Les projets approuvés

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une restriction alimentaire de trois à six semaines, la pose de canules cérébrales ou d'une pompe osmotique sous la peau lors d'une chirurgie de 45 minutes à une heure, huit injections directement dans le cerveau et des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'anorexie mentale persiste chez les patientes, en affamant des souris jusqu'à reproduire leur état de dénutrition. Un amendement ajoute des souris supplémentaires pour "confirmer et valider" des résultats déjà obtenus, et le porteur écrit que des explorations comportementales complexes sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.

Objectifs

L’anorexie mentale est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et à une détérioration de la santé physique et mentale. Elle a le taux de mortalité le plus élevé de tous les troubles psychiatriques et il n’existe, à ce jour, aucun traitement pharmacologique efficace. D’autre part, les taux de rechute sont importants (>40%) et la pathologieévolue souvent de façon chronique. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’anorexie mentale et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené dans un modèle murin qui mime l’état de dénutrition des patientes, est de déterminer le rôle de facteurs sanguins qui sont dérégulés au cours de la dénutrition chronique, dans la persistance et l’aggravation des symptômes de l’anorexie et qui pourraient expliquer la chronicité de cette pathologie. AMENDEMENT 1: Ajout de souris supplémentaires pour confirmer et valider nos résultats et modification d'une étape du projet pour inclure l'implantation d'une mini-pompe sous la peau qui permet l'administration en continue des molécules mimant les facteurs sanguins dérégulés dans la pathologie humaine et ainsi éviter des administrations répétées.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle murin innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale.

Procédures

Pose de canules cérébrales et/ou pompe osmotique sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques croisées souscutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Injections pharmacologiques croisées intra-cérébrales: 8 injections, durée 5 minutes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de restriction alimentaire entraine une perte de poids et une baisse de la glycémie. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent provoquer une irritation locale et un stress. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure. L’utilisation d’un protocole de pharmacologie qui permet de tester l'effet de différents traitements chez le même animal permet de réduire de façon importante le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement par un personnel compétent pour vérifier leur état physique et comportemental et leur poids est mesuré au moins 3 fois par semaine au cours de la restriction alimentaire. Pour réduire le stress lié à l’isolement ponctuel pour la mesure individuelle du comportement alimentaire, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie est effectuée sous analgésie et anesthésie générale. D’autre part, des grilles de points limites gradés et un arbre décisionnel adaptés à chaque procédure sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit l’arrêt de l’expérience.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements motivés permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études comparatives entre les observations faites chez la souris et certains aspects de la pathologie humaine. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont initiées aux stades équivalents chez la souris.

Jusqu'à six chirurgies d'implants de huit heures chacune et jusqu'à neuf ouvertures de volets osseux dans le crâne: 8 macaques, quatre à longue queue et quatre rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils travaillent en chaise de contention cinq à sept fois par semaine, lors de séances allant jusqu'à cinq heures, un contrôle de l'eau servant de levier de motivation puisque la récompense hydrique constitue une partie de leur apport journalier. Le porteur veut comprendre comment le cerveau des macaques perçoit les visages, le statut de dominance et les liens sociaux entre congénères. Sept des huit macaques resteront en utilisation continue, un sera tué pour l'étude post-mortem de son cerveau.

