Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Rôle des macrophages tissulaires dans l’altération de la réparation des organes après un sepsis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Neuf mesures de pression artérielle et trois échocardiographies par animal, plus la pose sous la peau du dos d'une pompe osmotique : 5 148 souris mâles vont être utilisées, 3 822 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 1 326 d'un niveau modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la rate, du rein, du cœur, de la moelle osseuse et du sang. Des injections intrapéritonéales et sous-cutanées leur provoquent un sepsis, avec un état fébrile de plusieurs heures, une perte de poids et une baisse d'activité. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles étant selon lui relativement protégées du sepsis par les œstrogènes. Il affirme avoir réduit les effectifs "à son minimum" grâce à des analyses statistiques, sans donner ni calcul ni taille de groupe pour ces 5 148 souris.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le coeur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre, à court terme, un meilleur suivi de ces patients, et de dégager de nouvelles thérapeutiques à plus ou moins long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intra-péritonéales et sous-cutanées) pour générer l’état de sepsis et faire varier la réponse inflammatoire au cours des 14 premiers jours de la procédure. Ces injections sont peu douloureuses et sont réalisées en quelques minutes. Une chirurgie quelques jours plus tard permettra la pose sous cutanée d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie en début de procédure, avant la chirurgie et au moment de la mise à mort de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle non invasive sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant le début de la procédure pour habituer l’animal, puis au moment de la chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la chirurgie (9 fois 10 minutes). Pour les animaux élevés au sein de l'établissement, une biopsie de queue est réalisée dans les premiers jours de vie (10 à 15 jours) pour nous assurer de leur conformité génétique. Ces biopsies sont réalisées en moins d’une minute par un expérimentateur qualifié.
Impact sur les animaux
L’induction d’une infection septique induit un état fébrile qui perdure plusieurs heures. Un traitement antibiotique sera administré durant les premiers jours pour limiter la fièvre. La perte de poids et une diminution de l'activité sont des complications attendues, et reviennent à la normale en quelques jours. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress pour l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure. La pose de pompe sous la peau du dos est un acte chirurgical qui comporte peu de risques pour l’animal, mais peut occasionner une gêne pour celui-ci. Pour caractériser génétiquement les animaux du projet, une biopsie unique à la queue est effectuée 10 à 15 jours après la naissance. C’est un acte peu douloureux et qui ne met pas en jeu la survie de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Afin de réduire les nuisances causées par l’induction du sepsis, une antibiothérapie sera mise en place les premiers jours. La chirurgie ser fera sur animal anesthésié et analgésié.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Etude des fonctions de réparation tissulaire et d’immunomodulation d’une sous-population de lymphocytes T dans un modèle de dommage consécutif à l’infection par influenza
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par un virus de la grippe sous anesthésie, des souris reçoivent ensuite des traitements répétés une à deux fois par semaine pendant dix jours, et jusqu'à six injections en deux heures juste avant la mise à mort. 2 138 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, 2 017 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 121 un niveau sévère. Le porteur décrit une hypothermie et une perte de poids durant cinq à dix jours après l'infection, tout en affirmant que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l'animal. Sur le dimensionnement de l'étude, il écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Lorsqu'ils sont infectés, les tissus subissent des dommages dus non seulement à l'infection elle-même, mais aussi aux mécanismes de défense mis en place pour supprimer le pathogène. Il est donc nécessaire pour l'organisme de contrôler ces mécanismes de défense et de réparer ces dommages une fois l'infection contrôlée, afin que le ou les organes touchés conservent leur fonction. C'est le cas notamment des poumons suite à une infection virale telle que la grippe, mais à l'heure actuelle, les mécanismes de réparation sont mal connus. Pendant les infections virales, le dommage de la barrière entre le sang et les alvéoles pulmonaires, et l’œdème en résultant perturbe les échanges gazeux et entraine un syndrome de détresse respiratoire quand les lésions s’étendent. Cliniquement, ce syndrome est caractérisé par un défaut aigu de la fonction respiratoire dans les 7 jours après les premiers symptômes et présente un taux de mortalité de près de 40%. Malgré de nombreux essais cliniques, peu de traitements sont aujourd’hui proposés et leur efficacité reste limitée. Il est donc nécessaire de mieux caractériser les mécanismes empêchant le contrôle de l’inflammation, ainsi que ceux induisant la réparation des tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux caractériser le syndrome de détresse respiratoire aigu, afin de proposer des traitements efficaces. Les résultats obtenus permettront 1) de mieux caractériser une sous population immunitaire présente en nombre important chez l’homme, avec des propriétés variées, à la fois anti-infectieuses et de réparation tissulaire, 2) de mieux comprendre leur implication dans les pathologies respiratoires et 3) de tester leur potentiel thérapeutique en les stimulant spécifiquement lors d’une infection virale. Par ailleurs, leur étude permettra d’étendre ces résultats à la biologie d’autres sous populations immunitaires proches qui s’établissent dans les tissus sur le long terme suite à des infections virales.
