Les projets approuvés

3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 1 728 recevront une injection directement dans le cerveau et 192 une double chirurgie. Elles sont soumises à un régime gras, à un gavage de tamoxifène et à un suivi en cage individuelle, puis tuées pour extraction du cerveau. L'étude porte sur les filets qui entourent certains neurones de la satiété et sur leur rôle dans l'obésité. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies contre l'obésité, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’obésité touche aujourd’hui plus de 13 % de la population mondiale et augmente le risque de maladies graves comme le diabète ou les troubles cardiovasculaires. Pour mieux prévenir ou traiter cette maladie, il est essentiel de comprendre comment notre corps régule la faim et la sensation de satiété. Dans le cerveau, une zone appelée l’hypothalamus joue un rôle central. Elle contient des neurones spécifiques, appelés neurones POMC, qui envoient le signal de satiété (on n’a plus faim), et d'autres neurones qui provoquent l’envie de manger. Des recherches récentes montrent que les neurones POMC ne sont pas tous identiques. Certains réagissent moins bien aux signaux hormonaux et seraient plus sensibles à une alimentation trop riche en graisses, ce qui pourrait contribuer à l’installation de l’obésité. Par ailleurs, environ 30 % de ces neurones sont entourés d’une sorte de « filet » protecteur, appelé matrice extracellulaire ou filets périneuronaux (PNN). Ces structures influencent le fonctionnement des neurones et leur capacité à s’adapter. Chez les souris obèses, ces filets semblent profondément modifiés. Nous cherchons à comprendre comment les neurones POMC réagissent aux changements alimentaires (jeûne, réalimentation) et quel rôle joue leur environnement extracellulaire dans cette réponse. Nous allons : Observer ces neurones chez des souris en jeûne, après réalimentation, ou nourries avec un régime gras. Analyser l'activité des neurones et la composition de leur environnement avec des outils d’imagerie et d’électrophysiologie. Modifier directement la matrice autour des neurones pour voir si cela influence leur fonctionnement. Activer ou inhiber artificiellement ces neurones pour étudier l’effet combiné avec les changements de leur environnement. Nous pensons que les modifications de l’environnement des neurones POMC jouent un rôle important dans la dérégulation de la sensation de satiété en cas d’obésité. Mieux comprendre cette interaction entre neurones et matrice extracellulaire pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre l’obésité.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’un milliard le nombre de personnes obèses dans le monde, faisant de l’obésité un enjeu majeur de santé publique. Malgré les efforts thérapeutiques, les traitements disponibles restent globalement peu efficaces à long terme, à l’exception de techniques invasives telles que la chirurgie bariatrique, dont les résultats ne sont pas systématiquement garantis. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l’apparition et à la persistance de cette pathologie, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudions un élément encore peu connu du contrôle de la faim : la matrice extracellulaire, et en particulier les filets périneuronaux (PNN). Ces structures entourent certains neurones du cerveau, notamment les neurones POMC, qui nous aident à ressentir la satiété. Nous pensons que ces filets pourraient réduire la souplesse des neurones, en limitant leur capacité à s’adapter aux changements liés à l’alimentation, surtout en cas d’obésité. Cela pourrait empêcher le cerveau de bien réguler l’appétit lorsque l’environnement nutritionnel change. À court terme, nous voulons comprendre comment ces filets réagissent à une alimentation trop riche ou à des changements rapides de régime, et comment cela influence les neurones qui contrôlent la faim. À plus long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour aider le cerveau à retrouver sa flexibilité, et ainsi améliorer la régulation de l’appétit chez les personnes obèses.

Procédures

4 prélèvements sera effectués au total pour le suivi de la glycémie. Lors de l'habituation au "fasting" : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. Lors de la phase expérimentale : 24 heures après le jeûne puis 1h30 après la réintroduction à la nourriture. A chaque prélèvement, une goutte de sang sera récoltée, soit 50 µL environ. Cela concerne toutes les souris de toutes les procédures, soit 3456 souris. Des procédures chirurgicales sont prévues. 1728 souris auront une injection intra-cérébrale dans le noyau arqué de l'hypothalamus. 192 souris subiront une double chirurgie, soit une injection de virus permettant de contrôler une sous population de neurones, puis une injection d'enzyme permettant de dégrader la matrice extracellulaire.