Objectifs

Le cerveau des primates, des humains comme des singes, leur permet de vivre en société, ce qui participe à la survie de leur espèce. Notre cerveau de primate est notamment adapté pour la perception des individus et pour l’analyse de leurs comportements. Or la cognition sociale est la première à être touchée dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et nous ne connaissons pas exactement l’origine de ces problèmes, notamment du fait de notre connaissance insuffisante des mécanismes cérébraux qui nous permettent de percevoir et de comprendre les autres. L’objectif de ce projet est de comprendre par quels mécanismes le cerveau des primates non-humains leur permet de percevoir et comprendre leur groupe social. Nous savons par exemple, que les singes, tout comme les humains, possèdent dans leur cerveau des régions spécialisées pour la perception des visages par rapport à d’autres objets visuels. Cependant nous ne savons pas 1/ par quels mécanismes biologiques, les neurones –c’est-à-dire les cellules de ces régions cérébrales– codent les caractéristiques sociales des individus (comme leur genre, leur statut de dominance, leurs liens d’amitié) 2/ comment les neurones associent une même caractéristique sociale perçue par différentes modalités sensorielles 3/ s’il existe des régions cérébrales spécifiques aux odeurs sociales et au toucher social, deux modalités très importantes depuis le plus jeune âge pour percevoir les autres. Par ailleurs, les primates sont des spécialistes pour l’analyse des comportements de leurs congénères et possèdent des régions cérébrales spécifiques pour l’analyse des interactions sociales. Cependant, nous ne savons pas par quels mécanismes les neurones extraient des informations sur les individus à partir d’observation d’actions. Dans ce projet, nous proposons de répondre à ces questions majeures pour les neurosciences, la psychologie sociale ou encore la biologie évolutive en utilisant des techniques d’étude du cerveau à plusieurs niveaux combinant des méthodes exploratoires d’imagerie du cerveau afin d’identifier les régions cérébrales responsables de ces processus sociaux, à des méthodes fines d’enregistrement de l’activité des neurones et de manipulations moléculaires, avec l'objectif à long terme de fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment ces mécanismes peuvent être perturbés dans les maladies psychiatriques ou neurologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront d’abord de mieux comprendre la représentation du réseau social, des interactions sociales et des individus dans le cerveau avec une précision et une compréhension au niveau des mécanismes neuronaux jamais atteintes jusque-là. Les perturbations temporaires des régions du cerveau identifiées par imagerie par résonance magnétique (IRM) pourraient permettre de s’approcher au plus près des tableaux cliniques humains et donc fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment les mécanismes sociaux sont perturbés dans les maladies psychiatriques et neurologiques. Ainsi ce projet pourrait permettre d’établir un modèle animal pour la compréhension des troubles sociaux qui impactent les patients présentant des troubles neurologiques ou psychiatriques. Il s’agira également potentiellement de découvrir de nouvelles régions cérébrales sur la perception des odeurs et du toucher social, et d’obtenir une comparaison du cerveau social des singes et du cerveau social humain et donc de comprendre les mécanismes conservés au cours de l’évolution et ceux qui sont spécifiques à notre espèce et à l’espèce des macaques rhésus.

Procédures

Tous les animaux sont habitués aux différents dispositifs et au personnel pour limiter tout stress. Ils seront entrainés à la réalisation de tâches comportementales (5-7 fois/semaine, 20min-4h/session). Le bon positionnement dans la chaise pourra s’accompagner d’un faible sédatif (sur environ 10séances si nécessaire). Les animaux réaliseront des IRM sous anesthésie (4h, 1-2sessions/mois avant 4ans puis 6fois/an). Ils auront 3 chirurgies d’implants minimum (mise en place d’un implant de maintien de la tête, de chambres d’enregistrement, d’électrodes d’enregistrement) et 6 maximum s’il est nécessaire de réparer, retirer ou remettre un implant (durée: 8h maximum/chirurgie sous anesthésie générale). Ils auront 2 interventions d’ouvertures de volets osseux ciblés minimum et 9 maximum s’il est nécessaire d’ajouter ou d’agrandir les volets existants (durée: 5h maximum/intervention sous anesthésie générale). Les chambres d’enregistrement sont entretenues 2 fois/semaine minimum (durée 60min). Les animaux vigiles participeront à des enregistrements de l’activité cérébrale par IRM et par électrophysiologie pendant qu’ils réaliseront des tâches comportementales (durée 5h maximum, 5-7 fois/semaine). Pour favoriser la motivation des animaux pendant les tâches comportementales, ils seront récompensés à l’aide d’une récompense hydrique qui constituera une partie de leur apport journalier en liquide. Un retour progressif à un apport à volonté est effectué au moins 2 fois une semaine chaque année. Une surveillance quotidienne est réalisée afin de garantir un bon état d’hydratation et une bonne santé, vérifiée par des analyses sanguines 2 fois/an (prise de sang de 4min). Chaque IRM s’accompagnera d’une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée 2min). Cet agent sera ensuite éliminé par deux composés (1 administration intramusculaire/jour de 30s, et 2 administrations orales/jour de 3min). Des analyses sanguines seront réalisées pour suivre le retour aux valeurs de référence (environ 4 prises de sang à la fin des séquences de plusieurs IRM, durée 4min). Des molécules seront administrées pour moduler l’activité cérébrale par inhalation (60 administrations maximum par animal de 20min), ou par la nourriture (60 administrations maximum/animal), ou par injection intraveineuse (60 administrations maximum/animal de 4min), ou dans le cerveau (60 administrations maximum/animal de 50min). Un des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

