Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées :
- 235 projets autorisés en avril 2026 (01/05/2026)
- 296 projets autorisés en mai 2026 (01/06/2026)
- 340 projets autorisés en juin 2026 (01/07/2026)
Étude des fonctions des neutrophiles chez la souris au cours du sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Objectifs
Le sepsis est une pathologie grave caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée consécutive à une infection non contrôlée, responsable de plus de 11 millions de décès par an dans le monde. Malgré la mise en œuvre de recommandations internationales, les progrès médicaux et les milliards investis chaque année, le traitement du sepsis reste essentiellement symptomatique, en raison d’une compréhension encore incomplète des mécanismes impliqués. Les neutrophiles, acteurs centraux du système immunitaire, constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils ont la capacité de se déplacer rapidement vers les sites infectieux, d’ingérer les agents pathogènes et de libérer des substances toxiques pour les détruire. Plus récemment, il a été montré que les neutrophiles peuvent également produire des pièges extracellulaires constitués de leur propre ADN associé à des composés microbicides, capables de capturer et de tuer les pathogènes. Ce mécanisme est essentiel pour contrôler la propagation des infections. Lors d’un sepsis, les fonctions des neutrophiles sont profondément perturbées, ce qui contribue à l’aggravation de l’état clinique. Ils ne se développent pas correctement, se déplacent moins efficacement et produisent en excès des substances toxiques et des pièges extracellulaires. Ces mécanismes, normalement protecteurs, deviennent alors délétères : ils aggravent les lésions des organes et augmentent le risque de mortalité. La complexité du sepsis, impliquant des interactions entre cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, coagulation et organes, ne peut être reproduite fidèlement in vitro. Les modèles animaux, notamment murins, permettent de reproduire les principales caractéristiques du sepsis humain et restent nécessaires pour évaluer l’effet de candidats traitements dans un organisme vivant. Notre laboratoire a démontré le bénéfice de certains candidats thérapeutiques sur la survie et l’état clinique d’animaux septiques, souvent associé à une modulation de l’activité des neutrophiles. Nous cherchons désormais à mieux comprendre les mécanismes responsables de la dérégulation des neutrophiles au cours du sepsis et l’impact de différents candidats traitements.
Bénéfices attendus
La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis est décrite comme un phénomène aggravant les symptômes et contribuant à la sévérité de la maladie chez les patients septiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer l’effet de différents candidats traitements sur différentes fonctions des neutrophiles dans le contexte du sepsis, afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de cette pathologie.
Procédures
Une partie des animaux inclus dans cette étude pourra subir une ou plusieurs injections de molécules thérapeutiques avant la mise à mort. Les nuisances associées à ces procédures sont considérées comme légères, car elles n’entraînent que le stress lié à la manipulation des animaux et une douleur limitée à celle induite par l’introduction d’une aiguille, sans douleur persistante. Certains de ces animaux pourront également faire l’objet de prélèvements sanguins, notamment par voie rétro-orbitale. Dans ce cas, une anesthésie locale sera systématiquement mise en place, en complément de l’anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur inutile lors du prélèvement. Par ailleurs, certains animaux recevront une injection permettant de mimer une infection bactérienne, induisant des symptômes proches de ceux observés lors du sepsis humain, sur une durée maximale de 48 heures avant l’euthanasie. Ces animaux recevront un analgésique systémique permettant d’éviter toute souffrance inutile. Au cours de cette études les animaux pourront recevoir jusqu’à 2 injections (l’injection d’une solution se fait en moins de 5 min) et pourront subir jusqu’à 3 prélèvements sanguins dont un terminal juste avant l’euthanasie (le temps de manipulation des animaux pour ces prélèvements et également estimé à 5 min). Ces prélèvements seront espacés d’au moins 6 heures.
Impact sur les animaux
Une partie importante du projet sera réalisée sur des animaux sains, afin d’obtenir des neutrophiles matures et pleinement fonctionnels. Ces animaux ne seront soumis qu’aux manipulations nécessaires à l’euthanasie et, éventuellement, à une injection sous-cutanée réalisée environ deux heures avant celle-ci, dans le but d’augmenter la concentration de neutrophiles circulants. Ces interventions sont considérées comme faiblement invasives et génèrent un stress limité et transitoire. L’autre partie du projet sera effectuée sur des animaux traités par une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une molécule permettant de mimer une infection bactérienne, administrée 24 heures avant les prélèvements, afin de reproduire un état physiopathologique proche du choc septique humain. Les animaux développent certains des signes cliniques se rapprochant du sepsis humain : modification du comportement (isolement), altération de l’état général (faiblesses locomotrices), perte de poids et hypothermie. Dans l’ensemble des protocoles, les manipulations nécessaires (capture, contention, injection de molécules, prélèvements sanguins, anesthésie à l’isoflurane) sont susceptibles d’engendrer un stress temporaire pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure
Remplacement
La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis résulte d’une dérégulation systémique du système immunitaire. Par exemple, la molécule, que nous utilisons pour induire un choc endotoxinique chez les animaux, provoque in vivo une augmentation significative de la production de pièges extracellulaires, alors que cette même molécule n’en induit aucun mesurable in vitro. Ces dysfonctions résultent de mécanismes complexes, dépendant de l’activation simultanée de multiples populations cellulaires immunitaires et non immunitaires, et demeure difficile à reproduire fidèlement in vitro. Le remplacement des neutrophiles primaires par des lignées cellulaires n’est pas envisageable dans ce contexte. Bien que certaines lignées myéloïdes différenciées présentent des similarités avec les neutrophiles, elles demeurent imparfaites, ne reproduisant pas de manière fiable le comportement de neutrophiles primaires dans l’organisme. L’utilisation de neutrophiles primaires isolés à partir d’animaux reste donc nécessaire pour évaluer l’effet des traitements dans un contexte physiopathologique pertinent.
