin de valoriser les organes non utilisés dans ce projet.
Raffinement
Le stress généré par chacune des procédures sera limité du fait de leur mise en œuvre par un personnel compétent et entraîné, dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. En outre, l’enrichissement des cages à l’aide de frisottis pour le nid et de tunnels et le co-hébergement pendant les périodes hors reproduction contribueront à minimiser le stress des mères et des souriceaux. Pour faciliter les adoptions programmées dans le cadre de la procédure 2, les souriceaux seront délicatement frottés avec la litière souillée des mères adoptives lors de la constitution des portées. Pour atténuer le stress lié aux « biberonnages », les portées seront maintenues sur tapis chauffants pendant leur réalisation. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris le week-end. L’évaluation de l’état des animaux sera alors effectuée en référence à une liste d’indicateurs adaptés à chaque stade de développement. Elle conditionnera les éventuelles décisions d’actions palliatives ou suppressives (administration d’analgésique, arrêt des supplémentations, voire décision d’euthanasie).
Choix des espèces
Le choix de la souris trouve son origine à la fois dans l’utilisation validée de ce modèle animal dans les études portant sur les pathologies hormonodépendantes (en particulier les cancers) et dans le fait que les disparités inter-souches quant à l’activité du microbiote intestinal aient été décrites pour cet animal. Ce modèle présente en outre l’intérêt d’héberger un microbiote intestinal qui s’établit au cours des premières semaines de vie. L’utilisation de souriceaux allaités dans 2 des 3 procédures permet donc de maximiser nos chances de moduler le microbiote intestinal qui s'assemble à cet âge. Enfin, nos travaux antérieurs ont permis aux personnels impliqués dans ce projet d’acquérir une bonne maitrise de ce modèle.
Influence du microbiote intestinal postnatal précoce dans les réponses inflammatoires associées à une douleur cornéenne en lien avec la sécheresse oculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux instillations par jour d'un conservateur de collyre abrasif pendant une semaine, un inducteur de colite dans l'eau de boisson, quatre semaines d'antibiotiques : 2 832 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. L'objectif est de relier un déséquilibre du microbiote intestinal en début de vie à l'apparition de douleurs oculaires chroniques. Les souris reproductrices, qui ne font l'objet d'aucun prélèvement, sont elles aussi tuées faute de pouvoir être réutilisées. Les pistes thérapeutiques annoncées pour les patients restent renvoyées au long terme.
Objectifs
Après la naissance, le système immunitaire apprend progressivement à faire la différence entre ce qui est inoffensif et ce qui peut etre dangereux pour l’organisme. Cet apprentissage dépend en grande partie du microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des bactéries qui vivent naturellement dans l’intestin. Un moment clé de cette maturation est le sevrage, lorsque l’alimentation du nourrisson se diversifie. A cette période, le système immunitaire s’active afin de s’adapter aux nouvelles bactéries présentes dans l’intestin. Cette étape est essentielle pour installer une tolérance immunitaire, qui permet d’éviter des réactions excessives ou dirigées contre les propres tissus du corps. Si le microbiote est perturbé à ce moment critique, par exemple après la prise d’antibiotiques ou en cas de déséquilibre des bactéries intestinales, cet apprentissage peut être altéré. Le système immunitaire devient alors plus susceptible de réagir de manière inappropriée, augmentant le risque de maladies inflammatoires ou auto-immunes plus tard dans la vie. Des travaux récents ont également mis en évidence un lien étroit entre l’intestin, le cerveau et l’œil, appelé axe intestin cerveau œil. Une perturbation précoce du microbiote peut interférer avec le développement normal de la cornée, la surface transparente de l’œil, ainsi que de ses nerfs. Cela peut rendre l’œil plus vulnérable à l’inflammation, qui, lorsqu’elle devient chronique, peut entraîner des douleurs oculaires ou une sécheresse oculaire. Ce projet vise à comprendre comment un microbiote déséquilibré en début de vie perturbe le système immunitaire et favorise l’apparition de douleurs oculaires. A terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements permettant de mieux prévenir et soulager ces troubles, et d’améliorer la qualité de vie des personnes concernées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire (les mécanismes de défense du corps) agit au niveau de la cornée, la surface transparente de l’œil. En identifiant précisément ces mécanismes, il permettra de mettre en évidence de nouvelles pistes pour développer des traitements plus efficaces. Le projet s’intéresse également au role du microbiote intestinal, l’ensemble des micro organismes vivant dans l’intestin, en particulier lorsqu’il est perturbé très tôt dans la vie. Ces