L’animal pourrait ressentir une gêne ou des douleurs après les différentes chirurgies (pose de l’implant de tête, des chambres d’enregistrements ou des électrodes à demeure). Il y a également la gêne liée à la présence de ce matériel à demeure. Les risques liés à l’anesthésie (notamment hypothermie, sécheresse oculaire, dépression cardio-respiratoire) peuvent survenir. Il existe des risques d'infection sur les implants de tête, sur les électrodes implantées et lors de l'introduction des électrodes amovibles pour les enregistrements. Les risques de perte d’implant peuvent survenir suite à un rejet du matériel biocompatible provoquant chez certains animaux une réponse inflammatoire chronique et un rejet du matériel chirurgical. L’animal pourrait ressentir un stress/contrainte lors des séances d'électrophysiologie, d’imagerie, de tests ou d’entrainement pendant lesquelles il est positionné en chaise de contention ou maintenu par l’implant de tête. Le stress de l’hébergement en captivité peut être présent. Le contrôle hydrique peut induire un stress pour l’animal, une sensation de soif, de la déshydratation ou une perte de poids. Les risques liés aux agents pharmacologiques existent, lies à la tolérance/réaction individuelle aux molécules utilisées ainsi qu’à la capacité de la récupération propre à chaque animal, pouvant induire par exemple une réaction allergique, une accumulation dans les tissus, un mauvais fonctionnement du foie ou des reins. L’animal pourrait ressentir une gêne ou une douleur de courte durée au point d’injection lors des injections et prélèvements en intraveineuses, ou en intramusculaire.

Devenir

7 des 8 animaux seront en utilisation continue pour poursuivre l’acquisition de données sur ce sujet de recherche afin de privilégier l’utilisation d’un animal déjà entrainé par rapport à un animal naïf (réduction du nombre d’animaux). Cette utilisation continue se fera en accord avec l’équipe vétérinaire et dépendra de l’état de bien-être des animaux. 1 animal sera euthanasié pour l’étude post-mortem de son cerveau.

Remplacement

Avec les technologies actuelles, le présent projet ne peut être abordée qu'avec l’utilisation d’animaux. Nous ne pouvons pas utiliser de lignées cellulaires ou tissus, car ils ne présentent pas de processus perceptifs ou cognitifs. Les modèles informatiques du cerveau, ne permettent pas de comprendre, sans données empiriques préalables, quels algorithmes sont effectivement utilisés dans le cerveau réel en action. D’autre part, les études non invasives chez des sujets humains en bonne santé ne permettent pas d’enregistrer des signaux avec une résolution temporelle et spatiale suffisante pour étudier les mécanismes neuronaux. Le travail chez les patients humains est également limité, car pour des raisons éthiques, les enregistrements électrophysiologiques quand ils ont lieux ne peuvent pas cibler des régions d’intérêt scientifique mais uniquement des régions d’intérêt clinique. Il est donc impossible d’acquérir une compréhension mécanistique de la cognition sociale chez l’humain, les cultures cellulaires ou les cultures de tissus. Contrairement à d’autres animaux (ex. rongeurs/oiseaux), les fonctions cérébrales et l’anatomie des systèmes sensoriels des primates non humains (PNH) sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Ces homologies concernent les systèmes neuraux et les stratégies cognitives et sociaux-cognitives des PNH, y compris certaines interactions sociales dont seuls les primates sont capables, ce qui n’est pas retrouvé dans d’autres modèles (ex. oiseaux/rongeurs). Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, ce modèle est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet grâce à cette proximité.

