Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées : 257 projets autorisés en mars 2026 (01/04/2026)
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
MODIFICATION Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur un modèle de carcinogenèse prostatique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Objectifs
Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).
Procédures
Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.
Remplacement
La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.
Réduction
Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.
Raffinement
Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.
Choix des espèces
Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).
Traitement des cancers hépatobiliaires par le plasma froid atmosphérique dans des modèles murins immunocompétents et immunodéficients 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Objectifs
Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.
Procédures
- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.
Choix des espèces
Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.
Traitement des cancers hépatobiliaires par le plasma froid atmosphérique dans des modèles murins immunocompétents et immunodéficients 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Objectifs
Les cholangiocarcinomes (CCA) sont un type de cancer rare qui atteint le foie et les voies biliaires. A ce jour, seule l’ablation chirurgicale apparaît comme une thérapie efficace mais elle n’est envisageable que dans 20 pourcents des cas, avec sur 5 ans un taux de survie estimé entre 15-40 pourcents. La majorité des patients ne pouvant bénéficier d’intervention chirurgicale reçoit alors une chimiothérapie. En cas de progression tumorale consécutive à cette première ligne de traitement, il n’existe à ce jour pas de thérapie complémentaire approuvée. Par conséquent, l’émergence de nouvelles approches thérapeutiques est plus qu’attendue. Les plasmas froids atmosphériques (PFA) sont des gaz faiblement ionisés, constitués d’électrons, d’espèces radicalaires et excitées et possédant des propriétés de champ électrique et de rayonnement. Les PFA constituent une stratégie physique innovante et prometteuse pour le traitement des carcinomes puisque leurs capacités à réduire la croissance tumorale a récemment été démontrée dans des études in vitro et in vivo. Cependant, le développement et l’efficacité d’une stratégie PFA sur les cholangiocarcinomes (CCA) n’ont pas encore été testés. La finalité du projet est donc d’évaluer l’efficacité de la thérapie PFA comme alternative à l’ablation chirurgicale ou comme approche complémentaire à des traitements conventionnels. L’utilisation PFA permet raisonnablement d’espérer une régression significative de la taille des tumeurs, voire même une régression importante en combinant cette approche innovante à l’approche conventionnelle de la chimiothérapie. Par ailleurs, on peut s’attendre à un « effet sélectif » du plasma, c’est-à-dire qu’appliqué sur une zone présentant des cellules tumorales et saines, le plasma pourrait favoriser la mort des cellules cancéreuses sans endommager les cellules saines. Les objectifs sont de tester l’efficacité antitumorale du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules tumorales, les cellules du microenvironnement tumorale et sur les composants de la matrice extracellulaire (MEC), dans des modèles précliniques de CCA ectopique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire. Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les tumeurs des voies biliaires ou cholangiocarcinome (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressives. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche sur traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposée seule ou en combinaisons avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans des modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral du plasma froid atmosphérique dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux applicable en santé humaine dans le cadre des cancers des voies biliaires. Au-delà du cancer des voies biliaires, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour d’autres cancers ou d’autres applications comme la cicatrisation des plaies et l'ingénierie tissulaire.
Procédures
- Procédure 1 (EU1). 1. Injection sous cutanées des cellules (n=8640) sur souris vigiles, durée 10 secondes/animal - Procédure 2 (EU1). 1 chirurgie pour injecter dans le foie des cellules sur souris anesthésiées et sous analgésie (n=2160), durée 15-20 minutes/souris - Traitement au plasma froid atmosphérique (EU1/EU2) sur souris anesthésiées (n=1080 procédure 1 et n=540 procédure 2) 10 minutes/souris, répété 6 à 7 fois max. - Imagerie (EU2). Anesthésie + imagerie (4-5 fois sur même souris) (n=6480), durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins (EU1/EU2) sur animal vigile (2-3 par souris) (n=6480), durée 10 min/souris - Prélèvement terminal (EU1/EU2). A l’issue des traitements, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis soumis à un prélèvement sanguin et tissulaire pour effectuer les analyses et ne durera pas plus de 10 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
-le développement des tumeurs : -le modèle ectopique implique une injection des cellules sous cutanée dans le flanc/dos de l’animal ce qui peut engendrer un stress à l’animal en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille, et un inconfort au fur et à mesure du développement tumoral. -Le modèle orthotopique (injection dans le foie) implique une chirurgie abdominale pour injecter dans un lobe du foie les cellules tumorales, ce qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie). - Le traitement par plasma froid. L’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrêmes (peu probable). - Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen ou dans la veine de la queue ou par gavage, les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal ou de la queue, une inflammation de l’abdomen, queue ou gorges). Les contraintes liées au gavage sont la contention qui constitue un facteur de stress. - Les traitements seront effectués sous anesthésie (sauf pour le gavage) et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires afin de prélever le sang et les tissus pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancéreuses. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans le développement du cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 10800 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique G*Power a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude qui est de 15 par groupe. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyses à effectuer (les différents types de tests donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Lorsque ces conditions ne seront pas vérifiées, des tests non paramétriques seront effectués. En parallèle des animaux, nous développons des modèles in vitro en 3 dimensions afin de tester nos thérapies, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique, notamment la buprénorphine, sera utilisé en pré-opréatoire 20 minutes avant et post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.