Réduction
Pour les études in vitro, la collecte d’un nombre suffisant de neutrophiles nécessite l’utilisation de plusieurs animaux, car la proportion de neutrophiles circulants chez la souris est naturellement faible, ce qui limite la quantité de cellules obtenues pour les différentes conditions expérimentales. Afin de pallier cette contrainte, nous avons récemment mis en place, sur la base de données issues de la littérature, un prétraitement des animaux par une molécule mobilisant les neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang périphérique en quelques heures. Ce prétraitement, consistant en une unique injection par voie sous-cutanée, permet d’augmenter significativement le nombre de neutrophiles récupérés et ainsi de réduire de manière importante le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux utilisés a été défini à partir des résultats préliminaires déjà obtenus au sein du laboratoire, où la dérégulation des neutrophiles est de plus en plus étudiée. Cette approche permettra d’éviter les répétitions inutiles et de limiter le nombre d’animaux aux effectifs strictement nécessaires à la validation statistique des résultats . Parallèlement, les organes et tissus prélevés sur les animaux sains ou septiques seront mutualisés et utilisés pour d’autres projets en cours au sein du laboratoire, afin d’optimiser l’utilisation de chaque individu et éviter toute expérimentation redondante.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des animaux et ce afin de déceler tout excès de douleur, ce qui introduirait un biais dans nos recherches. Plus particulièrement chez les animaux septiques, le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres standardisés suivants, afin de déterminer un score global sur 20 (chaque paramètre étant noté de 0 à 4) : le suivi de l’état physique, du comportement et des sécrétions seront réalisées par un examen visuel. Cette surveillance commencera dès 6h suivant l’induction du modèle de sepsis et sera renouvelé à 16h puis toutes les 8h. Le suivi du poids de l’animal sera réalisé à l’aide d’une balance et le suivi de la température sera réalisée à l’aide d’un thermomètre rectal pour souris. Les animaux ne devront pas atteindre un score global≥17 pour les paramètres standardisés. Ce score est prédictif d’un risque de décès élevé sous 4 heures et de dysfonctions d’organes généralisées. Ces critères seront résumés sous forme d’un tableau et ont été définis à partir des données de la littérature. Les animaux seront placés dans une armoire ventilée dont la pression et la température sont contrôlables. Les animaux septiques étant hypothermiques, la température de l’armoire sera augmentée de 3 degrés par rapport à la température standard de l’animalerie, afin de facilité la régulation de la température de ces animaux (les animaux contrôles seront hébergés dans les mêmes conditions). Ils auront un accès constant à l’eau, à la nourriture, au matériel pour leur nid et à des activités de jeu. Aucun rongeur ne sera seul, sauf en cas d’agressivité ou de soins particuliers. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anésthésie générale à l’isoflurane pour la voie intracardique et sous anesthésie générale à l’isoflurane avec l’addition 2 minutes avant le prélèvement d’un collyre anésthésique en locale au niveau de l’œil.
Choix des espèces
L’étude du sepsis, à travers l’utilisation de souris comme modèle animal, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Utiliser la souris facilitera la mise en perspective de nos résultats. Un large éventail de techniques sont adaptées au modèle souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. Les souris auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation, soit l’âge de leur maturité sexuelle (naissance > 1 mois). Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi de travailler avec des souris mâles, afin de nous affranchir du cycle oestrien des femelles, qui peut induire de la variabilité dans nos résultats et modifier notre interprétation.
Caractérisation des atteintes neuromusculaires spinales dans des modèles murins de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave provoquée par une réponse excessive de l’organisme à une infection. Il peut entraîner des atteintes de plusieurs organes, mais aussi une faiblesse musculaire importante. Cette faiblesse gêne la récupération des patients, mais ses causes restent encore mal connues. Dans notre laboratoire, nous avons observé, chez la souris, que deux modèles expérimentaux de sepsis entraînent des troubles neuromusculaires associés à la présence de structures inflammatoires appelées « pièges extracellulaires » dans la moelle épinière. Ces structures pourraient participer aux anomalies observées, mais leur rôle exact reste à préciser. L’objectif de ce projet est d’étudier plus précisément les cellules nerveuses de la moelle épinière qui commandent un muscle de la patte arrière, le muscle gastrocnémien et de mieux comprendre comment le sepsis altère la commande nerveuse des muscles et quel rôle jouent les pièges extracellulaires dans ces atteintes.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette faiblesse musculaire, en particulier au niveau des cellules nerveuses qui commandent les muscles. L’étude portera plus précisément sur les neurones qui contrôlent le muscle gastrocnémien, situé dans la patte arrière. La comparaison entre deux modèles de sepsis chez la souris permettra de déterminer ce qui est commun aux deux situations et ce qui leur est propre. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou réduire les complications neuromusculaires du sepsis et ainsi améliorer la récupération des patients.
Procédures
Une partie des animaux subiront une chirurgie (chirurgie durant environ 15 min) consistant en une incision de la peau d’une des pattes arrière afin d’injecter le muscle gastrocnémien avec un traceur permettant d’identifier les motoneurones de la moelle épinière qui innervent ce muscle. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une injection d’un composé permettant d’induire une inflammation systémique (durée pour réalser l’injection : 2 minutes). Une autre partie des animaux recevront la même chirurgie d’injection de traceur dans le muscle gastrocnémien. Ils recevront ensuite 3 jours à une semaine plus tard une deuxième chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 20 minutes), permettant de créer le modèle de choc septique, afin de mimer la pathologie humaine. Juste avant la fin de l’expérience, une mesure fonctionnelle musculaire terminale non-invasive sera également réalisée pour évaluer la réponse neuromusculaire du muscle (évaluation durant environ 20 minutes)
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir des effets passagers liés aux différentes étapes de l’étude. L’injection du traceur dans le muscle de la patte arrière nécessitera une petite intervention réalisée sous anesthésie. Elle pourra entraîner une gêne temporaire, une légère douleur après le réveil et un petit inconfort pour se déplacer pendant un court moment. Les modèles de sepsis utilisés dans cette étude pourront aussi provoquer une dégradation transitoire de l’état général des animaux. Ceux-ci pourront être moins actifs, perdre un peu de poids, se déplacer plus difficilement et présenter une baisse de température. Dans le modèle le plus sévère, qui nécessite une chirurgie abdominale, ces effets pourront être plus marqués et s’accompagner d’une douleur post-opératoire supplémentaire. Les animaux des groupes témoins pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à l’injection ou à la chirurgie contrôle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier en même temps les effets du sepsis sur l’inflammation, la moelle épinière, les cellules nerveuses qui commandent les muscles et le fonctionnement musculaire lui-même. Des méthodes réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité de ces phénomènes dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour comprendre comment ces différents mécanismes interagissent au cours du sepsis.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Le projet a été conçu à partir de l’expérience déjà acquise par le laboratoire avec ces modèles de sepsis et en tenant compte des analyses prévues en fin d’étude. Seuls quatre groupes seront étudiés, avec pour 2 groupes expérimentaux et leur groupe témoin respectivement, afin de répondre à la question posée en utilisant le moins d’animaux possible.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. L’injection du traceur dans le muscle sera réalisée sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur. Les interventions seront menées dans de bonnes conditions d’hygiène, avec du matériel approprié, afin de réduire au maximum l’inconfort et les effets liés au geste. Après chaque procédure, les animaux seront surveillés attentivement après chaque expérimentation jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés. Les animaux soumis aux modèles de sepsis bénéficieront d’un suivi renforcé. La chirurgie utilisée pour le modèle le plus invasif sera également réalisée sous anesthésie, avec prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel formé, afin de réduire autant que possible la douleur, le stress et la durée des manipulations.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est une espèce couramment utilisée en recherche biomédicale, bien connue et bien adaptée à ce type d’étude. Elle permet de travailler dans des conditions standardisées, ce qui aide à obtenir des résultats fiables et comparables. Sa petite taille et son cycle de vie court facilitent également le suivi des animaux dans de bonnes conditions. Cette espèce est particulièrement utile pour étudier les effets du sepsis sur les muscles, les nerfs et la moelle épinière. Les modèles utilisés dans ce projet sont déjà bien décrits chez la souris, ce qui permet de mieux interpréter les résultats et de les comparer à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques nécessaires ici, comme l’injection d’un traceur dans le muscle et l’analyse de la moelle épinière en fin d’étude. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés de 8 à 12 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance ou au vieillissement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi de se rapprocher davantage de la situation étudiée chez l’adulte humain.