Réduction

Les normes de publication, notre expérience, et les analyses statistiques indiquent que les données doivent être obtenues chez 6-8 animaux pour les expériences comportementales, 4-6 animaux pour l'imagerie, 2-3 animaux pour l’électrophysiologie, les neuromodulations, afin d'obtenir des données robustes et interprétables. L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est sans doute la technique la plus efficace pour réduire le nombre d'animaux en fournissant des connaissances sur les régions cérébrales pertinentes à étudier ensuite par électrophysiologie. Sans cette connaissance, les enregistrements devraient être effectués dans tout le cerveau et pourraient nécessiter jusqu'à 10 fois plus d’animaux pour enregistrer dans toutes les régions possibles. De plus, l’utilisation d’agent de contraste lors des IRM fonctionnelles permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’acquisitions. Ainsi nous utiliserons 8 macaques dans notre projet, ces 8 animaux participeront aux tâches comportementales, puis seront répartis par groupe de 4 à l’IRMf et par groupe de 2 à l’électrophysiologie avec/sans perturbations de l'activité cérébrale. Ce point répond également à la nécessité d'obtenir plus d'informations à partir du même nombre d'animaux et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. Nous privilégierons de répéter nos enregistrements sur un même animal afin d’utiliser le plus faible nombre d’animaux possible. Nous utiliserons les tests statistiques adaptés pour analyser les données récoltées.

Raffinement

L’état de bien-être de l’animal est primordial et s’il y a une anomalie des mesures seront prises pour aider à le restaurer. Les animaux sont observés quotidiennement tout au long du projet et des points limites ont été établis pour assurer une prise de décision rapide et efficace pour s’assurer que le bien-être de l’animal est préservé. L’hébergement en groupe social, dans une animalerie aux paramètres surveillés quotidiennement (lumière, température, hygrométrie), ainsi que l’enrichissement et une alimentation adaptée sont mis en place pour stimuler les animaux et leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels. L’entraînement régulier par renforcement positif permettra d’instaurer une routine limitant les contentions et le stress lors des manipulations et des tâches demandées. Le contrôle hydrique sera adapté à la demande de chaque animal en ayant intégré les particularités individuelles. Les chirurgies et IRM anesthésiées sont réalisées sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après ; une réévaluation avec le vétérinaire est disponible si besoin). Lors des anesthésies, une surveillance des constances physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire, température…) est toujours mise en place et la température est maintenue. Le dispositif implanté sera le plus adapté possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie. Le post-opératoire sera surveillé avec une aide à l’alimentation pour faciliter la récupération, des enrichissements et une taille de la cage adaptée pour stimuler l’animal et faciliter les déplacements. La récupération complète est vérifiée avant la poursuite du projet.

Choix des espèces

Les singes Macaca mulatta, Macaca fascicularis (PNH) présentent des similitudes cognitives aux humains. Particulièrement, dans le domaine social : les macaques observent longuement leurs congénères ; sont socialement polyvalents ; leur environnement social, comme les sociétés humaines, comprend de nombreux paramètres qui nécessitent une extraction calculée des informations. Nous étudierons leurs connaissances des comportements sociaux complexes de leurs congénères, y compris d'un éventail d'interactions sociales dont seuls les primates sont capables. Leurs fonctions cérébrales et l’anatomie de leurs systèmes sensoriels sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, le modèle PNH est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet. Nous utiliserons des animaux adultes ou jeunes adultes (plus de 2ans), déjà sevré, car leur cerveau est à un stade mature nécessaire à nos recherches.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant par une chirurgie du cerveau de quarante-cinq minutes puis par une quarantaine de séances comportementales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection de vecteurs viraux dans le cerveau, elles enchaînent trente séances d'accès à une solution sucrée, six tests de motivation de quatre-vingt-sept minutes et trois séances où la boisson est rendue amère par la quinine. Les souris de huit cohortes sur douze reçoivent en plus une injection sous-cutanée dix minutes avant chacune de ces trente séances. Le porteur justifie le choix de la souris comme un "compromis phylogénétique", assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloignée d'espèces qu'il qualifie de "plus sensibles éthiquement", au premier rang desquelles les primates non-humains.