Choix des espèces
Les cellules en culture ne permettent pas de tester des nouveaux traitements anti-cancéreux dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer un cancer avec des caractéristiques de la maladie proche de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de cancers biliaires (ectopique ou orthotopique) existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : 5 à 8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1 semaine d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des problèmes de prise de greffes dans le cas des xénogreffes ectopiques et modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge dans le cas des greffes syngéniques orthotopiques qui pourraient interférer avec nos résultats.
Traitement de la fibrose hépatique par le plasma froid atmosphérique dans différents modèles murins de maladies fibrosantes
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Objectifs
La fibrose hépatique est un processus de cicatrisation anormal du foie, où le tissu sain est remplacé par une matrice extracellulaire rigide et dysfonctionnelle. Cela survient après une lésion chronique du foie, entraînant la transformation des fibroblastes en myofibroblastes qui sont les principales cellules à l’origine de la fibrose. La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Le plasma froid atmosphérique (PFA), également connu sous le nom de gaz faiblement ionisé, représente une stratégie thérapeutique innovante pour traiter la fibrose. En effet la production de composés chimiques par le PFA entraine un stress de la cellule. Ainsi, nous émettons l'hypothèse selon laquelle le PFA pourrait restaurer un fonctionnement tissulaire normal par différents mécanismes i) en modulant la fonction des cellules impliquées dans la progression de la fibrose et ii) en modifiant la structure des protéines du tissu fibrotique. Les objectifs sont de tester l’efficacité anti-fibrosante du PFA et de mieux comprendre les mécanismes d’action du PFA, en particulier sur le phénotype des cellules pro-fibrosantes et sur les composants de la MEC, dans des modèles précliniques de fibrose hépatique. La caractérisation des échantillons sera réalisée par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire.
Bénéfices attendus
La fibrose hépatique est la cause directe d'environ un demi-million de décès par an dans le monde. En outre, elle alimente la gravité d'autres maladies chroniques du foie, y compris le cancer primitif du foie. À ce jour, les options thérapeutiques visant à restaurer l'homéostasie du foie fibreux ne sont pas satisfaisantes, et restent un enjeu médical majeur. Dans son ensemble, ce projet est de tester dans différents modèles expérimentaux murins, l’effet du plasma froid atmosphérique (PFA) sur le foie fibreux. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet anti-fibrosant du plasma froid atmosphérique dans 3 modèles bien décrits de fibrose hépatique représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-fibrosant s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-fibrosant applicable en santé humaine dans le cadre des maladies hépatiques fibrosantes. Au-delà de la fibrose, les PFA pourraient jouer un rôle important dans le développement de nouvelles applications médicales. Par exemple, les résultats pourraient orienter la création de nouvelles thérapies pour la cicatrisation des plaies, le traitement du cancer et l'ingénierie tissulaire.