Impact sur les animaux

Certaines souris de l’étude recevront une administration orale de tamoxifène, connu pour induire une perte temporaire de tissu adipeux, entraînant une perte de poids transitoire. Le gavage, bien qu’indolore, implique une contention totale, source probable de stress. Des douleurs post-opératoires modérées peuvent survenir à la suite des injections stéréotaxiques bilatérales de vecteurs viraux. Ces douleurs seront prises en charge par un traitement analgésique systématique. Lorsque deux interventions seront nécessaires, un délai suffisant sera respecté entre chaque chirurgie afin de maximiser la récupération. Certaines procédures expérimentales peuvent générer un stress transitoire ou des effets physiologiques réversibles (régime hypercalorique). Ces effets ont été anticipés, et des mesures seront mises en place pour en limiter l’impact (enrichissement augmenté). Le passage en cage individuelle, requis pour un suivi précis de la prise alimentaire, pourra induire un stress lié à l’isolement. Toutefois, les cages resteront proches afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre congénères, réduisant les effets d’isolement social. L’analyse de la composition corporelle par EchoMRI nécessite une brève contention (moins de cinq minutes) dans un tube transparent. Ce stress aigu sera donc de faible intensité et de courte durée. L’administration prolongée d’un régime hypercalorique (HFD) entraînera une prise de poids progressive, ne dépassant pas 200 % du poids initial selon nos données antérieures. Un suivi rigoureux sera mis en place afin de prévenir toute dérive pathologique. Les protocoles de jeûne induiront une perte de poids modérée (inférieure à 10 % du poids initial), totalement réversible à la reprise de l’alimentation. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires aux injections intracérébrales provoqueront une douleur modérée liée à l’incision du scalp et du périoste. Un traitement analgésique sera systématiquement administré, avec une reprise attendue de l’activité normale et du poids en 2 à 3 jours. Enfin, certains tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les effets fonctionnels des manipulations. Ils dureront moins d’une heure et nécessiteront une petite goutte de sang pour mesurer la glycémie avec précision.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, les cerveaux seront alors extraits et des analyses d'imagerie, d'électrophysiologie, ou de "Single Particle Tracking" pourront être effectués ex vivo (le cas échéant).

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous-populations de neurones à POMC et les modifications de leur environnement extracellulaire, en particulier les filets péri-neuronaux (PNN), en réponse à la consommation d’un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones étudiés ne fonctionnent pas de manière isolée : ils interagissent avec d’autres structures cérébrales mais également avec des signaux périphériques d’origine hormonale ou nutritionnelle. La matrice extracellulaire pourrait jouer un rôle clé dans cette interface en modulant la plasticité et la réactivité neuronale. Les effets que nous cherchons à comprendre sont donc le fruit d’interactions complexes entre réseaux neuronaux et signaux métaboliques périphériques. Une telle dynamique ne peut être reproduite in vitro, car elle nécessite un système intégratif capable de refléter fidèlement les adaptations comportementales, telles que la prise alimentaire. De même, aucun modèle informatique ne permettrait aujourd’hui de simuler avec une précision suffisante les interactions entre la matrice extracellulaire, l’activité neuronale, et les réponses métaboliques de l’organisme. Seul un modèle in vivo permet de capturer l’ensemble de ces processus.

Réduction

Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages sera ainsi : carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. Nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée de solution saline stérile. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Certains animaux de cette DAP auront un suivi chronique de leur poids, leur prise alimentaire et leur composition corporelle ainsi que le suivi de la prise alimentaire suite à certaines procédures chirurgicales (enzyme dégradant la matrice ou virus permettant le désassemblage de la matrice) nécessitera que les animaux soient placés en cage individuelle. ¬6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris. La souris représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales. Afin de permettre le suivi individuel du poids et de la prise alimentaire, uniquement quand cela sera nécessaire, les souris seront placées en cage individuelle. Ces cages vont être rapprocher le plus possible pour permettre au mieux à l’animal d’avoir une interaction visuelle, auditive et olfactive.