Procédures
Un premier lot d’animaux sera infecté par un virus de la grippe (1 fois seulement, sur animal anesthésié, durée anesthésie : 20 min Un second lot sera à la fois infecté (administration sur animal anesthésié – durée de l’anesthésie : 20min), puis traité selon des protocoles allant de l’administration unique à l’administration répétée une à deux fois par semaine pendant 10 jours (administration des traitements sur animaux vigiles ou anesthésiés, durée de chaque geste inférieure à 10 sec). Un troisième lot d’animaux sera utilisé pour la mise en place d’un modèle. Ces animaux recevront une administration unique de cellules sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec) ou anesthésiés (durée de l’anesthésie : 20 min)). Certains de ces animaux seront préalablement infectés par le virus de la grippe (administration sur animal anesthésié – durée de l’anesthésie : 20min), Un quatrième lot comprendra des animaux injectés soit avec des cellules ou avec un colorant physiologique (administration unique sur animaux anesthésiés, durée de l’anesthésie : 20 min). Certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 min). Ceux-ci seront ensuite traités selon des protocoles allant de l’administration unique à l’administration répétée une à deux fois par semaine pendant 10 jours (administration des traitements sur animaux vigiles ou anesthésiés, durée de chaque geste inférieure à 10 sec, durée de l’anesthésie : 20 min). Un cinquième lot recevra : Sous groupe 1 : un ou deux traitements (administration unique pour chaque traitement sur animaux vigiles, durée du geste :10 sec), puis recevra des injections répétées (6 fois en 2h sur animaux vigiles, durée de chaque geste inférieure à 10 sec) juste avant sacrifice. Certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 minutes). Sous-groupe 2 : Si les résultats initiaux du sous-groupe 1 ne sont pas probants, nous utiliserons une autre souche de souris, en répétant les administrations du sous-groupe 1 ainsi qu’un transfert de cellules (administration unique sur animaux anesthésiés, durée anesthésie : 20 min). Si les résultats sont concluants, certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 min).
Impact sur les animaux
Les animaux infectés par le virus de la grippe développeront la maladie qui entrainera une légère hypothermie et une perte de poids qui durera entre 5 et 10 jours en fonction de la souche de virus utilisée. Les nuisances attendues lors de l’administration des virus ou des traitements seront celles liées aux injections elles-mêmes (douleur légère de courte durée). Suite à l'injection d’anesthésique ou de traitement (sans anesthésie) dans l'abdomen, une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem qui permettront de comprendre les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, les cellules résidant dans le poumon sont adaptées à cette localisation et à leur microenvironnement. Enfin, l’infection virale entraîne la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles, ces cellules étant à la fois déjà dans le poumon ou recrutées à des temps variables suite à l’infection. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits in vitro. En revanche, si les premiers résultats in vivo nous le permettent, des expériences in vitro à partir de cellules isolées de souris non manipulées seront réalisées. Cela pourrait permettre d’affiner les hypothèses et de réduire le nombre final de souris. De même, il existe dans la littérature des caractérisations exhaustives des populations cellulaires et de leurs dynamiques au cours de la grippe. Dès que cela sera possible, nous utiliserons ces données plutôt que d’en générer de nouvelles, et nous baserons sur celles-ci afin de réaliser des prédictions in silico, c’est à dire tenter de prédire des mécanismes afin de mieux cibler les expériences nécessitant effectivement l’animal. Enfin, certaines procédures décrites ici cherchent à mettre des modèles qui évitent de générer de nouvelles lignées, ce qui limite fortement le nombre d’animaux qui serait nécessaire pour la génération de ces lignées.