Procédures
Le modèle génétiquement modifié utilisé développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post opératoire. La chirurgie est d’une durée 15 à 20 minutes pas animal. Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces injections sont effectuées sur animal vigile par simple contention et ne dure que quelques secondes par animal (moins de 30 secondes). Pour les traitements au plasma froid, les souris seront anesthésiées et seront exposés soit par application locale au niveau cutanée, soit par injection au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale). Ces traitements ne devraient pas excéder quelques minutes et pourront être appliqués jusqu’à 6 fois maximum avec un intervalle de 3 à 5 jours entre chaque traitement. A l’issue des traitements, les animaux seront anesthésies et analgésiés puis seront soumis à un prélèvement sanguin précédant l’euthanasie. Ce prélèvement est strictement nécessaire pour les analyses à effectuer et ne durera pas plus de 5 minutes entre de début de l’anesthésie et l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement, chirurgicalement, ou chimiquement. A un stade tardif, ces modèles conduisent tous à une pathologie/défaillance hépatique pouvant induire un ictère (jaunissement) et dans les cas les plus graves peuvent conduire au décès. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et tester la thérapie par plasma froid. Le modèle génétiquement modifié développe spontanément une fibrose qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Le modèle chirurgical implique une chirurgie abdominale qui engendre donc des nuisances liées à l’anesthésie (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.) et à la chirurgie elle-même (douleurs post-opératoires malgré la prise en charge réalisée, inflammation locale, risque de dessiccation de la plaie, etc.). Enfin, le modèle chimique implique des injections régulières au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress en raison de la contention et d’une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Le traitement par plasma froid devrait quant à lui réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées. Cependant, l’utilisation de ce gaz faiblement ionisé appliqué directement sur la peau de l’animal peut générer des brûlures superficielles et un assèchement de la peau pouvant aller jusqu’à la nécrose dans les cas les plus extrême (peu probable). Pour les traitements administrés par injection au niveau de l’abdomen les nuisances pourraient être un éventuel durcissement abdominal, inflammation, etc.). Les traitements seront effectués sous anesthésie et impliqueront donc également les contraintes/risques liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.). Enfin, le prélèvement sanguin effectué avant l’euthanasie sous anesthésie et analgésique pourra induire un stress au moment de l’induction de l’anesthésie. Ce prélèvement sera effectué́ juste avant l’euthanasie de l’animal (pas de réveil).
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact « biologique » des différents traitements, en utilisant les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-fibrosantes. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les pathologies hépatiques, telle que la fibrose qui peut évoluer vers la cirrhose, puis le cancer. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2095 animaux. Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire nécessaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée transgénique utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de fibrogenèse hépatique dans sa globalité. Aussi, la souris est utilisée pour mimer la fibrose hépatique avec des caractéristiques de la maladies proches de celles observées chez l’homme. Plusieurs modèles animaux de fibrose hépatiques existent chez la souris récapitulant les différentes formes observées chez l’homme. Nous utiliserons un modèle génétiquement modifie qui développent de manière spontanée des lésions hépatiques. Nous utiliserons également des souris commerciales et induirons chirurgicalement ou chimiquement des modèles de fibrose validé par la communauté scientifique. Justification des stades : Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte : - 4-8 semaines pour les animaux transgéniques - 6-8 semaines pour les animaux commerciaux dont 1-2 semaines d’acclimatation. Nous n'utilisons pas d'animaux trop vieux afin de nous affranchir des modifications des fonctions hépatiques dues à l'âge et qui pourraient interférer avec nos résultats.
Effet d’un traitement par plasma froid sur une brûlure du troisième degré infectée par Staphylococcus aureus.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Objectifs
La peau est une barrière physique essentielle pour le corps humain : elle protège l’organisme contre le milieu extérieur. Cependant, lorsqu’elle subit une grave agression comme une brûlure profonde ou que les mécanismes de cicatrisation sont mis à mal comme dans le cas d’ulcères diabétiques, la fonction barrière de la peau n’est plus efficace et l’organisme entier peut être mis en danger. En effet, dans le cas des brûlures étendues ou des plaies chroniques, les infections sont très fréquentes et peuvent mener à des complications comme des amputations ou des septicémies, premières causes de mortalité des grands brûlés. Les infections les plus fréquentes sont provoquées par la bactérie pathogène opportuniste Staphylococcus (S.) aureus. Hypothèse de travail et contexte scientifique : Le plasma froid (PF) contient des électrons, des ions positifs et négatifs, des radicaux, des molécules excitées, des ultraviolets (UV) et génère un champ électrique transitoire. La température du gaz généré est proche de la température ambiante. Le PF est capable d’initier des réactions variées dans les systèmes biologiques et pourrait être utilisé dans le traitement de désordre cutané comme les brûlures et les plaies chroniques. Le plasma permet un traitement local et non pas systémique et n’induit pas de sous-produits à éliminer. Nos expériences in vitro non publiées ont démontré que le plasma froid active des molécules toxiques pour les bactéries. Projet : Pour donner suite à ces résultats prometteurs, nous souhaitons caractériser les mécanismes antibactériens du PF et son potentiel anti-biofilm in vivo. Notre objectif est de démontrer que l’application directe de PF sur une brûlure du troisième degré infectée par S. aureus permettrait d’empêcher la formation de biofilms ou de les éliminer, ainsi que d’en comprendre le mécanisme.