Objectifs

La surconsommation de sucre est à l’origine de nombreuses maladies chroniques et est un enjeu de santé publique. Des travaux ont montré que le sucre exerce ses effets récompensants non seulement par l'intermédiaire des voies gustatives, mais également via des voies post-ingestives (i.e., la signalisation inconsciente provenant de l'intestin et de la veine porte hépatique). Les voies gustatives et post-ingestives induisent la libération de dopamine via le circuit neuronal « noyau caudal du tractus solitaire /aire tegmentale ventrale /striatum ventral », tandis que la voie purement post-ingestive déclenche la libération de dopamine via le circuit « noyau caudal du tractus solitaire /noyau parabrachial dorsolatéral /Substantia nigra pars compacta /striatum dorsal ». Récemment, il a été proposé que la motivation inconsciente induite par les sucres, et détectée par la voie intestin-cerveau, constituerait la principale cause de surconsommation de sucre. Compte tenu des spécificités des différents circuits neuronaux, nous postulons qu'ils ont une contribution différentielle dans le développement de la surconsommation de sucre. Notre hypothèse principale est donc que les deux circuits neuronaux de la voie post-ingestive favorisent la motivation accrue pour le sucre et sa surconsommation compulsive. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle de cette voie post-ingestive dans le développement d’une consommation compulsive de sucre. Tout d’abord, nous évaluerons l’impact de la surconsommation de sucrose sur la motivation à consommer le sucre et sur le recrutement de ces circuits neuronaux chez des souris C57BL/6J de type sauvage. Nous testerons ensuite de manière causale les rôles respectifs de ces circuits dans le développement de l’addiction au sucre en combinant des approches d’activation ou d’inhibition sélective des circuits neuronaux et des approches comportementales chez des souris transgéniques. Nous évaluerons l'impact de l’activation et de l’inhibition de chaque circuit sur la consommation de sucre et la motivation. Nos recherches devraient fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de fournir des informations inédites sur le rôle de l’axe intestin-cerveau dans le développement d’une consommation compulsive de sucre et dans la motivation accrue pour consommer le sucre. Le second bénéfice sera de préciser les différents mécanismes neurobiologiques en jeu. Plus généralement, notre projet pourrait avoir des implications importantes pour les stratégies d'intervention en santé publique. En effet, si notre hypothèse est confirmée, les interventions ciblant la voie post-ingestive implicite devraient être plus efficaces que les interventions standards ciblant des choix conscients pour limiter la consommation de sucre.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie stéréotaxique (45 min en moyenne) pour l’injection intracérébrale de vecteurs viraux. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie gazeuse et sous analgésie. L’ensemble des souris seront soumises à différents tests comportementaux : accès différentiel à l’auto-administration orale de sucre (30 séances de 20 min ou de 3h), établissement d’une courbe concentration-réponse (2 séances de 20 min ou 3h), test de motivation (6 séances de 87 min) et test de dévaluation de la boisson sucrée par la quinine (3 séances de 20 min). Enfin, une injection sous-cutanée sera effectuée 10 min avant chacune des 30 séances d’accès différentiel à la solution sucrée et avant le test final de 80 min (Jour 85) pour 8 des 12 Cohortes de souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans différentes procédures successives dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi postopératoire…), des nuisances ou effets indésirables peuvent éventuellement survenir suite à la chirurgie stéréotaxique. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection, une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’ensemble des tests comportementaux qui suivent. Les souris des cohortes 5 à 12 seront soumis à des injections sous-cutanées de façon quotidienne pendant la phase d’accès différentiel et pendant le test final. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés postmortem pour effectuer des mesures d’expression protéiques cérébrales par analyse immunohistochimique.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation de la souris de laboratoire (Mus Musculus, jeunes adultes, mâles et femelles), sauvages ou transgéniques, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre activité de certains circuits neuronaux et surconsommation de sucre ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 3) la consommation compulsive de sucre malgré les conséquences négatives associées est un désordre comportemental complexe qui ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 10 souris par sous-groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique et que la puissance de nos tests soit satisfaisante. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 15 % en fin d’expérience, l’effectif initial par groupe devra donc être de 12 souris (12-(12x15/100) = 10 souris). Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les variables du projet sera égal à 768 souris (384 souris mâles et 384 souris femelles). Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques. Le seuil de significativité statistique sera fixé à p< 0.05.

Raffinement

Toutes les chirurgies stéréotaxiques (45 min-1h en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie gazeuse et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. Un anesthésique local sera infiltré sous la peau du crâne au niveau du site d’incision pour prévenir toute douleur locale additionnelle. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec ses congénères. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique . Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance. Avant le début des expériences, les souris connaissent une période d’acclimatation de 7 jours, durant laquelle elles sont délicatement manipulés de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention. Elles sont également habituées aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs, 2h/jour) afin de limiter le stress et l’anxiété.