Réduction
1) Le nombre d’animaux à utiliser par groupe expérimental se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire ou par des collaborateurs en utilisant ces modèles. Ces nombres sont ajustés pour limiter le nombre d’animaux à utiliser tout en surmontant les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à nos modèles. Par ailleurs, certaines procédures décrites ici cherchent à mettre des modèles qui évitent de générer de nouvelles lignées, ce qui limite fortement le nombre d’animaux qui serait nécessaire pour la génération de ces lignées. Enfin, les procédures contiennent des expériences permettant de valider le modèle expérimental choisi. Si ces validations ne sont pas concluante, nous ne continuerons pas l’expérimentation à partir de cette procédure (points de go/no go). 2) Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Avant l’infection, les souris seront manipulées sur plusieurs jours dans les conditions expérimentales afin de limiter leur stress. Suite à l’infection grippale, les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris infectées par le virus seront pesées tous les jours au pic de la maladie pour contrôler l’amplitude de l’infection (les pesées sont espacées de 2/3 jours en dehors du pic, afin de limiter le stress des animaux). Un apport supplémentaire de matériel de nidification est apporté afin de pallier l’hypothermie légère associée à la grippe. Une grille de score a été établie afin d’évaluer quotidiennement l’état des animaux de manière objective. Des points limites ont été définis, qui, s'ils sont atteints, marquent la fin de l'expérimentation pour l'animal concerné. Des doses de virus plus légères pourront être administrées si la question scientifique le permet, afin de limiter d’autant plus le nombre d’animaux atteignant un point limite. De même, dès que cela est possible, de la nourriture/eau en gel est placée dans la cage (en amont des symptômes grippaux, afin de permettre une habituation). Afin de limiter au maximum les douleurs et souffrances liées aux différentes injections, les animaux seront anesthésiés et placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil. De la crème vaseline oculaire est déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie.
Choix des espèces
La souris est ici le modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. Plus particulièrement, nos cellules d’intérêt sont présentes à la fois chez l’homme et la souris, espèces entre lesquelles leurs caractéristiques et propriétés sont très fortement conservées. Par ailleurs, la disponibilité de souches génétiquement modifiées parfaitement définies nous permet enfin d’affiner les mécanismes de manière très précise. - Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 16 semaines après la naissance, afin que les populations étudiées soient installées). - Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Nous utiliserons des souris adultes possédant un système immunitaire mature.
Stratégies de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions du muscle squelettique.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une ablation partielle du quadriceps, une injection de toxine qui détruit les fibres musculaires, des électrostimulations sous anesthésie pendant 45 minutes : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur reconnaît que l'ablation du quadriceps et la mesure de force in situ sont sources de douleur, et note que la mobilité revient deux heures après la chirurgie. L'objectif déclaré est de mettre au point des greffes de cellules souches musculaires pour réparer des pertes de muscle massives, l'expérimentation sur les souris servant à valider des données obtenues sur cellules humaines. Le choix de l'espèce, tel qu'il l'expose, tient à la disponibilité de lignées immunodéprimées et à une gestation courte, compatible avec la durée des expériences.
Objectifs
Le muscle squelettique adulte contient des cellules souches appelées Cellules Satellites (CS), qui lui permettent de se réparer après une blessure. Cependant, dans certaines conditions pathologiques (maladies musculaires) ou post-traumatiques (accidents, chirurgie), cette capacité de réparation est altérée, et le muscle ne peut plus fonctionner normalement. Nous utilisons les CS pour développer des traitements pour aider le muscle à se réparer après une lésion traumatique. Nos travaux s’articulent selon 3 projets de recherche : 1) L’optimisation des méthodes de purification des CS : nous améliorons les méthodes de purification des CS humaines pour augmenter la quantité de cellules obtenues et leur qualité pour la clinique, mais également des CS de souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche (Réduction). 2) Le développement de méthodes permettant de produire un nombre élevé de CS humaines in vitro tout en préservant leur pouvoir réparateur (capacité à réparer un muscle endommagé et à reconstituer un pool de CS appelé auto-renouvellement). 3) Le développement de stratégies de médecine régénérative pour réparer les lésions musculaires massives post-opératoires ou post-traumatiques, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Nous étudions le potentiel thérapeutique de nouveaux matériaux associés à différentes sources de cellules ayant un pouvoir de réparation du muscle (les CS et les cellules souches pluripotentes induites [iPSC] humaines).