37 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux opérations du cerveau de deux à trois heures, pour une partie d'entre elles une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie qui permet de prélever le cerveau. L'objet déclaré est de cartographier les réseaux nerveux responsables de la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, sans application clinique annoncée à court terme. Le porteur reconnaît que les organoïdes, les cultures sur puces et la modélisation informatique se développent, mais conclut qu'ils ne constituent "pas encore d'alternatives crédibles", et qualifie d'"indispensable" l'isolement des souris en barils individuels pendant une dizaine de jours.

Objectifs

Le sommeil paradoxal est commun à tous les mammifères incluant les humains. Il se caractérise par une forte activité cérébrale semblable à celle de l’éveil mais paradoxalement associées à une paralysie musculaire, expliquant notre immobilité pendant la nuit. De récentes recherches expérimentales chez le rongeur ont identifié les mécanismes nerveux qui conduisent à cette paralysie réversible de nos muscles. Des atteintes neurodégénératives peuvent cibler ces réseaux de neurones provoquant alors une maladie, le trouble comportemental en SP, qui est un signe diagnostic précoce de la maladie de Parkinson ou la maladie à corps de Lewy. Chez ces patients endormis, les muscles ne sont plus paralysés favorisant la survenue de mouvements violents et incontrôlés qui reflèteraient le contenu de nos rêves. En revanche, nous ne savons toujours pas comment et où dans notre cerveau ce sommeil particulier est généré. Ce projet a pour ambition de progresser sur ces questions d’apparence fondamentale mais qui sont un prérequis pour comprendre ses fonctions physiologiques et cognitives, et ses dysfonctionnements dans de pathologies neurologiques assez fréquente comme le trouble comportemental en SP, la narcolepsie, le syndrome des jambes sans repos ou les apnées/ronflements du sommeil. Dans ce contexte, notre stratégie expérimentale repose sur la spécificité fonctionnelle dorénavant solidement établie des mécanismes nerveux impliqués dans la paralysie et l’utilisation de nouveaux outils génétiques, moléculaires et viraux pour circonscrire chez la souris la(s) parties du cerveau activée(s) pendant le SP et capable(s) de controler la paralysie musculaire. La description fine de ce substrat anatomique et fonctionnel devrait ouvrir des champs d’investigations nouveaux dans le domaine de la physiologie du SP et de ses pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à renforcer les connaissances sur les réseaux neuronaux et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à l’apparition et la régulation du SP. A ce jour, beaucoup de structures ont été identifiées comme pouvant moduler les différents paramètres du SP mais aucun réseau permettant de faire le lien entre elles n’a solidement été décrit. Nous avons précédemment confirmé que la voie SLD vers vmM génère l’atonie musculaire spécifique à l’état de SP chez la souris. Il reste à utiliser cette porte d’entrée préférentielle et solide vers les réseaux du SP. Ainsi, ce projet vise à identifier les structures projetant sur la voie SLD vers vmM tout en confirmant leur implication dans l’état de SP. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes pour comprendre comment le SP est généré par le cerveau, un prérequis à l’étude de ses diverses fonctions vitales.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie de 2h à 3h selon la procédure - Période de récupération post-opératoire de durée variable selon la procédure - Protocole de privation/rebond de sommeil paradoxal de 48h pour la procédure 3 précédant mise à mort - Perfusion intracardiaque sous anesthésie en fin de procédure avec prélèvement de biopsies

Impact sur les animaux

Les procédures sont classifiées de sévérité modérée. Selon la procédure, les souris subiront une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie, d’une durée variant de 2 à 3h. Ces interventions entrainent une douleur modérée, traitée efficacement par administrations médicamenteuses adaptées avant, pendant et après l’intervention chirurgicale. Pour les enregistrements du sommeil, les souris devront être isolées en barils individuels jusqu’à la fin de la procédure. Nous n’attendons pas de dérèglement du cycle veille-sommeil grâce à la période d’habituation à l’isolement social en barils individuels. Cependant, nous serons vigilants pour détecter d’éventuels signes de mal-être liés aux procédures.