Effet protecteur des HDL dans un modèle de sepsis chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
Objectifs
Le sepsis est défini comme la réponse systémique à l’agression de micro-organismes et/ou toxines correspondant à un syndrome clinique complexe de réponse de l’hôte à l’infection. Il est caractérisé par l’activation de la réponse immunitaire qui est responsable de dommages endothéliaux et de dysfonctions d’organes impliquant divers médiateurs de l’inflammation tels que les cytokines, les polynucléaires neutrophiles, les prostaglandines, les leucotriènes, les espèces radicalaires de l’oxygène ou encore le monoxyde d’azote. Les HDL sont une association d’apolipoprotéines, majoritairement l’ApoA1 avec des phospholipides et leur principale fonction est le transport inverse du cholestérol, c’est-à-dire des organes vers le foie. De nombreuses études ont largement décrit une relation inverse entre taux de HDL chez l’homme et l’incidence d’évènements cardiovasculaires tels que le syndrome coronarien ou l’accident vasculaire cérébral, leur conférant ainsi un statut de protecteur cardiovasculaire. En plus de ces propriétés majeures, des études plus récentes ont révélé des effets anti-inflammatoires, anti-apoptotiques, anti-thrombotiques et anti-oxydants des HDL. Au cours du sepsis, plusieurs études fondamentales ou cliniques se sont intéressées à l’interaction entre HDL et les acteurs mis en jeu au cours du sepsis. Par exemple, certains auteurs ont démontré que les HDL ont la capacité de neutraliser le LPS (LipoPolySaccharide) qui est incriminé dans le développement du choc septique. Certains auteurs ont également montré que des peptides mimétiques de l’apoA1 pouvaient prévenir la dysfonction vasculaire et augmenter la survie dans un modèle de choc septique chez le rat. Une étude chez l’homme et chez le cochon a montrée la capacité des nanoparticules HDL mimétiques les CER001®, à réduire l’orage cytokinique associés au sepsis. Cette diminution des taux de cytokines pro-inflammatoire était conjointe à une augmentation de l’élimination du LPS vers la bile ainsi qu’un meilleur taux de survie.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un fort potentiel dans la compréhension des mécanismes protecteurs des nanoparticules HDL mimétiques (CER001®) dans le sepsis, d’un point de vue fondamentale : explorer l’impact du sepsis sur la modification des lipoprotéines endogènes, et comprendre comment interviennent les CER001® sur ces modifications. D’un point de vue thérapeutiques elle pourrait fournir des éléments menant à des piste d’amélioration de ces nanoparticules.
Procédures
Toutes les souris subiront toutes une laparatomie, un prélèvement sanguin et seront mise à mort. Les souris des groupes contrôle et traitement subiront en plus la ligature et une ponction du caecum en plus, et développeront un choc spetique avec tous les symptômes associés. La mise à mort interviendra 24h après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les souris vont subir le protocole CLP qui consiste dans un premier temp en une laparotomie ainsi qu’une ligature et perforation du caecum, ce qui va engendrer une péritonite et tous symptômes caractéristiques d’un choc septique, un état fébrile, une sensation de malaise, de la fièvre, des confusions, des frissons, une hyperventilation, une augmentation du rythme cardiaque etc. Les souris recevront ensuite une injection de CER001® en intraveineuse dans la veine caudale.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort. Les organes, le sang et la bile des souris seront prélévé pour analyses. De l'immunohistofluorescence est prévue sur des coupes d'organes à la recheche des HDL endogènes ainsi que les HDL recombinantes, et des dosages des oxylipines seront réalisé dans le sang et la bile. La mise à mort des animaux est alors nécessaire y compris pour les groupe sham et contrôle.
Remplacement
Le sepsis est un syndrome aigu complexe impliquant tous les organes qu’il est impossible de modéliser in vitro. Il existe plusieurs modèles de sepsis expérimentaux. Néanmoins, le modèle de CLP est un modèle de péritonite dont la physiopathologie se rapproche le plus de celui de l’homme. En effet, ce modèle respecte un certain nombre de conditions similaires à celles chez l’homme, à savoir le timing entre la perforation et la survenue d’un tableau de sepsis ; le caractère pluri-microbien de l’infection à des concentrations élévées et la co-infection bactérienne associant des bactéries Gram négatives, positives et par d'autres organismes tels que les levures. (Rittirsch et al. nature protocole. 2009)
Réduction
Le nombre total d’animaux prévu est de 65 souris C57BL/6J mâle et femelle. Ce chiffre correspond au nombre maximal et a été défini de manière à garantir la robustesse statistique tout en limitant l’utilisation au strict nécessaire. - Souris groupe SHAM + sérum physiologique= les souris vont subir une laparotomie puis seront refermée (n=20, 10 mâles et 10 femelles) nous voulons évaluer la réponse inflammatoire induites par le sepsis, notamment la composante lipidique, il est nécessaire d'être capable de discriminer la petite inflammation induite par la chirurgie de celle induite par la mise en place du sepsis, ce groupe sham fera office de contrôle négatif. - Souris groupe sepsis + sérum physiologique = groupe contrôle : les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de sérum physiologique (n=20, 10 mâles et 10 femelles). - Souris groupe sepsis + HDL recombinantes = les souris subissent une CLP puis une injection intra-veineuse de HDL recombinantes (n=20, 10 mâles et 10 femelles). Nous utiliserons 5 souris pour entraînement sur le modèle CLP. Un calcul d’effectif a été réalisé pour une comparaison entre deux groupes indépendants par test t bilatéral, avec un seuil α de 0,05 et une puissance de 80 %. En considérant une variabilité attendue de 25 % du critère principal, un effectif de 20 animaux par groupe permet de détecter une différence minimale d’environ 22 % entre les groupes. Cet effectif a donc été retenu pour mettre en évidence un effet biologiquement pertinent tout en limitant l’utilisation d’animaux. Ce nombre a déjà été utilisé dans d'autres études antérieur (Reconstituted High-density Lipoprotein Therapy Improves Survival in Mouse Models of Sepsis) Tanaka et al.