Bénéfices attendus
Projet 1 : Court terme : Améliorer le rendement de purification des CS de rongeurs permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés la recherche pré-clinique sur les CS. Long terme : Améliorer le rendement de purification des CS humaines permettra de franchir une étape vers leur utilisation clinique en thérapie cellulaire. Projet 2 : Court terme : Nos expériences permettront de mieux comprendre la façon dont les CS humaines fonctionnent et ainsi d’élaborer une méthode pour préserver leurs pouvoir réparateur in vitro. Long terme : Préserver le pouvoir réparateur des CS humaines permettra d’élaborer des traitements pour les lésions musculaires localisées (ex : l’insuffisance urinaire et certaines pathologies musculaires). Projet 3 : Court terme : Notre projet permettra de mieux comprendre les évènements intervenant lors d’une lésion massive des muscles (ou VML), et de développer des approches de médecine régénérative pour remplacer le muscle lésé. Long terme : Nos approches de médecine régénérative conduiront vers le développement clinique de stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions musculaires massives.
Procédures
4 injections intrapéritonéales (IP) sur animal vigile : 2 min (1 fois/jour) ; 1 injection intramusculaire (IM) sous anesthésie générale : 10 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesure force musculaire : 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie et électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesures extension du genou sous électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min (3 fois/souris).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent générer un inconfort passager pendant l’injection. Aucune perte de mobilité n’a été constatée. L’injection intramusculaire d’une toxine induisant une destruction des fibres musculaires est source de douleur. Les animaux retrouvent leur mobilité 10 à 15 min maximum après l’injection. L’ablation partielle du quadriceps est source de douleur pour l’animal. Les animaux retrouvent leur mobilité totale 2h après la chirurgie. La mesure de force musculaire in situ est source de douleur. Les électro-stimulations réalisées sur les muscles d’animaux anesthésiés sont de faible intensité mais peuvent être source d’inconfort. Aucune perte de mobilité n’est constatée. Pour toutes les procédures, des points limites adaptés ont été déterminés et seront appliqués.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures.
Remplacement
Pour l’ensemble de nos projets, les expériences seront réalisées en priorité sur des CS humaines quand cela sera possible. L’expérimentation sur les animaux ne sera utilisée que pour valider nos données in vitro et in silico (Evaluation du potentiel de greffes des hCS préamplifiées in vitro), ou lorsque les processus biologiques doivent être étudiés au niveau de l'organisme entier (Approches d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions VML). Ces projets pré-cliniques ont un fort potentiel translationnel pour le traitement des lésions musculaires focales et des lésions musculaires massives (VML), et doivent donc être validés in vivo sur l’animal avant d'envisager un transfert vers la clinique.
Réduction
Afin de respecter le principe de Réduction dans nos projets, nous avons calculé le nombre d’animaux minimum (strictement nécessaire) par des analyses statistiques (test de puissance). Pour les différents axes, le nombre d’animaux a été calculé indépendamment, en tenant compte des résultats déjà obtenus, de la variabilité inhérente aux différentes procédures expérimentales, et des résultats déjà disponibles dans la littérature scientifique. De plus, toutes les expériences seront conçues et programmées de manière à recueillir le maximum de données par animal. Par exemple, un même muscle sera utilisé pour la mesure de force et plusieurs autres analyses.
Raffinement
Le concepteur et l’applicateur du protocole prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les expérimentations seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Le milieu sera enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, carré de coton compacté et billes de bois. Les protocoles d’analgésie pré- et post-opératoires seront adaptés en fonction de la procédure expérimentale. Ils pourront également être adaptés pendant la réalisation des procédures de façon à limiter au maximum la douleur pouvant être ressentie par l’animal. Les procédures nécessitant l’anesthésie des animaux sont étudiées pour assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie et pour limiter les difficultés de récupération pendant la phase de réveil des animaux. Pour prévenir tout risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur une plate-forme chauffante pendant l’intervention et la phase de réveil , et ne sont remis en stabulation qu’une fois actifs. Les animaux seront à nouveau contrôlés 2 heures après le réveil et de la nourriture humidifiée et de l’hydrogel seront placés dans la cage pour en faciliter l’accès, pendant les premières 24h suivant l’intervention, les potentiels signes de souffrance seront surveillés. Si l’un des point limites énumérés dans le projet était atteint, l’animal concerné serait immédiatement mis à mort (directive européenne 63/UE/2010).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour 2 principales raisons : (1) La disponibilité des modèles transgéniques reporteurs et immunodéprimés nécessaires à nos expériences de greffe, (2) La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Les expériences de greffe et de réparation post-lésionnelle ne peuvent être réalisées que sur des souris adultes en raison de la taille des souris. De plus, le processus d’auto-renouvellement des cellules souches (retour à l’état quiescent) ne peut être étudié que sur le muscle adulte.