Devenir

Tous les animaux subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie.

Remplacement

Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille- sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche, le vers ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies invalidantes qui l’affectent comme les apnées du sommeil, le ronflement, le trouble comportmeental en SP ou la narcolepsie. Par ailleurs, la dissection fine des réseaux neuronaux et de mécanismes complexes ne peut être abordée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale). La compréhension de mécanismes neurobiologiques à l’échelle cellulaire et moléculaire nécessite la mise en place de techniques invasives, inapplicables pour l’heure chez l’homme.

Réduction

La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Notre estimation porte sur un besoin de 37 souris réparties en 3 procédures expérimentales. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a ete calculée et optimisée sur la base de nos propres études récentes chez la souris. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de chaque procédure expérimentale et la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, mais aussi la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel et favoriser aussi longtemps que possible les interactions sociales, les souris dès réception seront hébergées par paire en cage conventionnelle ainsi que pendant les procédures quand cela est techniquement possible. Des enrichissements environnementaux seront mis en place systématiquement pour la durée des procédures pour entretenir leur bien-être. Les conditions d’hébergement, les soins post-chirurgies et les différentes étapes expérimentales seront contrôlés pour réduire le risque de détresse. Pour la partie physiologique du projet, les animaux seront hébergés en baril individuel pour une dizaine de jours seulement. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) seront fournis pour la fabrication du nid et limiter l’anxiété générée par cet isolement social indispensable. Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant les procédures, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance

Choix des espèces

Il s’agira de souris sauvages, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale et fonctionnelle avec un cycle veille-sommeil stabilisé et consolidé. La souris a été largement utilisée dans la recherche sur le SP et constitue le modèle mammifère le plus adapté pour l’utilisation d’outils moléculaires, génétiques et cellulaires prévus pour ce projet. Ainsi, la compréhension des mécanismes régulant le SP à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques invasives encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Le SP est une caractéristique commune aux mammifères, incluant l’homme. Les modèles animaux alternatifs plus simples que la souris (mouche, poisson zèbre) parfois utilisés sont dépourvus de SP et ne sont donc pas pertinents pour comprendre le sommeil, ses fonctions et les pathologies qui l’affectent chez l’homme.

Cinquante molécules par an, deux cent cinquante sur la durée du projet, envoyées par des clients : 4 000 rongeurs, 2 500 souris et 1 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse, subissent des prélèvements sanguins à la queue ou en submandibulaire, et une ponction de liquide céphalorachidien. Tous sont tués pour découper leur cerveau en tranches et y enregistrer l'activité électrique. Le porteur qualifie ce travail de projet scientifique mené sur sa plateforme, alors que les composés, leur toxicité évaluée en amont et le calendrier des tests relèvent de ses clients.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives liées au vieillissement ou à des troubles spécifiques, constituent un enjeu majeur de santé publique. Ce projet scientifique, réalisé sur notre plateforme d'électrophysiologie, vise à étudier l'efficacité de composés en développement sur l'activité neuronale, grâce à la technique d'électrophysiologie ex vivo sur coupes cérébrales de rongeurs sains. Ce projet servira de base pour le développement futur de stratégies thérapeutiques, dans les modèles pathologiques spécifiques associés et qui seront décrits dans un autre projet. Pour cela, nous analysons les effets de ces composés sur les mécanismes neuronaux fondamentaux à travers des expériences réalisées sur des rongeurs sauvages. Nos études seront réalisées soit sur la souris soit le rat selon la pathologie étudiée et la disponibilité des modèles animaux de la pathologie. Ces modèles offrent une base physiologique robuste, essentielle pour comprendre les processus fondamentaux dans un système neuronal non altéré. Les différentes structures cérébrales seront étudiées pour étudier la mémoire, la régulation émotionnelle, les circuits de récompense, pour analyser la coordination motrice et les interactions sensorimotrices, pour évaluer les fonctions motrices et certaines dimensions cognitives. Les composés sont administrés par voie orale ou parentérale selon des protocoles adaptés, avec des effets mesurés après des périodes d’exposition définies. Ce projet a pour but de fournir des données fondamentales pour orienter le développement de thérapies innovantes. On estime à 50 le nombre de molécules testées par an soit 250 pour la durée du projet.