Raffinement
La semaine avant la chirurgie les animaux seront habitués aux conditions expérimentales et à la pièce d'expérimentation afin de diminuer le stress. Dès le début de l’acte chirurgical, l’administration d’un analgésique permettra de prévenir la douleur per et post-opératoire et de faciliter le réveil. Les animaux seront placés dans des cages individuelles sur des plateaux chauffants en post chirurgie. Pendant l’heure qui suit la chirurgie, l’animal sera observé : son comportement, son activité (s’il est isolé, passif), sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), les mouvements qu’il effectue. En cas de signe de souffrance nous augmenterons la dose d’analgésique. Si le traitement ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans ce modèle de sepsis expérimental. La petite taille des souris permet l’injection de quantités limitées de produits thérapeutiques. Des souris C57BL/6J adultes de 10 semaines seront utilisées, pesant environ 25-30 grammes. La CLP est une procédure de classe sévère et il est nécessaire que les souris soit adulte mais pas trop âgées pour pouvoir supporter la chirurgie.
Rôle des macrophages tissulaires dans l’altération de la réparation des organes après un sepsis
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Objectifs
Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le coeur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.
Bénéfices attendus
La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre, à court terme, un meilleur suivi de ces patients, et de dégager de nouvelles thérapeutiques à plus ou moins long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intra-péritonéales et sous-cutanées) pour générer l’état de sepsis et faire varier la réponse inflammatoire au cours des 14 premiers jours de la procédure. Ces injections sont peu douloureuses et sont réalisées en quelques minutes. Une chirurgie quelques jours plus tard permettra la pose sous cutanée d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie en début de procédure, avant la chirurgie et au moment de la mise à mort de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle non invasive sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant le début de la procédure pour habituer l’animal, puis au moment de la chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la chirurgie (9 fois 10 minutes). Pour les animaux élevés au sein de l'établissement, une biopsie de queue est réalisée dans les premiers jours de vie (10 à 15 jours) pour nous assurer de leur conformité génétique. Ces biopsies sont réalisées en moins d’une minute par un expérimentateur qualifié.
Impact sur les animaux
L’induction d’une infection septique induit un état fébrile qui perdure plusieurs heures. Un traitement antibiotique sera administré durant les premiers jours pour limiter la fièvre. La perte de poids et une diminution de l'activité sont des complications attendues, et reviennent à la normale en quelques jours. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress pour l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure. La pose de pompe sous la peau du dos est un acte chirurgical qui comporte peu de risques pour l’animal, mais peut occasionner une gêne pour celui-ci. Pour caractériser génétiquement les animaux du projet, une biopsie unique à la queue est effectuée 10 à 15 jours après la naissance. C’est un acte peu douloureux et qui ne met pas en jeu la survie de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Afin de réduire les nuisances causées par l’induction du sepsis, une antibiothérapie sera mise en place les premiers jours. La chirurgie ser fera sur animal anesthésié et analgésié.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.
Rôle de la Protéine de Transfert des Phospholipides et de la Protéine de Transfert des Esters de Cholestérol dans la biodistribution des lipoprotéines dans des modèles murins de sepsis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Objectifs
La septicémie, ou sepsis, est une complication grave d’une infection. Elle survient lorsque la réponse de notre organisme face à une infection devient excessive et incontrôlée, entraînant des lésions sur différents organes. C’est un véritable problème de santé publique : en 2017, on estime qu’elle a été responsable d’environ 11 millions de décès dans le monde, soit près d’un cinquième de la mortalité annuelle. Malgré les progrès de la médecine, le sepsis reste l’une des principales causes de décès en soins intensifs. Une des clés de cette maladie est la présence dans le sang de substances issues de certaines bactéries, appelées lipopolysaccharides (LPS). Ces molécules, très inflammatoires, déclenchent une réaction de défense généralisée de l’organisme. Heureusement, notre corps possède aussi des systèmes de protection qui permettent de neutraliser et d’éliminer ces LPS. Les lipoprotéines, particules qui transportent les graisses dans le sang, jouent un rôle central dans ce processus : elles captent les LPS, réduisent leur toxicité et les transportent jusqu’au foie où ils peuvent être éliminés. Certaines protéines associées aux lipoprotéines, comme la PLTP (protéine de transfert des phospholipides) et la CETP (protéine de transfert des esters de cholestérol), pourraient aussi influencer ce mécanisme. La PLTP, par exemple, est capable de fixer directement les LPS et d’aider à leur neutralisation. La CETP, bien connue pour son rôle dans les échanges de graisses entre les lipoprotéines, pourrait également modifier la manière dont ces particules transportent les LPS, même si son rôle exact dans le sepsis reste encore mal compris. Le but principal de notre projet est donc de comprendre comment les lipoprotéines se répartissent dans l’organisme et comment leur circulation dans le sang évolue au cours d’un sepsis expérimental chez la souris. Nous chercherons aussi à déterminer si la PLTP et la CETP influencent ce processus, et si leur rôle change lors d’une inflammation sévère.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre ce qu’il advient des lipoprotéines dans le sang et les organes au cours de la septicémie, et pourquoi leur fonctionnement est perturbé. Plus précisément, il pourrait : - Permettre de mieux comprendre les causes des perturbations observées. Déterminer si elles sont dues à une dégradation accélérée des lipoprotéines, à des fuites vers les tissus ou à une redistribution vers certains organes sous l’effet de l’inflammation. - Éclairer des observations cliniques. Expliquer pourquoi certains patients présentent, lors d’infections sévères, des modifications rapides et importantes de leur cholestérol sanguin, et en quoi cela peut aggraver la maladie. - Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques en étudiant le rôle de protéines comme la PLTP et la CETP, qui pourraient moduler la manière dont les lipoprotéines neutralisent les endotoxines, le projet pourrait mettre en évidence de nouvelles cibles pour améliorer la défense naturelle contre l’infection. - Contribuer à une vision globale du sepsis en reliant la circulation des lipoprotéines, leur distribution dans l’organisme et leur rôle dans la neutralisation des toxines bactériennes, ce projet aidera à mieux comprendre les mécanismes qui rendent la septicémie si dangereuse.
Procédures
- Prise de sang (5 prélèvements ponctuels, de moins de 1 min chacun) - Injection intraveineuse caudale (1 ou 2 selon le groupe, injection bolus,
Impact sur les animaux
De faibles douleurs, de courte durée, peuvent survenir lors des prélèvements sanguins par voie caudale ou des injections intraveineuses et intrapéritonéales. Pour les injections IV, les souris seront placées dans un tube de contention afin d’éviter les mouvements brusques, de réduire le temps de manipulation et de garantir la précision de l’injection. Cette contention peut provoquer une gêne transitoire et un stress modéré, limité à quelques minutes. - L’injection de LPS à faible dose entraine généralement des signes modérés et transitoires, comparables à un syndrome pseudo-grippal, comprenant hypothermie modérée, douleurs diffuses, inflammation locale et généralisée. - L’injection de LPS à forte dose est associée à des effets plus marqués, correspondant à un état de choc septique expérimental comprenant hypothermie profonde, douleurs diffuses, diminution importante de la mobilité pouvant limiter l’accès spontané à l’eau et à la nourriture, inflammation locale et généralisée prononcée.
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire pour l’analyse de la biodistribution des lipoprotéines au sein des différents organes. Un grand volume sanguin est nécessaire à la fin de l’expérimentation pour réaliser les cinétiques de clairance des lipoprotéines, l’analyse de l’inflammation sanguine et enfin l’analyse des lipides plasmatiques.