Etude des mécanismes de réparation tissulaire de la jonction anorectale et de leurs conséquences sur le développement des cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
109 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines, génétiquement modifiées, développent spontanément un cancer anorectal accompagné d'une inflammation intestinale, avec perte de poids, prostration et diarrhée à partir de six ou sept mois. D'autres subissent des microlésions de la jonction anorectale qui provoquent des saignements de l'anus, ainsi que des injections rétro-orbitaires et une phalangectomie. Le porteur évoque les organoïdes comme alternative mais affirme qu'aucun ne reproduit aujourd'hui cette région, et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Avec plus de 40 000 cas par an en France, le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Les services de santé publique s’accordent tous sur le fait que ce nombre de cas sera plus que doublé d’ici 2035. Faute de connaissance des mécanismes précoces conduisant à ce cancer, son diagnostic est très souvent tardif expliquant une prise en charge à un stade trop avancé de la maladie et donc le fort taux de mortalité. Il y a donc urgence de comprendre les étapes précoces de la maladie pour la soigner à son début. Ce cancer se localise préférentiellement dans la partie basse du rectum dans la région entre le rectum et l’anus, appelé la jonction anorectale. Chez l’Homme plusieurs arguments suggèrent que des micro-cassures spontanées de la région anorectale notamment lors du passage de selles, provoqueraient une entrée des bactéries qui vivent dans le rectum et donc créeraient une inflammation à l‘origine du cancer. Ce projet de recherche vise à comprendre comment la région anorectale se répare pour prévenir l‘entrée des bactéries et de l’inflammation. L’hypothèse basée sur des études antérieures suggère que le système immunitaire et plus particulièrement certains globules blancs contribuent à la réparation de la jonction anorectale.
Bénéfices attendus
Ainsi, en validant que certains globules blancs sont capables réparer les micro-cassures de la jonction anorectale, ce projet devrait permettre de considérer les patients présentant un défaut de ces globules blancs comme des sujets à risque de développer un cancer colorectal et ainsi de mettre en place une prise charge à un stade très précoce la maladie afin d’augmenter leur survie.
Procédures
Certains animaux servent à l’élevage et ne subissent pas de gestes techniques autres qu'une phalangectomie, d’autres subissent au maximum une unique procédure avant la mise à mort, consistant à réaliser des microlésions de la jonction anorectale, cette intervention sera réalisée une unique fois par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ayant une réponse incomplète à la molécule d'intérêt développe un cancer anorectal, associé à une inflammation intestinale qui se manifeste par la perte de poids de la souris, sa prostration et la présence de diarrhée, à partir de 6-7 mois de vie. La procédure de microlésions de la jonction anorectale peut provoquer des micro saignements de l’anus, observables par tapotement avec un mouchoir en papier blanc (petites traces rouges). Ces micro saignements ne durent pas plus de 30 minutes. L’injection intra- veineuse par voie retro-orbitaire est une procédure courante, mais qui peut toutefois causer une douleur courte. Dans l’ensemble des procédures, les contentions des souris sont également une source de stress à ne pas négliger.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort soit suite à la fin des procédures, soit lorsqu’un point limite est atteint.
Remplacement
Une alternative à l’utilisation d’animaux pour des pathologies intestinales serait la génération d’organes in vitro, appelé organoïdes qui, en théorie, impliquerait un seul animal. Si ces organoïdes de côlon sont facilement mis en place dans les laboratoires, il n’existe pas aujourd’hui de méthode permettant la génération d’organoïdes comprenant l’anus, le rectum et la jonction anorectale. La génération de tels organoïdes reste encore un challenge technologique qui impliquerait plusieurs dizaines d’animaux du fait que cette région est unique. Par ailleurs, des bactéries commensales devraient être placées dans la lumière. Une telle approche alternative demanderait dans ses mises au point plus de 30 souris. Par ailleurs, les facteurs physiologiques tels que les tensions physiques dues au passage des selles ne seraient pas prises en compte, excluant toutes conclusions physiologiques des observations qui pourraient être faites in vitro.