Bénéfices attendus

En complément des recherches menées par nos clients, cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces composés et de contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies neurodégénératives. Les résultats obtenus serviront de base pour la mise en place de stratégies thérapeutiques futures, qui seront approfondies à travers des études spécifiques sur des modèles pathologiques.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, Sur animaux sous anesthésie et sous antalgie : prélèvements sanguins 5 secondes. prélèvements liquide céphalo rachidien 20 secondes, chirurgie terminale sans réveil 1 minute.

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les procédures uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont par nos clients, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. L’administration par gavage peut entraîner une gêne légère à modérée (gavage chronique), transitoire, due à la contention et à l’introduction de la sonde. Les produits administrés par cette voie peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire. L’injection sous-cutanée entraîne une douleur légère et brève, due à la piqûre et au produit injecté. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré. L’injection intrapéritonéale provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. L’injection dans la veine caudale induit une douleur légère au moment de la piqûre et un stress bref lié à l’immobilisation. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin à la veine caudale entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Le prélèvement submandibulaire provoque une douleur légère à modérée de courte durée en raison de la ponction. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire ainsi que celui du liquide céphalorachidien sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée sur des coupes cérébrales de rongeurs à l’aide de techniques d’électrophysiologie. Ces préparations ex vivo conservent certaines propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux, permettant d’étudier l’activité synaptique et la dynamique des réseaux à une échelle locale. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, permettant d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions au sein d’un réseau neuronal fonctionnel, ce qui justifie le recours aux coupes cérébrales ex vivo pour approfondir ces analyses dans un cadre plus proche de la physiologie neuronale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies d’éléments tels que des bûchettes de bois à grignoter, de la frisure papier, et des carrés de coton. Des tunnels en carton seront fournis pour les rats, tandis que des dômes transparents rouges seront utilisés pour les souris afin de faciliter les transferts entre cages tout en réduisant le stress. Des interactions quotidiennes avec les humains, combinées à une transition progressive de la lumière, amélioreront encore leurs conditions d’hébergement. Après chaque intervention technique, les réactions seront étroitement surveillées afin de minimiser toute souffrance animale. En cas de détérioration de leur état général, une surveillance renforcée sera mise en place, avec des soins appropriés prodigués en concertation avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les points limites établis pour le projet seront scrupuleusement respectés pour détecter et traiter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Les animaux seront pesés au moins une fois par semaine après l’acclimatation et avant le début des traitements. En cas de traitements répétés et consécutifs, des pesées 2 fois par semaine permettront d’ajuster précisément les volumes administrés. Les animaux seront toujours sous anesthésie générale / analgésie pour les procédures le nécessitant.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, deux modèles largement utilisés en neurosciences pour l’étude des mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain. Ces similitudes en font des modèles de choix pour étudier les bases du fonctionnement normal du cerveau et les processus qui peuvent être perturbés dans les maladies neurodégénératives. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 4 semaines, (groupe de référence) correspondant au stade adolescent chez l'humain, jusqu'à 95 semaines, afin de couvrir toute la gamme des âges, du stade jeune (adolescent) à l'adulte âgé.