Remplacement
La septicémie est une maladie systémique complexe qui ne peut pas être reproduite fidèlement par des modèles cellulaires. Elle résulte d’interactions multiples entre les composants bactériens, comme le lipopolysaccharide (LPS), et l’organisme hôte. Ces interactions impliquent de nombreux acteurs : les cellules immunitaires (macrophages, neutrophiles, lymphocytes, cellules dendritiques) qui déclenchent l’inflammation, les cellules vasculaires responsables des altérations de la perméabilité, mais aussi des organes comme le foie, la rate et le tissu adipeux, essentiels pour le métabolisme lipidique et l’élimination des endotoxines. De plus, la distribution et l’élimination des lipoprotéines, vecteurs clés de neutralisation du LPS, reposent sur des mécanismes globaux (circulation sanguine, drainage lymphatique, excrétion biliaire) impossibles à reproduire in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces processus dans leur globalité. Dans ce projet, deux modèles murins complémentaires sont employés. Les souris déficientes pour la PLTP permettent d’évaluer le rôle de cette protéine dans le transfert et la neutralisation du LPS. Les souris transgéniques CETP, exprimant la protéine humaine CETP (absente naturellement chez la souris), afin de reproduire plus fidèlement la situation humaine et d’étudier son rôle dans le remodelage des lipoprotéines en contexte inflammatoire. Ces modèles sont donc essentiels pour comprendre le rôle respectif de la PLTP et de la CETP dans la biodistribution et le devenir des lipoprotéines au cours du sepsis, et pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Réduction
En raison des variations naturelles entre les animaux et des effets attendus des modifications génétiques, 7 souris par groupe seront utilisées. Ce nombre a été calculé grâce à un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires pour obtenir des résultats fiables et pouvoir comparer correctement les différences entre les groupes. Les différences attendues concernent la vitesse à laquelle les lipoprotéines sont éliminées de l’organisme.
Raffinement
Afin de favoriser le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés en groupe (5 à 10 par cage) dans un environnement enrichi (tunnels, coupelles, matériel de fouissage). Les souris recevant du LPS pouvant présenter des difficultés d’accès à l’eau et à la nourriture, une alimentation adaptée type Geldiet sera systématiquement mise à disposition afin d’assurer une hydratation et un apport nutritionnel adéquats. L’étude est limitée à une durée de 24 h après l’injection de LPS. Les animaux ne seront donc pas maintenus dans un état septique prolongé, ce qui limite le risque de souffrance importante. Les doses de LPS retenues sont basées sur la littérature et nos expériences antérieures. Elles permettent de reproduire un état de sepsis léger à sévère, tout en évitant une mortalité précoce. Les animaux seront suivis régulièrement (posture, mobilité, respiration, température corporelle). Des critères d’arrêt prédéfinis seront appliqués immédiatement en cas de signes de souffrance excessive. Les prélèvements sanguins caudaux seront réalisés après application d’un anesthésique local, via une légère incision, et le volume total prélevé n’excédera pas 3 % du poids corporel. Le prélèvement terminal par ponction intracardiaque sera effectué sous anesthésie générale (isoflurane), sur plateau chauffant pour maintenir la température corporelle. Une analgésie locale (lidocaïne) sera appliquée au point de ponction. Afin d’exclure toute douleur résiduelle, l’euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale immédiatement après le dernier prélèvement.
Choix des espèces
Le protocole vise à élucider des mécanismes complexes impliquant plusieurs tissus et types cellulaires : détoxification et clairance des endotoxines bactériennes (LPS), distribution des lipoprotéines dans l’organisme, réponse immunitaire et inflammatoire. Ces processus ne peuvent être étudiés de manière pertinente à l’aide de modèles in vitro ou d’organismes inférieurs, dont le métabolisme lipidique et le système immunitaire diffèrent trop fortement de ceux des mammifères. Le modèle murin est couramment utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude du métabolisme des lipoprotéines et des mécanismes de l’inflammation en contexte infectieux. Il offre des outils expérimentaux largement validés et une physiopathologie proche de celle de l’Homme. Toutefois, une différence majeure réside dans l’absence de CETP active chez la souris sauvage, alors que cette protéine joue un rôle clé dans le remodelage des lipoprotéines humaines. Pour pallier cette limite, des lignées transgéniques exprimant la CETP humaine sont disponibles et constituent une alternative robuste à l’expérimentation sur d’autres mammifères plus proches de l’Homme. Concernant l’âge des animaux, seuls des adultes jeunes (2 à 5 mois) seront utilisés. En effet, la réponse inflammatoire chez la souris varie fortement avec l’âge : les animaux plus âgés présentent une tolérance accrue aux endotoxines, un état d’inflammation chronique et une diminution de la production de cytokines pro-inflammatoires. L’utilisation d’animaux jeunes et d’âge homogène est donc nécessaire pour garantir la pertinence et la reproductibilité des résultats.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Caractérisation du rôle de la Vasorine dans le maintien des fonctions cardiovasculaires, de l’hémostase et implication dans le sepsis, à l’aide de trois modèles de souris Vasorine KO conditionnel
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Objectifs
La vasorine (Vasn) est une protéine impliquée dans diverses signalisations cellulaires. Une forme circulante peut se retrouver dans la circulation sanguine. La Vasn pourrait être impliquée dans des syndromes rénaux, des troubles osseux ou plus généralement des maladies cardiovasculaires. Récemment, l’utilisation de deux modèles de souris génétiquement altérés pour la vasorine a permis de mieux comprendre le rôle de la Vasn sur la fonction et la structure vasculaire. L’un des modèles permet l’extinction de l’expression de la Vasn dans l’ensemble des tissus et l’autre modèle uniquement au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires. En complément, nous renforcerons notre étude par la mise en place d'un 3e modèle Vasn dans les cellules endothéliales afin d’étudier son rôle dans la dysfonction endothéliale. Il est important de continuer à caractériser le rôle de la Vasn et sa fonction physiologique dans le système cardiovasculaire. D’autre part, des analyses sur l'expression de l'ensemble des gènes, l'expression de l'ensemble des protéines de nos modèles ainsi que l’analyse de sérum de patient en choc septique nous indiquent que la Vasn pourrait être impliquée dans le maintien de la fonction vasculaire, de la coagulation et d’empêcher ainsi la dysfonction d’autres organes au cours du sepsis. Brièvement, nous avions observé dans nos modèles des signes assimilables au syndrôme vasoplégique (baisse de la pression artérielle, de la vasoréactivité), une implication de la Vasn dans les processus de coagulation et le maintien du métabolisme . Ces divers éléments sont rencontrés dans le choc septique et nous ont conduit parallèlement à créer une cohorte clinique dont les premiers résultats semblent indiquer une modulation de synthèse de la Vasn circulante au cours de ce dernier. Nous souhaiterions étudier quels mécanismes seraient en jeu au cours de ces phénomènes dans des modèles murins de sepsis exprimant ou non la Vasn. Nos objectifs sont donc : 1-continuer d’étudier plus profondément l’impact de la délétion de la Vasn dans la physiologie cardiovasculaire; 2-d’étudier le rôle de la Vasn dans l’hémostase; 3- appliquer un choc septique aux souris afin d’y évaluer l’implication de la Vasn et le potentiel thérapeutique que pourrait représenter l’injection de la Vasn soluble après induction du sepsis.