Réduction
Le développement de la pathologie dans les souris développant un cancer anorectal est standardisé. 100% des animaux développent spontanément un cancer. Par ailleurs, le site de transformation est très précis et spécifiquement localisé à la jonction entre l’anus et le rectum. Ces conditions font que nous obtenons une puissance statistique forte avec 6 animaux par groupe par rapport aux modèles d’injection de cellules tumorales ou d’agents oncogéniques communément utilisés en cancérologie (le nombre de souris a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistique). Le genre n’ayant pas d’effet sur la pathologie observée, les animaux des deux sexes seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux générés Par ailleurs, les moelles osseuses des animaux mis à mort seront systématiquement congelées. Elles permettront de recréer un système immunitaire génétiquement modifié dans des souris receveuses. Une moelle pouvant générer un système immunitaire dans plus de 20 souris, ces moelles seront partagées avec des chercheurs du monde entier, évitant la génération d’animaux.
Raffinement
Les procédures de microlésions impliqueront en plus d’une anesthésie gazeuse, une injection d’analgésique et une pommade anesthésiante, appliquée en région anale 5 min avant les microlésions. Ces 2 produits sont efficaces dès les premières minutes et durent entre 1h30 et 4h, délai au-delà duquel la fonction de défécation doit être revenue. Par ailleurs, le geste de microlésion est maitrisé par les expérimentateurs qui ont été formés par l’équipe ayant décrit la méthode des microlésions. Les animaux ne seront jamais isolés directement afin d’éviter tout stress et si un isolement est obligatoire il se fera via un système de plexiglass assurant un maintien olfactif et visuel. En plus des observations faites par les responsables de protocoles et le personnel technique, une observation quotidienne des animaux par les responsables bien être sera réalisée. Les expérimentateurs surveilleront le moindre signe de souffrance de l'animal selon un système de score, ce qui permettra une réponse adaptée à la douleur en question.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire impose que cette étude ne se fasse que dans un système proche de celui de l’Homme. La souris, apparaît comme un modèle d’expérimentation animale de choix. De plus la physiologie de la jonction anorectale est identique à celle de l’Homme et correspond à une région à fort potentiel de transformation. Enfin, les outils d’analyse indispensables à ce projet de recherche, sont développés chez cette espèce animale. Pour les souris dont le phénotype est potentiellement dommageable, les premiers signes cliniques sont observés après l’âge de 6-7 mois de vie. Dans ce contexte, y compris pour les accouplements, aucun animal au-delà de 6-7 mois de vie ne sera utilisé. La maturité du système immunitaire au niveau de l’intestin est établie après 2 mois. Tous les animaux utilisés en procédure auront entre 2 et 6 mois de vie.
Ingénierie Tissulaire : Evaluation d’hydrogels nutritifs favorisant la viabilité et la fonctionnalité des cellules ostéoprogénitrices implantées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
135 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau du dos des hydrogels nutritifs porteurs de cellules souches humaines, avec des séances d'imagerie répétées et, pour une partie, une thoracotomie avec injection d'un agent radio-opaque, pour évaluer la survie de ces cellules en vue de réparer l'os. Le porteur signale des douleurs, des risques d'infection et une gêne liée à la taille des implants. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'environnement complexe suivant l'implantation et qu'un "modèle in vivo" est nécessaire.