Opérés du cerveau sous anesthésie générale pendant une heure à une heure trente, 350 rats enchaînent ensuite jusqu'à douze semaines d'entraînement, cinq jours sur sept, sous restriction alimentaire maintenue à 90 ou 95 % de leur poids de forme pour garantir leur motivation à obtenir une récompense. Tous sont tués à l'issue pour analyse des cerveaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce que cette étude servira surtout de pilote afin de cibler les régions cérébrales visées lors de "procédures plus lourdes et invasives" prévues ensuite. La tâche imposée aux rats n'est jamais décrite, désignée seulement comme un changement de règle spatiotemporelle et une tâche comportementale que le porteur juge non stressante en soi.

Objectifs

L’objectif général du projet est de déterminer les réseaux neuronaux mis en jeu lors d’une adaptation comportementale suite à des changements de règles spatiotemporelles. L’objectif premier est d’évaluer, par imagerie moléculaire, l’implication d’un réseau entre deux zones du cortex. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces régions cérébrales dans la flexibilité comportementale, mais elle servira également de pilote pour pouvoir cibler précisément les régions cérébrales impliquées lors de procédures plus lourdes et invasives qui auront lieu dans une prochaine étude.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux et de flexibilité cognitive ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).

Procédures

Dans ce projet, tous les rats subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée ~1h-1h30) pour une injection dans le cerveau et un entraînement comportemental, qui nécessite un apport de nourriture contrôlé pour une durée maximale de 12 semaines, à raison d'une séance d'au maximum 1h, à un rythme d'au minimum 5 jours sur 7.

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Le poids de l’animal est vérifié régulièrement et ne doit pas descendre en-dessous de 90-95% de son poids de forme théorique pour plus de deux jours consécutifs. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’injection cérébrale de composés est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise incorporation du traceur). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique classique dans le domaine sera utilisée.

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés au moins 2-3 jours avant la chirurgie, afin de les habituer à l’expérimentateur. Pour la procédure chirurgicale initiale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes, selon une grille de score et de suivi post-opératoire. Concernant la perfusion intracardiaque, nous utilisons une overdose d’euthanasiant et vérifions que les réflexes sont abolis avant de procéder à l’incision de la cage thoracique. En pilote, nous tentons une technique de raffinement (ajout d’un anesthésiant à l’euthanasiant, qui peut être douloureux au point d’injection) et vérifierons qu’elle ne compromet pas les résultats immunohistochimiques. Cette méthode pourra ensuite être généralisée. En pilote également, dans l'optique d'une future DAP avec des procédures plus invasives, nous évaluerons l'utilisation d'un équipement comportemental plus adapté pour des animaux porteurs d'implants cérébraux. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont en effet largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car ils sont grégaires, intelligents et présentent de nombreuses capacités comportementales similaires aux sujets humains. De plus, la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, âge auquel les structures cérébrales sont matures.

Mis en reproduction une nuit, puis soumis à un frottis vaginal sans anesthésie pour dater la gestation, 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des femelles gestantes passent les vingt-deux jours de gestation sous régime pauvre en protéines, avec inactivité et perte de poids attendues. Au seizième jour, chacune subit une laparotomie pour une électroporation in utero de quarante minutes, dont le réveil peut être suivi de douleurs pendant deux à trois jours. Les nouveau-nés sont maintenus en vie jusqu'au prélèvement de leurs tissus à trois, huit ou trente jours. Les mères et les petits surnuméraires sont proposés en interne pour un autre projet avant d'être tués.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minutes à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative. Des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. Les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins à partir desquelles le projet s’est inspiré. Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour deux stades dedévelopement. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.