perturbations précoces peuvent avoir des effets durables sur la santé, y compris en dehors de l’intestin. L’objectif est de comprendre comment elles influencent la santé de la surface de l’œil, favorisent l’inflammation et peuvent conduire à des douleurs cornéennes chroniques ou à une sécheresse oculaire. À plus long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes, visant à rétablir un bon équilibre des réponses immunitaires, à soulager durablement la douleur et la sécheresse oculaire, voire à prévenir leur apparition. En ciblant les interactions entre le système immunitaire et les nerfs impliqués dans la douleur, ce projet ambitionne d’améliorer significativement la qualité de vie des patients souffrant de douleurs oculaires chroniques ou de maladies inflammatoires associées.
Procédures
Perturbation du microbiote intestinal précoce : Le microbiote intestinal sera perturbé par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 4 semaines, associée à un régime alimentaire dépourvu de fibres. Modèle d’inflammation intestinale (colites) : Un agent inducteur de colite sera administré dans l’eau de boisson pendant 14 jours au total, selon deux cycles successifs de 7 jours. Les instillations nécessiteront une contention de quelques secondes chez l’animal vigile. Les tests comportementaux, réalisés chez des animaux vigiles, impliqueront également des contentions brèves : test d’anxiété (2 sessions de 10 minutes par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 sessions de 30 secondes) et test de sensibilité chimique cornéenne (1 session de 30 secondes). Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (4 sessions de 5 minutes), et une euthanasie règlementaire sera effectuée après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Modèle de douleur inflammatoire par instillation d’un conservateur de collyre : La douleur inflammatoire sera induite par des instillations d’un conservateur de collyre abrasif, réalisées deux fois par jour pendant 7 jours, suivies d’instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique (2 fois par jour espacées de 4 heures pendant 7 jours). Les instillations et tests comportementaux nécessiteront des contentions de quelques secondes chez l’animal vigile, selon les mêmes modalités que précédemment (tests d’anxiété et de sensibilité cornéenne). Les sessions d’imagerie (4 × 5 minutes) et l’euthanasie règlementaire seront effectuées après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Thérapie par instillations oculaires : Les traitements topiques (agent pharmacologique ou solvant) seront administrés par instillations oculaires deux fois par jour pendant 7 jours, espacées de 4 heures, une heure après l’instillation d’un conservateur de collyre abrasif chez l’animal vigile. Les modalités de contention, de tests comportementaux et d’anesthésie pour l’imagerie et l’euthanasie seront identiques à celles décrites ci-dessus.
Impact sur les animaux
Les antibiotiques et l’alimentation pauvre en fibres peuvent parfois provoquer une légère perte de poils sur le dos et un ralentissement modéré de la prise de poids. Les substances utilisées pour provoquer une inflammation peuvent entraîner une irritation de l’intestin ou de l’œil, une perte de poids et, plus rarement, la présence de sang dans les selles. Les animaux sont manipulés régulièrement pour l’administration de gouttes dans les yeux, ce qui peut générer un léger stress. Les injections d’anesthésiques ou d’antalgiques peuvent aussi provoquer une gêne brève au point d’injection. L’anesthésie générale comporte un faible risque (ralentissement cardiaque ou respiratoire, baisse de la température corporelle) et, très rarement, un décès. Des réactions locales au site d’injection (rougeur, douleur, petite infection) peuvent apparaître mais restent peu fréquentes. Les examens d’imagerie de l’œil nécessitent une anesthésie générale, ce qui représente un risque léger. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress passager (fatigue ou modification temporaire du comportement). Les traitements testés sont destinés à soulager l’inflammation oculaire. Leur administration est généralement indolore, mais une légère irritation transitoire peut parfois être observée. Les animaux sont surveillés attentivement afin de détecter et limiter tout inconfort.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires, impliquant l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à l’issue de chaque procédure expérimentale. Tous les animaux inclus dans le champ du projet et soumis aux procédures expérimentales feront l’objet de prélèvements post-mortem et seront euthanasiés. Les femelles reproductrices ne font pas l’objet de prélèvements mais, ne pouvant être réutilisées, sont néanmoins euthanasiées conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire, le microbiote et l’activation des voies nociceptives cornéennes. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire, le système nerveux et le microbiote intestinal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur.