Objectifs
Les greffes osseuses autologues (autogreffes) sont largement utilisées en clinique pour des interventions de reconstructions osseuses mais présentent plusieurs limites. L’ingénierie tissulaire osseuse se développe comme une alternative à la greffe osseuse en associant des biomatériaux à des cellules souches, principalement des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) capables de se différencier en ostéoblastes (cellules de l’os) et de promouvoir la revascularisation du site afin de régénérer le tissu osseux. Malgré des résultats encourageants et la preuve de la sécurité de l’utilisation des CSMs chez l’Homme, l’efficacité de ces matériaux cellularisés dans la réparation osseuse reste inférieure à celle de l’autogreffe. La forte mortalité des cellules implantées (90%) observée lors des deux premières semaines post-implantation est un des facteurs clés expliquant ces résultats suboptimaux. Cette mortalité serait due aux conditions ischémiques (manque d’oxygène et de nutriments) rencontrées après implantation. Comme nous avons démontré que les CSMs survivaient in vitro et in vivo à l’absence d’oxygène mais pas à celle de nutriments, nous avons développé, en collaboration avec une autre équipe, un hydrogel nutritif à base de fibrine (couramment utilisée en clinique) capable de libérer du glucose après implantation par digestion d'un polymère de glucose par une enzyme, tous deux contenus dans l’hydrogel. Des expérimentations in vitro ont déjà démontré que ces hydrogels amélioraient significativement la survie et la fonctionnalité des CSMs en conditions ischémiques. Les premiers résultats in vivo ont également été encourageants mais suboptimaux et nous avons donc amélioré la composition de nos hydrogels afin de prolonger la libération du glucose. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo l’effet bénéfique de ces hydrogels nutritifs optimisés sur la viabilité et la fonctionnalité (potentiels à induire des vaisseaux sanguins et de l’os) des CSMs.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime du projet est de développer une alternative à la greffe osseuse pour combler des grandes pertes osseuses chez l’Homme. L'os est en effet le deuxième tissu le plus transplanté après le sang, avec plus de 2,2 millions de greffes osseuses réalisées chaque année dans le monde. Les transplants osseux sont généralement récoltés chez le patient (autogreffes), mais les complications associées au site donneur, ainsi que la faible quantité et/ou qualité de l'os récolté chez les patients âgés, pédiatriques ou cancéreux constituent des limites sérieuses pour cette technique. Les produits d’ingénierie tissulaire osseuse représentent donc un traitement alternatif aux autogreffes prometteur. Toutefois, plusieurs études ont montré que les cellules implantées ne survivent pas assez longtemps pour induire une formation osseuse suffisante pour combler des défauts osseux de grande taille. Le développement d’un hydrogel nutritif améliorant la survie et la fonctionnalité des cellules implantées permettrait donc d’améliorer le potentiel réparateur de ces produits d’ingénierie tissulaire osseuse.
Procédures
Pour tous les animaux (135 souris) : Les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale est bien établie deux à quatre incisions cutanées seront effectuées dans le dos et les hydrogel mis en place (1x, durée 20-30 min). Les incisions seront suturées. Dans les 24h suivant l’opération, les animaux vigiles auront deux injections sous-cutanées d’analgésique à 12h d’intervalle. Pour les animaux de l'étude 1 (30 souris) : ils subiront une anesthésie générale gazeuse avant injection sous-cutanée d’un réactif bioluminescent puis 40 min après seront à nouveau anesthésiés au gaz pour l’acquisition du signal bioluminescent. La procédure sera répétée 6 fois pendant la période d’implantation (6x, durée 5+5min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l'étude 2 (90 souris) : les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale profonde est bien établie, les animaux auront une thoracotomie suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l'étude 3 (15 souris) : au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min).
Impact sur les animaux
La chirurgie d’implantation en sous-cutané (135 souris) peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut-être également observé occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants pour 90 souris peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait dans les 48h post-implantatoire. Les anesthésies gazeuses nécessaires à l’imagerie non invasive en bioluminescence (30 souris) vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. Enfin, les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence. Celles-ci suivront les bonnes pratiques vétérinaires.
Devenir
Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de chaque étude afin de permettre l’explantation des hydrogels et des analyses post-mortem (radiologiques, histologiques et/ou analyses de l'expression génique).
Remplacement
L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par l’effet d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux l’étude 1 est une étude de suivi longitudinal, où les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). Basé sur les premiers résultats d'un précédent projet nous avons supprimé un temps d’analyse (semaine 1) pour l’étude du potentiel des CSMs à induire des vaisseaux sanguins, une procédure (imagerie rayon X) pour l’étude du potentiel des CSMs à former du tissu osseux, et un groupe contrôle pour ces deux études car les premiers résultats apportent peu de renseignement sur la capacité de nos hydrogels à promouvoir la fonctionnalité des CSM. En se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses statistiques, un test non paramétrique sera effectué pour une comparaison globale entre les groupes suivi d’une comparaison des groupes deux à deux.
Raffinement
Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires, pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points limites définis au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical seront surveillés et scorés et permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si des points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié. Une analgésie pré-opératoire appropriée sera administrée aux animaux avant tout geste chirurgical.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non-invasive, tel que la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes (souris Nude) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont la croissance et le développement, toujours en cours, permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.
Rôle des isoformes de CXCL12 dans la vascularisation et la réparation tissulaires
- Enquêtes médicolégales
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.
Objectifs
L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.
Bénéfices attendus
Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.
Procédures
Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.
Remplacement
Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.
Raffinement
La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.
Choix des espèces
Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.