Choix des espèces

Le choix de la souris de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes « d’addiction au sucre » par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains comportements alimentaires mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine « des addictions alimentaires ». De plus, la souris transgénique, est un modèle animal unique, nous permettant d’étudier le rôle spécifique de certains neurones dans la surconsommation de sucre, ce qui est irréalisable avec les autres modèles animaux. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (plus vieux que 6 semaines). Ce stade du développement correspond à une maturation complète du cerveau et à une stabilisation de la fonction des systèmes neurobiologiques d'intérêt.

Leur accès à l'eau est contrôlé pour qu'ils restent motivés par les tâches à accomplir. Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué : trois seront replacés et trois réutilisés dans d'autres projets. Chacun subit deux interventions chirurgicales de quatre à cinq heures, onze examens d'imagerie cérébrale sous anesthésie générale dont six avec injection directe dans le cerveau, et des séances comportementales quotidiennes d'une heure trente à deux heures pendant quatre à cinq mois. Le projet vise à cartographier les circuits sous-corticaux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, le porteur retenant le macaque comme l'espèce "la plus près de l'être humain".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Six macaques à longue queue subissent chacun deux opérations du crâne de quatre à cinq heures, onze séances d'imagerie sous anesthésie générale et vingt injections directes dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tests comportementaux occupent une heure trente à deux heures par jour pendant quatre à cinq mois, l'accès à la boisson étant contrôlé pour maintenir la motivation des animaux. L'objectif déclaré consiste à cartographier les circuits cérébraux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, puis à mesurer sur ces circuits l'effet d'antidépresseurs et d'anxiolytiques. Trois macaques doivent partir en centre de retraite à l'issue du protocole, les trois autres étant réutilisés dans d'autres procédures, ce que le porteur présente comme une recherche orientée vers les "4R".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Une souris qui perd 15 % de son poids, titube ou cesse de se toiletter deux jours d'affilée est retirée de l'étude et tuée par dislocation cervicale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes pour l'injection de vecteurs viraux dans deux populations de neurones, puis vit seule en cage pendant dix semaines et demie, avec six injections dans l'abdomen et deux semaines de mesure continue de sa prise alimentaire et de sa course. Le porteur compense cet isolement par sept carrés de cellulose et un morceau de bois, et renvoie les retombées à la compréhension de l'obésité et de l'anorexie chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment les réseaux neuronaux participent à la balance énergétique et la motivation pour l'exercice. Pour cela, des souris transgéniques permettant de manipuler de façon concomitantes les deux sous-populations neuronales principales impliquées dans la motivation recevront des injections de vecteurs viraux permettant de manipuler spécifiquement l'activité de ces deux populations. Différents tests comportementaux permettront d'étudier la prise alimentaire exacte, la dépense énergétique et la motivation pour courir de chaque souris afin de mieux disséquer les mécanismes biologiques impliqués dans cette balance énergétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'identifier les mécanismes sous-jacents aux régulation métaboliques et de l'activité physique, dimensions altérées en particulier dans les troubles du comportement alimentaire tels que l'obésité ou l'anorexie.

Procédures

- Procédure chirurgicale (environ 90 minutes x 1 fois/ animal) - Isolement (environ 10.5 semaines) - Injections intrapéritonéales (1 injection/ jour x 6 fois, environ 3 secondes par injection)-Tests comportementaux: étude de la prise alimentaire et de l'activité locomotrice (2 semaines au total, 24h/24) et étude de la motivation pour l'activité physique (2 semaines au total, 1h/jour)

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d'interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. La chirurgie stéréotaxique pour l'injection bilatérale de virus peut entrainer des risques de douleurs post opératoires ou d'infections. Ces douleurs devraient s'estomper dans les jours suivant la chirurgie grâce au traitement analgésique mis en place. Enfin, les injections intrapéritonéales durant la période dans les cages métaboliques ou durant les tests de ratio progressifs peuvent également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce n d’animaux/groupe a été fixé (i) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications du domaine (iii) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats et en prenant en compte que certains animaux pourraient ne pas apprendre la tache comportementale opérante (pourcentage de succès de 50-60%). Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Comme prévue par la Directive 2010/63/CE, un enrichissement du milieu (7 carrés de cellulose) ainsi qu’un morceau de bois à ronger seront utilisés pour réduire les stress des animaux lié à l'isolement que ce soit dans les cages métaboliques ou dans les cages d'hébergement des souris. Les souris seront manipulées grâce à un tunnel en carton (présent dans leur cage d'hébergement) afin de les déplacer dans les cages métabolique ou dans les chambres opérantes. En ce qui concerne la période pré et post-opératoire, les animaux recevront un traitement analgésique et suite à la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine (médication, poids corporel, aspect général). La récupération des animaux est normalement totale après 1 semaine. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris et permet la reproductibilité et la comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et avec la communauté scientifique plus large. Des modèles animaux moins évolués (par exemple: ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour l'étude d'une récompense naturelle comme l'activité physique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l'immaturité du système nerveux au cours de l'adolescence.