Réduction
Afin de limiter au maximum le recours aux animaux, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été strictement calculé et optimisé. Sur une durée totale de 5 ans, le projet impliquera au maximum 2 832 souris utilisées dans les procédures expérimentales. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’études précédentes et de calculs statistiques, afin d’utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ces calculs montrent qu’il faut au moins 10 animaux analysables par groupe expérimental. Dans nos expériences, les petits d’une même mère sont considérés comme appartenant à une même “portée”. Comme les frères et sœurs se ressemblent biologiquement, on tient compte de cette particularité dans le calcul du nombre total d’animaux. Le total inclut donc aussi les femelles reproductrices nécessaires pour obtenir suffisamment de petits par groupe. En moyenne, une mère donne naissance à environ 5 souriceaux. Ainsi, pour disposer de 10 animaux réellement analysables dans un groupe, environ 12 animaux sont nécessaires au total. Cela explique pourquoi le nombre final d’animaux n’est pas toujours un multiple exact de 10. Afin de réduire encore le nombre total d’animaux utilisés, plusieurs tissus sont prélevés sur chaque animal après euthanasie (œil, nerfs, cerveau, intestin, organes immunitaires). Cette approche permet de réaliser plusieurs analyses complémentaires à partir d’un même animal, sans multiplier les expérimentations. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés, afin de garantir une interprétation fiable et objective. Ces analyses permettent de déterminer si les différences observées sont réelles ou dues au hasard, selon des critères reconnus par la communauté scientifique.
Raffinement
Les animaux importes observeront une periode d acclimatation de 5 jours minimum avant le debut des experimentations ainsi que des temps de repos etablis entre les differents actes experimentaux. Les animaux seront heberges dans des cages ventilees en stabulation standard avec enrichissement maison en carton avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous eviterons tant que possible l hebergement individuel des animaux. Les conditions d hebergement sont conformes a la reglementation en vigueur. Des points limites ont ete definis et les animaux seront examines quotidiennement par le personnel qualifie de l animalerie et ou les experimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera note dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l echelle decisionnelle definie par notre structure du bien etre animal SBEA pouvant mener a l administration d un traitement a decaler dans le temps les actes prevus ou a euthanasier l animal si cela est necessaire. Lors de la gestation et ce jusqu a la fin du sevrage les meres sont placees au nombre de 2 par cage et restent avec les nouveaux nes. La nourriture et l eau de boisson sont fournies ad libitum. La temperature de la zone d hebergement est maintenue a 22 plus ou moins 2 et suit un cycle d eclairage non inverse 12h jour 12h nuit hygrometrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent. Un systeme d etiquetage associe a des pastilles visuelles permettra d assurer un suivi rigoureux du bien etre des animaux. Pour eviter toute souffrance les procedures chirurgicales se feront sous anesthesie generale associee a un protocole analgesique en pre per et post operatoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l animal ne soit stabilise pour ces differentes constantes. Si un animal anesthesie presentait une detresse respiratoire ou cardiaque ou s il se trouve en hypothermie nous procederons a un arret immediat du protocole en cours et en l absence de retablissement selon le temps defini pour respecter le bien etre animal l euthanasie de l animal sera envisagee. Les tests de la lampe a fente et l imagerie confocale in vivo qui peuvent induire un leger stress et necessitent que l animal soit immobile seront realises sous anesthesie generale.