Bénéfices attendus
Ce projet, mené sur un modèle de plaie cutanée par brûlure au troisième degré traitée par une greffe de peau humaine et infectée par des bactéries, permettra de révéler le mécanisme d’un traitement direct par plasma sur la désinfection de ce type de plaie et la prévention de formation de biofilms, une nouvelle piste thérapeutique.
Procédures
Type d'intervention sur animaux vivants : - Anesthésie générale (durée 20 min) - Intervention chirurgicale (durée 20 min) - Injection (durée 1 min, 3 fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie) - Infection sur la peau (durée 1-2 min) - Analyse du signal bioluminescent (10 min) Nuisances attendues : - Stress physique d’origine thermique - Lésions et infection cutanée
Impact sur les animaux
La brûlure cutanée sera un dommage inhérent au projet. Un stress physique d’origine thermique est donc attendu. De même, des lésions et une maladie sont attendues suite à l’infection des greffons. D'autres dommages pourraient se produire suite à la diffusion par voie sanguine des bactéries à partir du foyer initial cutané (endocardite, ostéomyélite, choc septique) bien qu'ils n'aient pas été observés dans notre étude précédente.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure qui permettra d‘étudier la formation des biofilms et leur traitement par le plasma froid. Au cours de l'expérimentation, des animaux seront infectés par Staphylococcus aureus. À la fin de l'expérience, des tissus comprenant de la peau infectée et du sang seront prélevés. Le prélèvement de tissus biologiques nécessite l'euthanasie.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative à l’expérimentation animale pour cette étude. En effet, le plasma, en distribuant des espèces actives, agit non seulement sur les cellules cibles mais aussi sur l’équilibre moléculaire in vivo à la fois localement mais aussi de manière plus diffuse autour de la zone traitée. Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, la précision et la reproductibilité de la technique ont été validés précédemment sur des cellules cutanées isolées in vitro. Des modèles de peau bio-imprimés en 3D et ex vivo sont également utilisés au laboratoire. Mais ceux-ci ne permettent pas de reconstituer la véritable inflammation et ne contiennent que 3 types de cellules différentes. Il est donc indispensable de tester cette technique in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet est réduit au strict minimum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative, à savoir 6 animaux par condition, à raison de 7 conditions, en 3 réplicas et 42 animaux donneurs, soit un total de 168 souris. Une précédente expérimentation avait permis de montrer que ce nombre d’animaux par groupe était suffisant pour conclure de manière significative.
Raffinement
Avant et après la brûlure et la chirurgie une analgésie sera maintenue. Les souris anesthésiées seront réchauffées pour prévenir l'hypothermie. Pendant 48 heures après la brûlure, une réhydratation des animaux par injection de solution de réhydratation sera réalisée. Des gels hydriques seront disposés dans les cages. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. La pose de la greffe de peau sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris anesthésiées seront réchauffées. L’injection d’analgésie sera administrée 30 min avant la pose d'une greffe de peau, puis toutes les 8 heures 3 fois par jours après la greffe. Une solution de réhydratation sera injectée pour éviter la déshydratation. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. L’analgésique sera injecté 3 fois par jour. Toutes les souris seront pesées quotidiennement. Les souris seront surveillées une fois par jour pour les activités naturelles telles que l'exploration, le repos, l'escalade, le toilettage, la recherche de nourriture, la nidification et le comportement social. Les points limites généraux seront : une perte de poids significative, des changements de comportement, tels que l'agressivité, l'isolement dans le groupe, l'agitation et l'automutilation, ainsi que des réactions autonomes telles que des pupilles dilatées, une respiration rapide et la piloérection persistante. Un autre point limite spécifique sera la surinfection non liée à la procédure.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphyloccus (S.) aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus. Il y a une abondante littérature et des modèles expérimentaux bien établis chez la souris de laboratoire. De plus, nous avons l'expérience de l'expérimentation animale sur cette espèce au laboratoire. Cet animal sera bien adapté à notre problématique. En effet, les plaies étudiées sont faiblement étendues limitant la douleur et les dommages : l'utilisation d'une autre espèce mammifère de plus grande taille comme le rat nécessiterait plus de matériel de départ pour un gain nul. Enfin, une précédente étude réalisée chez la souris a donné des résultats très prometteurs. Les souris auront environ 6 semaines à leur livraison. Une phase d’acclimatation d’une semaine minimum sera observée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 8 semaines). A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation et une brûlure aisée de la peau.