Bénéfices attendus
Nos espérances pour ce projet sont multiples. En effet, nous souhaitons confirmer et approfondir des résultats générés à l’aide des autorisations précédentes. Nos précédents résultats ont donné plusieurs pistes qui sont désormais à l’étude (stress oxydatif, métabolisme, troubles de l’hémostase…) qui donneront à plus long terme des solutions potentielles à mettre en place en clinique humaine, dans le sepsis notamment, afin d’améliorer la survie des patients.
Procédures
Toutes les souris génétiquement altérées (402) auront une injection quotidienne d'une molécule pendant 3 jours afin d'induire la délétion de la Vasn (arrêt de la production naturelle). 80 souris auront une injection de Vasn (60 contrôles, 20 animaux génétiquement altérés) et seront euthanasiées pour prélèvement. 245 souris subiront un test de coagulation sous anesthésie générale gazeuse sans réveil (115 contrôles, 130 animaux génétiquement altérés). Pour l'induction du choc septique, 105 souris auront une injection de molécules induisant un sepsis et 105 autres souris subiront une chirurgie. Le choc septique sera d'une durée maximum de 5 jours. En dehors des souris insérées dans les volets d'étude concernant la coagulation et le sepsis, les autres souris pourraient être évaluées en échographie sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le génotypage peut engendrer du stress et une douleur le temps du geste (quelques secondes). Il est fait sur des souriceaux d'une semaine pour limiter la douleur. La mesure de pression artérielle contraint l'animal dans un tube de contention pour une durée d'environ 15 minutes. La mise en place de l'anesthésie gazeuse (pour l'échographie, l'injection de tamoxifène et l'induction du sepsis) peut générer du stress chez l'animal. Toutes les injections (tamoxifène, LPS, vasorine, anesthésiques et analgésiques) peuvent provoquer une douleur transitoire. Dans cette étude, les nuisances principales concernent les animaux dont on va provoquer le choc septique (chirurgie ou injection). Ces animaux vont développer une réponse immunitaire aigüe qui pourra conduire à une douleur et au décès de l’animal. Néanmoins, les souffrances générées par ces procédures seront contenues dans un temps restreint (maximum 5 jours).
Devenir
Tous les animaux entrés en procédure seront euthanasiés pour analyse post-mortem.
Remplacement
La sévérité et la complexité des désordres cardiovasculaires causés par la délétion de la Vasn ne sont pas encore totalement décrits et les mécanismes à la base de ces désordres ne sont pas encore clairement élucidés. La vasorine ayant un rôle très complexe et étant exprimée dans de nombreux tissus et organes, les répercussions de sa délétion sont nombreuses et restent à étudier. En conséquence, les études in silico ou in vitro ne peuvent à l’heure actuelle répondre aux questions fondamentales et l’utilisation de modèles animaux reste indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux alloués dans chaque protocole a été calculé sur la base de la variabilité interindividuelle observée dans diverses études publiées par notre équipe. Un effectif minimum de 10 à 15 animaux par groupe est nécessaire afin de rendre les données statistiquement exploitables. Nos tests statistiques comparent les différences générées entre tous les groupes d'une expérience, une sous-analyse groupe à groupe est réalisée grâce au test non paramétrique. Cependant, le design de l’étude permet dans les protocoles envisagés de cumuler plusieurs types d’évaluation sur les mêmes animaux. Pour l'étape 1, mesures de pression non-invasive, échocardiographies réalisées à divers temps après induction de la délétion de la Vasn des animaux et suite à la mise à mort en fin de protocole, une banque de sérum et de tissus sera constituée afin de pouvoir développer des projets annexes sans nécessité supplémentaire de générer de nouveaux animaux. L’incorporation des animaux selon la reproduction et le génotypage permettra de générer analyses statistiques régulières afin de limiter le nombre d’animaux par groupe lorsque la significativité sera atteinte. Pour les étapes 2 et 3, des analyses statistiques intermédiaires, lorsque les groupes auront cumulé 5 animaux chacun, permettront si les statistiques sont significatives de stopper l’inclusion de nouveaux animaux et de réduire ainsi par 2 les animaux nécessaires à ces études. De même, de nombreuses expérimentations seront réalisées sur les mêmes animaux, limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires. En fin d'étapes 2 et 3, le plasma et les organes de ces animaux nourriront la banque de prélèvements biologiques de cette étude.
Raffinement
Les animaux génétiquement altérés proviendront de notre élevage et seront incorporés dans les procédures au fil des portées. Selon les besoins, des souris contrôles proviendront d’un fournisseur. Dès lors, une période d'acclimatation de 7 jours sera mise en place à l'arrivée des souris, avant leur entrée dans le protocole. Les conditions d'élevages seront optimisées afin d'offrir aux animaux un maximum d'éléments environnementaux leur permettant de reproduire la majorité de leurs comportements naturels qu'ils soient hébergés en groupe (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en cartons pour se cacher, et des bûchettes) ou seuls (cas envisagé uniquement s’il est impossible de réintroduire l'individu dans un autre groupe). Les chirurgies seront réalisées sur des souris anesthésiées par injection anesthésiante et analgésiante. L'analgésie sera maintenue suite à l’induction du sepsis par chirurgie et pourra être renouvelé quotidiennement si l'état de l'animal le nécessite. L’état général des souris est surveillé jusqu'au sacrifice (5ème jour après l'injection) par une pesée quotidienne et la recherche de signes de souffrance (observation visuelle, de signe de fuite ou de défense à la manipulation, automutilation, posture inhabituelle). Toute perte de poids supérieure aux limites fixées entraîne le sacrifice de l’animal. Des nids végétaux seront placés pour permettre à l'animal de s'isoler s'il le désire. Les animaux montrant des signes de souffrance recevront des soins adaptés. Les animaux ayant atteint les points limites définis dans les procédures seront euthanasiés.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur un modèle de souris car c’est le modèle le plus utilisé, le plus accessible et reconnu par l’ensemble de la communauté scientifique pour la génération d’animaux génétiquement alterés. La délétion de la Vasn sera induite avec des animaux au stade adulte (dès 8 semaines) comme lors de nos études ayant obtenues les autorisations précédentes. L’objectif est de poursuivre ces études et de les mettre en lien. L'induction de la délétion pourra être faite jusqu'à 1 an de vie.