357 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de virus destinée à tracer les réseaux de neurones, puis est tué quatre jours plus tard. Juste avant, 150 mâles et 72 femelles passent un test de trente minutes : réflexe de dorsiflexion du pénis, stimulation électrique du pénis, stimulation vibratoire, stimulation mécanique des parties génitales ou injection d'une molécule provoquant une érection. Le porteur décrit la stimulation électrique du pénis comme sans douleur, retient l'irritation parmi les atteintes possibles, et affirme que l'étude de la fonction sexuelle exige un "organisme entier" faute de toute modélisation existante.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastro-intestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathophysiologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes neuronaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection de virus et seront perfusés 4 jours suivant l'injection (temps de chirurgie : 30 minutes max). 90 mâles seront testés pour l'érection juste avant perfusion : 30 seront testés pour le réflexe de dorsiflexion du pénis (réflexe qui évalue la fonction sexuelle, 30 min max), 30 seront testés pour la stimulation électrique du pénis (30 min max), et 30 seront testés pour les injections d’un composé qui induit une érection (30 min max). 60 mâles seront testés pour l'éjaculation juste avant perfusion : 30 seront testés pour l'injection d’une molécule connue pour induire une érection (30 min), et 30 seront testés pour la stimulation vibratoire (30 min max). 24 femelles seront testées pour l'érection (engorgement du clitoris) par injection d'une molécule qui provoque une érection (30 min) et 24 seront testées pour l'érection par injection d’une autre molécule qui agit différemment mais a les mêmes effets (30 min max) juste avant perfusion. 24 femelles seront testées pour l'éjaculation par stimulation mécanique génitale (30 min max) juste avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales (injections de virus) peuvent conduire à de légères douleurs. L’infection au niveau des sutures est rare mais possible. L’utilisation de l’isoflurane peut induire des anomalies cardiovasculaires et respiratoires qui seront monitorés visuellement lors des chirurgies. Les injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés sont décrits dans la littérature pour ne pas induire d’effets délétères aux doses choisies. La contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal. Enfin, la stimulation électrique du pénis est sans douleur, les paramètres de stimulation proviennent de la bibliographie. Cependant, une irritation du pénis est possible. Pour la stimulation mécanique des parties génitales de la femelle, une irritation au niveau de la stimulation est également possible.

Devenir

L'expérience que nous réalisons avec le virus nous permet de tracer les réseaux de neurones impliqués dans la fonction sexuelle. Afin de visualiser ces réseaux nous avons besoin d'euthanasier les animaux pour récupérer les tissus d'intérêt.

Remplacement

La fonction sexuelle est possible grâce à l’interaction de multiples systèmes : hormonal, sensoriel, nerveux. L’étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, Il n’existe pas de modélisation de ce système qui permettrait d'étudier les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle. S’agissant d’un nouveau projet, nous avons besoin d’apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. Nous réaliserons les premières mises au point de chirurgies sur cadavre : notamment repérer et disséquer les structures d'intérêt. Concernant la mise au point des injections de virus, nous avons besoin d'animaux vivants pour faire migrer le virus et visualiser les réseaux tracés dans les tissus d'intérêt après euthanasie de l'animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure a été déterminé de manière à avoir des résultats statistiquement significatifs, avec les tests adaptés, et le moins d’animaux possible. En cas de surestimation du nombre d’animaux dans une procédure, nous n’inclurons évidemment pas d’animaux supplémentaire dans la procédure.

Raffinement

Pour une pratique plus éthique, les chirurgies ont été mise au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d’autres chercheurs. Cette formation a été faite sous la tutelle de notre vétérinaire. Les premières chirurgies seront aussi faites en sa présence pour limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. De plus, nous avons prévu une analgésie pré-opératoire, ainsi qu’une analgésie post-opératoire pendant 3 jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou douleur avec un contact du vétérinaire et de la structure du bien-être de l’animal dès le lendemain ou le jour même suivant le problème rencontré. Si l’animal présente des signes de douleurs pendant plus de 48h ou sur demande du vétérinaire, les animaux concernés seront euthanasiés. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et des matériels de nidification. Pour la contention des animaux, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place avant le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologie reste malgré ses différences, proche de celle de l’humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies comme l’injection de virus et les lésions de moelle épinière, que nous réaliserons plus tard dans notre étude. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l’humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (6 à 8 semaines au début des expérimentations)