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmasfroids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette seconde étude menée dans le cadre d’un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat et de les comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées, en utilisant un gaz rare différent de celui utilisé lors d’une précédente étude, ainsi qu’un nouveau dispositif médical breveté permettant la diffusion des plasmas froids générés. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats sera nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur le modèle expérimental de plaie cutanée chronique et sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc à nouveau 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie préopératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celleci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue (plusieurs semaines). Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Technologie du plasma à gaz médical contre les bactéries résistantes aux antibiotiques infectant les plaies chroniques : Partie 3 : Efficacité des plasmas froids contre des plaies aigës ou pseudo-chroniques infectées par Staphylococcus aureus chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Objectifs
L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l'efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.
Bénéfices attendus
Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.
Procédures
Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).
Impact sur les animaux
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.
Réduction
Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d'animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d'animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire 'un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d'un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l'infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.
Etude de faisabilité et de sécurité d’un dispositif endoscopique délivrant du plasma froid atmosphérique chez le cochon
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Objectifs
Tester un dispositif pour traiter localement par voie endoscopique des tumeurs des bronches et des voies biliaires, 2 tumeurs difficiles à traiter en raison de leur localisation, grâce à une technique utilisant le plasma froid atmosphérique, qui est un gaz ionisé utilisé comme agent antitumoral. L’équipe a une grande expertise dans ce domaine puisqu’elle a déjà mené plusieurs travaux dans ce domaine. Nous souhaitons passer maintenant à l’évaluation en temps réel de notre dispositif.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont que le plasma soit délivré en toute sécurité (absence de lésions électriques et de brûlures) dans les voies biliaires et dans les bronches sans induire d'effets délétères sur les tissus sains. Ce projet a pour but de valider la faisabilité et la sécurité d’un dispositif endoscopique à plasma qui est la promesse d'une nouvelle alternative aux approches conventionnelles comme la chirurgie ou la chimiothérapie pour le traitement des cancers des voies biliaires et du poumon chez l’Homme.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à une endoscopie, dans les poumons (bronchoscopie) et les voies biliaires (duodénoscopie) afin d’appliquer le plasma froid atmosphérique dans ces cavités. Pour cela, les animaux seront anesthésiés, et une endoscopie des poumons et des voies biliaires sera réalisée par des experts cliniciens. Ces interventions seront réalisées au nombre de 40, pour une durée de 2 heures (installation dans la salle d'examen, administration de la sédation, réalisation de l'examen, réveil).
Impact sur les animaux
perforation digestive ou pulmonaire
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=40) seront mis à mort à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, le remplacement n’est pas possible car il vise à tester un dispositif médical qui est un endoscope au sein d’un organisme vivant complexe. Il n’y a pas de modèles in vitro ou in silico. Le porc possède l’avantage d’avoir un système aérodigestif (poumon, foie et canaux biliaires) proches de celui de l'homme en termes de taille et de caractéristiques physiologiques et anatomiques. En outre, il existe de nombreuses similitudes morphologiques entre les poumons porcins et humains, tous deux étant fortement lobulés, avec des lobules pulmonaires bien définis et délimités par des cloisons interlobulaires. Le recours à l'expérimentation animale chez le cochon constitue un prérequis avant la réalisation d’essais cliniques chez l’Homme. Dans les procédures 1 et 2 un même porc servira pour tester les 2 dispositifs médicaux (bronchoscope et duodénoscope).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux en testant sur un même animal l’endoscope à plasma dans les voies biliaires puis dans les bronches. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de porc. Un nombre de 10 porcs par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 40 porcs sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire effectue une surveillance hebdomadaire ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur) Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Les animaux sont mis en boxe commun dès que les conditions optimums nous le permettent.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des porcs car le foie et les canaux biliaires des porcs sont proches de ceux du corps humain en termes de taille et de caractéristiques physiologiques et anatomiques. Le tube digestif (œsophage, estomac) est également similaire, ce qui permet l’utilisation du même matériel que chez l’homme (utilisation d’un duodénoscope). De plus, des similitudes morphologiques existent entre les poumons porcins et humains, tous deux étant fortement lobulés, avec des lobules pulmonaires bien définis et délimités par des septums interlobulaires, et car ces animaux constituent des modèles validés par les cliniciens pour la manipulation d’endoscopes. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des porcs commerciaux mâles ou femelles d’environ 45-55 kg, fournis par un éleveur agrée. Les porcs opérés seront âgés de 6 à 8 semaines pesant environ 45 kgs à ce stade.