Toutes tuées à la fin des expériences comportementales pour des analyses histologiques de leurs tissus, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est isolée en cage individuelle dès huit semaines, pour six à sept semaines dans le cas de 1 224 d'entre elles, et 1 176 subissent trois jours de restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids. 576 souris reçoivent en plus une chirurgie d'injection intracérébrale d'environ quatre-vingt-dix minutes. Le porteur reconnaît que l'absence d'interaction sociale peut être une source de stress, tout en présentant l'isolement comme la condition pour mesurer la prise alimentaire individuelle et pour éviter les bagarres "fréquentes chez les souris mutantes", et conclut que ses études comportementales ne sont pas aversives.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’apporter de nouvelles données concernant les mécanismes qui régulent la balance énergétique ainsi que les processus motivationnels pour des récompenses naturelles. Ce projet permettra de disséquer les circuits impliqués dans la motivation pour l'exercice physique et d’étudier des cibles potentielles dans le traitement des troubles alimentaires (obésité, anorexie).

Bénéfices attendus

Ce projet vise une meilleure compréhension de la régulation de la balance énergétique d’un point de vue motivationnel et des circuits jouant un rôle dans ce mécanisme. L’utilisation de notre modèle comportemental permettra d’approfondir les connaissances au sujet de la neurobiologie des troubles alimentaires (anorexie, obésité). A long terme, ces données pourront être utilisées pour investiguer les cibles potentielles dans le traitement de ces troubles alimentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : (1)Hébergement individuel : cette condition concernera tous les animaux (1368). La durée de l’isolement sera de 6 à 7 semaines pour 1224 animaux et de 1,5 semaines pour 144 animaux. (2)Chirurgie pour injection intracérébrale : cette intervention concernera les animaux des procédures 1 et 3 : 576 animaux. La durée de ces chirurgies sera d’environ 90 min. (3)Injection sous cutanée : Les animaux ayant reçu des chirurgies pour injection intracérébrale (576 animaux) recevront 2 injections sous cutanée (analgésique et anesthésique local au niveau du crâne). Dans la procédure 4, 144 animaux recevront 1 injection (injection de micropuces permettant d’identifier les différents animaux). (4)Injection intra-péritonéale : ce geste concernera tous les animaux ayant reçu une chirurgie, soit 576 animaux. Les animaux recevront 4 injections d’analgésique (1 durant la chirurgie et 3 en post-opératoire). 192 animaux parmi ces animaux recevront aussi 2 injections durant l’étude comportementale. (5)Test comportemental : tous les animaux de cette étude seront concernés, soit 1368 animaux. Cette étude va durer 2 semaines pour les 192 animaux de la procédure 1 et 3,5 semaines pour les 1176 animaux des autres procédures. (6)Restriction alimentaire : Cette restriction sera de 3 jours et correspond au maintien à 90% de leur poids initial. Elle concernera les animaux des procédures 2, 3 et 4, soit 1176 animaux.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d’interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. Les injections avant les tests comportementaux peut également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. La restriction alimentaire, permettant de faciliter l’apprentissage des animaux, pourrait entrainer une perte de poids supérieure à 15%. Dans ce cas, la restriction serait immédiatement arrêtée. Cependant, cette restriction ne devrait théoriquement pas entrainer cet effet indésirable parce qu’elle sera limitée à 3 jours. L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Les animaux de toutes les procédures seront mis à mort à la fin des expériences comportementales et des tissus seront récupérés pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique ou la prise alimentaire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce nombre d’animaux/groupe a été fixé (1) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (2) en se référant à des publications du domaine (3) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Pour le raffinement, plusieurs précautions seront prises en compte. Les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour contrôler la consommation de nourriture et pour éviter les bagarres, fréquentes chez les souris mutantes. Les cages d’hébergement des souris seront enrichies en matériel de nidification (7 carrés de cellulose), ainsi que d’un morceau de bois à ronger et d’un tunnel en carton (comme prévu par la directive 2010/63/CE). Durant les études comportementales, les animaux seront manipulés grâce au tunnel en carton présent dans leur cage d’hébergement afin d’éviter la préhension par la queue. Les animaux, vivant dans les chambres opérantes, auront du nid provenant de leur cage d’hébergement, ainsi qu’un abri/jouet. Les chirurgies intracérébrales seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux recevront un traitement analgésique. Suite à la chirurgie, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine. Des points limites ont été définis par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions pas soulager. Nos études comportementales ne sont pas aversives, nous ne devrons donc en théorie jamais atteindre ce point limite.