Étude de l’efficacité d’une molécule améliorant la fonction vasculaire dans des modèles de sepsis chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Objectifs
Le sepsis est une complication grave d’origine infectieuse, qui peut être mortelle malgré des traitements souvent coûteux. Il provoque une réaction inflammatoire excessive qui détériore les vaisseaux sanguins et perturbe fortement la circulation. Aujourd’hui, protéger les vaisseaux est devenu une priorité pour mieux soigner cette maladie. Des chercheurs ont identifié une nouvelle molécule capable de renforcer les vaisseaux sanguins. Cette étude vise à évaluer l'efficacité de cette molécule à améliorer la prise en charge du sepsis, et à déterminer dans quelles conditions elle serait la plus bénéfique, seule ou en association avec des antibiotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la preuve de concept de l’efficacité de cette molécule à protéger les vaisseaux sanguins lors d’une infection grave. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de meilleurs traitements contre différentes infections du sang, en précisant comment et quand utiliser cette molécule. Il pourrait aussi permettre d’identifier un marqueur biologique associé, utile pour suivre son efficacité. Cette étape est essentielle pour envisager l’utilisation future de cette molécule dans la prise en charge du sepsis.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (maximum 4, durée 1 min), à 1 prélèvement sanguin à la veine de la queue (maximum 1, durée 1 min). Ces interventions seront réalisées à l’état vigile. Des animaux seront soumis à des ponctions cardiaques réalisées sous sédation profonde.
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvement sanguin réalisé peuvent occasionner un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Le sepsis provoqué peut entraîner une diminution d’activité, un stress, une baisse de température et la mortalité des animaux.
Devenir
Une fois les animaux mis à mort, nous prélevons les organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Toutes les études préliminaires ont été conduites sur des modèles in vitro, cela nous a permis de sélectionner la molécule la plus pertinente à tester. Cependant le sepsis est une situation complexe impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux à utiliser a été calculé en se basant sur des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une surveillance stricte et rapprochée sera assurée. Les cages seront enrichies (coton, maison en carton) pour limiter hypothermie et stress. La réhydratation intrapéritonéale systématique visera à prévenir la déshydratation. Des points limites adaptés permettront l’euthanasie anticipée si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour mimer une infection sévère (sepsis) chez l’Homme. Elle permet de reproduire l’ensemble des complications associés à cette maladie, notamment le dysfonctionnement des vaisseaux et d’organes. Nous utilisons des souris femelles et mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines. À 10–12 semaines, les souris ont un système immunitaire pleinement développé et stable. Les jeunes souris (moins de 8 semaines) ont des réponses immunitaires encore immatures, tandis que les souris âgées peuvent avoir des altérations immunitaires ou des comorbidités. L'âge de 10–12 semaines représente un compromis idéal pour limiter ces biais. De plus, cet intervalle d’âge est couramment utilisé dans les modèles animaux, ce qui facilite la comparaison des résultats avec ceux d'autres études publiées. Inclure des souris mâles et femelles permet de détecter d’éventuelles différences de susceptibilité, de réponse au traitement ou de physiopathologie entre les sexes — ce qui est important, car le sepsis affecte différemment les hommes et les femmes chez l'humain. Cela répond aussi aux exigences croissantes en matière de rigueur et d’équité biologique.
Prévention de la bactériémie et endotoxémie dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Objectifs
Le sepsis est une complication très grave des infections bactériennes et virales. Il peut apparaître de manière soudaine et imprévisible. Cette maladie survient lorsque le système immunitaire, censé protéger l’organisme contre les infections, s’emballe et déclenche une inflammation excessive, appelée choc cytokinique. Cette réaction incontrôlée peut entraîner un dysfonctionnement des organes et, dans les cas les plus graves, une défaillance généralisée (Source : Ministère des Solidarités et de la Santé). Des recherches récentes ont mis en évidence l’existence de certaines molécules jouant un rôle clé dans la régulation du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces molécules sont naturellement produites par les cellules et les organes. Chez la souris, leur inhibition entraîne une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids. De plus, leur neutralisation active un mécanisme biologique appelé autophagie, qui permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de mieux résister aux agressions, notamment dans certaines maladies du foie. Sur la base de ces découvertes, ce projet de recherche vise à déterminer si la modulation de l’autophagie pourrait aider à prévenir le choc septique. Pour cela, deux modèles expérimentaux seront étudiés sur des souris : Un modèle d’endotoxémie, où une toxine bactérienne est injectée pour déclencher une forte réaction inflammatoire. Un modèle de bactériémie, où des bactéries vivantes sont injectées afin de reproduire une infection généralisée plus proche des cas observés chez l’humain. L’objectif de cette recherche est d’explorer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l’inflammation excessive et améliorer la prise en charge du sepsis, une condition qui reste à ce jour un défi médical majeur.
Bénéfices attendus
Le sepsis représente un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Chaque année, il affecte près de 50 millions de personnes, avec une mortalité particulièrement élevée chez les enfants de moins de 5 ans, qui représentent plus de 40 pour cent des cas. Cette pathologie touche de manière disproportionnée les pays à faibles et moyens revenus, mais reste également l’une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, alors que beaucoup de ces décès pourraient être évités grâce à une prise en charge rapide et efficace. En Europe, le sepsis est à l’origine de près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France, soulignant l’urgence d’améliorer les stratégies de prévention et de traitement. Ce projet vise à valider une nouvelle approche thérapeutique contre la septicémie, en testant l’activation du flux autophagique dans un modèle préclinique approprié et représentatif de l’évolution clinique de la maladie. L’objectif est double : Évaluer l’efficacité et la pertinence de cette stratégie thérapeutique dans un cadre expérimental rigoureux, permettant d’identifier une nouvelle cible pour limiter l’hyper-inflammation et améliorer la survie des patients atteints de sepsis. Mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents au sepsis, qui restent encore insuffisamment caractérisés, notamment en ce qui concerne l’impact du métabolisme cellulaire et de l’autophagie dans la réponse inflammatoire systémique. En apportant de nouvelles connaissances sur ces mécanismes et en ouvrant des perspectives thérapeutiques innovantes, ce projet pourrait contribuer à la réduction de la mortalité associée au sepsis et à l’amélioration des stratégies de prise en charge clinique.