Choix des espèces
Pour comprendre comment le systeme immunitaire et les bacteries de l intestin (microbiote) interagissent, nous utilisons des souris commerciales non transgeniques. Ces souris sont bien adaptees pour ce type d etude car leur biologie et leur developpement sont proches de ceux de l homme, et les connaissances acquises sont utiles pour mieux comprendre la sante humaine. Elles sont egalement un modele reconnu pour l etude de la douleur oculaire, car leurs yeux et leur cerveau sont similaires a ceux de l homme. Nous utiliserons des souris a differentes etapes de la vie, de la naissance a l age adulte, pour etudier comment les changements du microbiote precoce peuvent influencer les reactions du systeme immunitaire plus tard. Chaque experience durera 14 a 16 semaines maximum, et aucun animal ne depassera l age de 16 semaines. Les stades choisis sont bases sur les connaissances scientifiques, afin de suivre le developpement des animaux sur la duree et comprendre les effets des perturbations du microbiote sur la sante des yeux et du systeme immunitaire a l age adulte.
Etude du r?le de m?tabolites de la flore microbienne intestinale dans le traitement de l’ob?sit? du diab?te et de l’asthme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.
Procédures
Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.
Devenir
Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.
Remplacement
Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.
Réduction
Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.
Raffinement
Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.
Choix des espèces
Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.
Evaluer l’impact d’une modulation alimentaire en vitamine D sur le microbiote intestinal et la santé métabolique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des points limites gradés déclenchent l'arrêt de la procédure, mais 72 souris vont d'abord être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant douze semaines de régime, elles subissent des gavages, deux prises de sang à la queue, une injection intrapéritonéale, des jeûnes et des isolements répétés. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour étudier l'effet de la vitamine D sur le microbiote. Le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue pour ce protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant de mieux comprendre l’impact de la vitamine D sur la santé, et les conséquences d’une carence en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote. Afin de prendre en compte de possibles effets liés au sexe, des souris mâles et femelles seront nourris pendant 12 semaines avec un régime contrôle, déficient ou non en vitamine D, ou un régime riche en lipides et en sucres, déficient ou non en vitamine D. Les souris carencées seront étudiées et comparées aux souris non carencées pour le suivi de l'evolution pondérale, la prise alimentaire, et l’impact sur le microbiote. Au total, l'etude portera donc sur 8 groupes d'animaux. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9ème semaine et un test de tolérance au glucose à la 10ème semaine. Les fèces seront également récoltées et le microbiote des animaux sera analysé. Les animaux seront mis à mort après les 12 semaines de régime afin d'étudier l’inflammation, l’expression et l’activation de la voie de signalisation de l’insuline dans des organes à forte activité métabolique (foie, muscles, tissus adipeux), l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux, et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact de l’interaction entre la vitamine D et le microbiote intestinal sur la santé métabolique ainsi que sur la composition du microbiote. Ce travail est essentiel pour mieux comprendre le rôle du statut en vitamine D dans la réponse à l’alimentation, notamment dans le contexte d’un régime riche en lipides. Il permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives, en particulier en ce qui concerne les recommandations relatives à la supplémentation en vitamine D chez l’Homme.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé la 6ème semaine. Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test oral de tolérance au glucose et un test de tolérance à l'insuline seront pratiqués respectivement en 9ème et 10ème semaine. Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérance au glucose, et une injection lors du test de tolérance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur valeur de glucose dans le sang. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de tolérance au glucose et à l'insuline et du recueil de fèces. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose, ou une dose de colorant visant à etudier la perméabilité intestinale, et lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles. Lors des tests, les animaux seront soumis à des restrictions alimentaires afin de réaliser les tests sur animaux à jeun (4h ou 6h). De même, la vielle au soir de l'euthanasie, les animaux seront mis à jeun. Les souris subiront deux gavages durant le protocole, deux prises de sang à la veine caudale et une injection intrapéritonéale, qui pourraient engendrer des douleurs temporaires et reversibles. Contention des animaux à plusieurs reprises lors des tests.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques, séquencage) et de démontrer les effets métaboliques de la modulation en vitamine D dans l’alimentation, à la fois sur le microbiote et sur la santé métabolique.