Investigation des Plasmas Froids Atmosphériques pour le traitement des adénocarcinomes pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Objectifs
Ce projet est justifié du point de vue scientifique au travers de : (1) la validation du projet global par les instances scientifiques qui financent l’expérimentation. Les responsables sont porteurs de différents projets impliquant les protocoles d’expérimentation animal détaillé plus bas qui ont été validés et donc soutenus par différentes instances telles que l’INSERM et SU. (2) la validation au niveau international des protocoles développés à travers la publication d’articles scientifiques dans les journaux à comité de lecture. La participation des responsables dans ce domaine est référencée sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed. (3) Nous avons préalablement montré que TLR7 a un rôle pro-tumoral dans un modèle de tumeur pulmonaire, en sous- cutanée. Les modèles animaux expérimentaux sont les seuls modèles permettant de réaliser cette étude, puisque ce récepteur est exprimé à la fois par les cellules tumorales et les cellules immunitaires, et l'impact de la stimulation de ce récepteur ne peut être testé qu 'in vivo.
Bénéfices attendus
Cela permet de travailler sur un organisme entier
Procédures
Il n'y a pas de prélèvements sur annimaux vigiles ou d'actes chirurgicales
Impact sur les animaux
Les animaux commerciaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne. Les animaux seront gardés en groupes et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris pour minimiser l’angoisse. Concernant les conditions de stabulation, notre animalerie a mis en place un programme d’enrichissement qui consiste à placer des nids végétaux dans les cages. La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum par cage de Type IIL, température 22°C (+/-2°C), éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum ainsi que l'eau par biberon). Nous utiliserons un test bilatéral standard de comparaison des moyennes de souris mutées comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 5%. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie d’une part. De plus, nous assurons en plus une surveillance et un contrôle 2 fois par semaine pour les souris dès leurs arrivées à l'animalerie avec recherche de signes d’altération de l’état général (poil mal entretenu, souris isolée et recroquevillée, non réactive, amaigrissement et de difficultés respiratoires (augmentation de la fréquence respiratoire). En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale. Afin d’assurer une validité statistique aux expériences, un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé pour suivre l’évolution de la croissance tumorale, l’apparition des métastases et l’infiltrat immunitaire. Chaque expérience sera répétée trois fois. Les résultats seront comparés grâce aux tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées par dislocation cervicale
Remplacement
Nous menons dans notre laboratoire des études de compréhension des mécanismes impliquant TLR7 conduisant à des effets pro-tumoraux et de résistance au traitement par chimiothérapie chez des souris atteintes de tumeurs pulmonaires. La complexité de ce système ne pouvant en aucun cas être remplacée par des modèles in vitro puisque nous devons étudier les effets de la stimulation de TLR7 dans un organisme où à la fois les cellules tumorales et les cellules de l’hôte peuvent exprimer et être stimulées par ce récepteur. De plus, les souris C57TyrC (albinos) que nous utilisons dans notre modèle sont couramment utilisées en recherche en immunologie des tumeurs, par différents laboratoires, ce qui permet d'échanger et de discuter les résultats obtenus avec les laboratoires qui étudient d’autres aspects du même modèle. De plus, nous avons sélectionnés des souris albinos afin de réduire le bruit de fond lors des acquisitions à l’aide de l'imagerie IVIS (Lumina II - Perkin Elmer).
Réduction
Reduce (Réduire) le nombre d'animaux en expérimentation : les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumorale et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases.
Raffinement
Refine (Raffiner) la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites (critères d'interruption, ou "end- points") : des points limites ont été établis, pour définir à quel moment euthanasier les animaux au cours des expériences, si des signes de souffrances sont visibles. Ceci ne peut donc pas être étudie in vitro. De plus, Les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale adaptée pour conduire nos expériences avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement et qui permet le recours à des modèles génétiquement modifiés. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos, provenant du fournisseur Janvier Labs. Cette lignée albinos est une lignée dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence Les animaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature. Les animaux sont identifiées au niveau de la queue à l'aide d'un marqueur dès que les tumeurs sont palpables (2 semaines après injection de cellules tumorales)
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmas froids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette première étude dans le cadre d'un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids de "nouvelle génération" sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat, et de comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social. Un prélèvement de sang de 3 ml environ sera réalisé sur les 20 rats lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, effectué en moins d’une minute avant leur euthanasie, pour réaliser des analyses sanguines.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
a procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés.
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrit dans la présnte demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.