Choix des espèces

1) Ce projet nécessite l’utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement chez les modèles de souris. 2) Reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Des modèles animaux moins évolués (par exemple, ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour nos observations comportementales (course et prise alimentaires). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau d'oreille, cinq jours de gavage quotidien, une restriction alimentaire, puis un test comportemental de trente minutes par jour pendant onze semaines consécutives. L'enjeu déclaré est de savoir si des souris porteuses d'une mutation du gène FUS présentent des troubles de la motivation et de l'impulsivité, et si remettre la protéine dans le noyau des neurones les atténue. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal reproduisant la complexité comportementale et structurelle du système nerveux central humain.

Objectifs

La démence fronto-temporale (DFT) est une maladie maladie neurodégénérative incurable caractérisée par l’atteinte de deux structures majeures dans le cerveau. Les symptômes des patients atteints de DFT sont multiples et peuvent inclure des troubles liés au jeu d’argent, à l'hyperphagie et à la consommation de drogue. Tous ces comportements peuvent résulter d'une altération de la motivation et/ou de l'impulsivité. Ce type d’altérations est peu étudiée. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Ce projet a deux buts. Le premier est de regarder si ces souris présentent des problèmes de motivation et/d’impulsivité. Le second but est de voir si le fait de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones est suffisant pour atténuer ces problèmes comportementaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les troubles des comportements compulsifs dans la DFT sont très peu étudiés alors qu’ils peuvent être à l’origine de souffrances physiques (alcoolisation, hyperphagie) et/ou mentale importantes. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre ces comportements. Par ailleurs, si le fait de remettre la protéine mutée à sa place s’avère efficace, cela pourrait orienter les prochaines recherches pharmacologiques ou pharmaceutiques vers une stratégie visant à relocaliser cette protéine à sa place normale chez les patients souffrant de maladie qui affectent le cerveau.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 5 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons une tâche d’apprentissage qui nécessite que les souris soient motivées pour la réaliser. Pour atteindre ce niveau de motivation, la seule chose connue à ce jour est la mise en place d’une légère restriction alimentaire (qui vise à réduire le poids cible de l’animal est à 5%). Les souris passeront un test (non invasif) tous les jours pendant 11 semaines consécutive à raison de 30 minutes par jour.

Impact sur les animaux

6 types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- L’administration par gavage du traitement peut entrainer un stress lié à la contention transitoire et à l’administration du traitement ainsi que des fausses routes. 2- Le traitement en tant que tel pourrait avoir des effets secondaires mais de nombreuses études utilisent ce composé et aucune n’a fait remonter un effet secondaire notoire et délétère. 3- Le stress que pourrait causer la réalisation de la tache comportementale. 4- La restriction alimentaire nécessaire pour la réalisation de la tâche 5- Afin d’identifier les souris et de réaliser le génotypage, nous devons effectuer un tatouage (aux niveaux des doigts) et un prélèvement d’un morceau d’oreille (trou d’environ 1 mm de diamètre). Ceci entraine une douleur aiguë et transitoire.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier que notre protéine d’intérêt (FUS) soit à nouveau à sa place (dans le noyau des neurones) mais aussi pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier si la DFT est associée à des troubles motivationnels et compulsifs et si l’on peut modifier l’apparition de ces troubles en annulant une mutation. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux central, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé une des procédures. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote qui sera un point de décision entre la suite de la réalisation, un non, du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (âgées de 2/3 mois au début des procédures) car les patients souffrant de DFT liée à FUS sont toujours des patients adultes.