Remplacement
L’impact d’une modulation en vitamine D sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de Student, notamment en ce qui concerne la prise de poids.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton ainsi que du coton de nidification. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 9 semaines à l’achat et d’environ 10 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à des animaux adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Evaluation de l’implantation de différentes souches bactériennes au sein du microbiote intestinal murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Réutilisées ensuite dans d'autres procédures légères ou sans réveil, 40 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul quatre semaines, reçoit un gavage de bactéries porteuses de gènes de résistance aux antibiotiques et, pour la moitié, deux injections sous la peau. Le projet compare des souches bactériennes fluorescentes pour choisir la plus détectable, étape préalable à une future étude sur le stress. Le porteur qualifie la procédure de sans dommages, alors qu'il la classe lui-même en gravité modérée.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Elle est à la fois liée à une mauvaise utilisation des antibiotiques mais également à la capacité d’autres facteurs à stimuler les transferts de gènes de résistance entre bactéries, notamment au sein du microbiote intestinal. Notre thématique de recherche vise à évaluer comment un stress chronique pourrait augmenter la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du microbiote intestinal. Pour cela, nous utilisons un modèle de stress chez des souris à qui nous avons administré des bactéries non pathogènes portant des gènes de résistance aux antibiotiques. Afin d’étudier l’effet du stress sur les transferts génétiques, nous devons utiliser une souche de bactérie qui soit d’une part capable de s’implanter de façon durable dans le microbiote de la souris et d’autre part qui soit facilement détectable et quantifiable par des techniques basées sur des marqueurs fluorescents. L’objectif de ce projet est de comparer deux espèces bactériennes différentes et possédant des marquages fluorescents différents pour le suivi de leur capacité à persister dans le microbiote intestinal de la souris. Nous comparerons ainsi les performances de leur détection selon les molécules fluorescentes utilisées. Ce projet est une étape préliminaire indispensable pour choisir la meilleure souche de bactérie qui permettra de caractériser l’impact du stress chronique sur la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal
Bénéfices attendus
Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la colonisation des différentes souches donneuses. Parmi les quatre souches testées, celle qui présentera la meilleure persistance ainsi que la meilleure détection en termes de signal fluorescent sur l’ensemble des 21 jours de protocole sera sélectionnée.
Procédures
L'ensemble des animaux subira un gavage (durée du geste = 30 secondes) de bactéries, et certains d'entre eux (n=20) auront en plus deux injections sous la peau (durée du geste = 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les souris seront hébergées individuellement pendant une durée de 4 semaines. Elles subiront un gavage de bactéries, et certaines d'entre elles auront en plus deux injections sous la peau.
Devenir
Les animaux dans ce projet sont utilisés dans une procédure modérée n'entrainant pas de dommages. Ils seront ré-utilisés en fin de procédure uniquement sur des procédures légères (telles que des travaux pratiques) ou des procédures sans réveil.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier les processus de colonisation dans un milieu complexe tel que l’intestin. En effet la colonisation est liée aux caractéristiques de l’hôte et de la bactérie donneuse de gènes de résistance aux antibiotiques. Les caractéristiques intestinales de l’hôte sont complexes et ne peuvent être à ce jour reproduites sur des modèles alternatifs in vitro ou informatiques. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte.
Réduction
L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets tout en garantissant une fiabilité forte des résultats.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au sein du microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles de 8 semaines. De plus ces souris sont majoritairement utilisées et caractérisées dans les études liées au microbiote. En particulier, la dose de bactéries donneuse à administrer a été précédemment déterminée dans des souris.