Procédures
La mise en place des modèles murins de sepsis implique plusieurs types d'interventions. Celles-ci comprennent des injections ainsi que des procédures de suivi et d'analyse. Avant de déclencher le sepsis, certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). Certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Enfin, certaines souris ne recevront aucune injection préalable. Pour la mise en place du sepsis, toutes les souris recevront une injection unique (quelques secondes) sur animal vigile. Après le déclenchement de la maladie, certains animaux recevront 10 injections sur 7 jours en fonction des groupes expérimentaux sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Chaque pesée dure également quelques secondes. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de l’endotoxémie et de la bactériémie. Les effets indésirables attendus sont ceux classiquement associés à l’induction du sepsis expérimental, sans effets additionnels imprévus. Les principales nuisances incluent : Inflammation systémique sévère, associée à une production excessive de cytokines pro-inflammatoires. Dysfonction d’organes (foie, reins, cœur, poumons), due à l’hypoperfusion tissulaire et au stress oxydatif. Altération de la coagulation, avec un risque accru de thromboses ou d’hémorragies. Hypotension, résultant d’une vasodilatation excessive et d’une augmentation de la perméabilité vasculaire. Altération de la barrière intestinale, favorisant la translocation bactérienne. Dysfonction immunitaire, avec une phase initiale d’hyperactivation suivie d’une immunosuppression secondaire. Altération de la thermorégulation, pouvant entraîner hypothermie ou fièvre. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress temporaire, lié à la contention des animaux, une douleur locale transitoire au point d’injection, une inflammation locale (rougeur, œdème), un risque d’infection au site d’injection, notamment dans le modèle de bactériémie. Les effets liés aux interventions pharmacologiques pourraient induire des perturbations du métabolisme énergétique et modifications du poids corporel. Les mesures de pression artérielle non invasives peuvent induire un stress lié à la contention, malgré l’habituation préalable des animaux. L’échocardiographie nécessite une anesthésie, qui peut provoquer une hypothermie transitoire, et une récupération retardée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.
Remplacement
Le sepsis résulte d’une réponse immunitaire incontrôlée à une infection, impliquant une activation excessive des cellules immunitaires, la libération massive de cytokines, l’activation des voies de coagulation et un dysfonctionnement vasculaire, conduisant à une défaillance multi-organes. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité du sepsis, notamment les interactions dynamiques entre le système immunitaire, les organes vitaux et le microbiote. Bien que des alternatives comme les cultures cellulaires et les organoïdes permettent d’étudier certains mécanismes isolés, elles ne remplacent pas l’étude sur organisme entier. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, avec une optimisation des expérimentations pour réduire le nombre d’animaux témoins. Ce nombre a été rigoureusement déterminé à l’aide d’une analyse statistique préalable, incluant des calculs de puissance fondés sur les effets observés dans des études préliminaires et des données publiées dans des travaux similaires. L’étude sera interrompue si la première série d’expériences invalide l’hypothèse de travail, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Afin de maximiser l’exploitation des données, plusieurs tissus seront prélevés (analyses immunologiques, histologiques, biologie cellulaire et moléculaire). Ces échantillons seront partagés avec nos collaborateurs, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans des études complémentaires.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes aux réglementations en vigueur et adaptées en collaboration avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès libre à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum. Leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification et des structures adaptées (tunnels en carton, morceaux de bois) afin de favoriser leurs comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, un gel nutritif sera placé dans les cages pour faciliter l’accès à une nutrition adaptée et prévenir toute perte de poids excessive. Toutes les manipulations expérimentales seront réalisées en veillant à minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux. Un suivi rigoureux sera mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter toute anomalie. Le personnel impliqué dans ce projet est hautement qualifié et bénéficie d’une formation continue aux bonnes pratiques d’expérimentation animale. Toutes les procédures seront réalisées avec du matériel approprié pour réduire la douleur et le stress, notamment : L’utilisation d’aiguilles de petit calibre pour minimiser la douleur des injections. Le recours à des anesthésiques adaptés lorsque nécessaire. Les sites d’injection feront l’objet d’une surveillance rigoureuse afin de détecter toute inflammation ou infection. En cas de complication, des interventions appropriées seront réalisées, notamment l’application d’antiseptiques. Si des comportements agressifs ou des blessures sont observés chez les mâles, ils seront placés en hébergement individuel, avec un enrichissement adapté (coton de nidification, morceaux de bois) pour maintenir leur bien-être. Toute blessure sera immédiatement prise en charge.
Choix des espèces
Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de s'appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les lignées de souris offrent l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés spécifiques de nos protéines d’intérêt. Les lignées choisies sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes préjudiciables. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.
Évaluer les effets de traitements innovants dans un modèle de sepsis pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 98
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave, causée par une réponse incontrôlée du système immunitaire à une infection. Elle fait 11 millions de victimes par an dans le monde, en particulier chez les jeunes enfants et les personnes âgées, dont le système immunitaire est plus fragile. Aujourd’hui, les traitements actuels visent à réduire l’inflammation et combattre l’infection. En collaboration avec une autre équipe de recherche, nous avons testé une nouvelle molécule prometteuse. Cette molécule réduit l’activation des macrophages, un type de cellule immunitaire, et améliore la survie de souris atteintes de sepsis. Cependant, les modèles précliniques utilisés ont leurs limites, en manquant de représentativité avec le sepsis humain, ou en étant invasif et difficiles à reproduire. Bien que cette molécule semble efficace, nous avons encore beaucoup à apprendre sur son fonctionnement global. Nous pensons qu’elle influence plusieurs aspects du système immunitaire et qu’il est essentiel de confirmer son efficacité dans un modèle plus proche du sepsis humain. Objectifs de l’étude: 1. Développer un modèle de sepsis pulmonaire: Comme la majorité des cas de sepsis pulmonaires sont causés par une bactérie (Streptococcus pneumoniae), souvent associée à des infections virales comme la grippe, nous infecterons des rongeurs avec ces agents. Cela nous permettra de vérifier si ces modèles reproduisent les symptômes des patients humains atteints de sepsis. 2. Tester la molécule dans ces conditions : Nous administrerons différentes doses pour identifier la dose optimale et étudier comment elle se distribue dans le corps par des techniques d’imagerie. Nous analyserons aussi la réponse immunitaire, notamment l’activité des cellules et des molécules responsables de l’inflammation. 3. Explorer en combinaison avec des corticoïdes : Les corticoïdes, souvent utilisés pour réduire l’inflammation, peuvent avoir des effets secondaires importants. En combinant ces deux traitements, nous espérons réduire ces inconvénients tout en améliorant l’efficacité du traitement. Nous mesurerons les mêmes paramètres pour évaluer les bénéfices de cette combinaison. En conclusion, cette recherche nous permettra de mieux comprendre les effets de la nouvelle molécule dans un modèle plus proche du sepsis humain. Ces avancées ouvriront potentiellement la voie à des essais cliniques et, à terme, à une utilisation thérapeutique, seule ou associée à d’autres traitements comme les corticoïdes.
Bénéfices attendus
Le sepsis provoque la majorité des admissions dans les unités de soins intensifs. Il se manifeste par une réponse inflammatoire généralisée due à une infection incontrôlée. Malgré les avancées médicales et l’application des directives internationales, les traitements actuels restent principalement symptomatiques, sans solution curative véritable. Dans le cadre de notre projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d’un traitement curatif prometteur nouvellement synthétisé. Si nos résultats sont concluants, ce traitement pourrait avoir un impact significatif non seulement sur la santé humaine et vétérinaire.
Procédures
La plupart des animaux (plus de 90 %) seront soumis à des injections et des prélèvements de sang pratiqués sous anesthésie générale. Un animal subira un maximum de 2 injections par jours sur une durée de 72h, et les prélèvements ne dépasseront pas 7,5 % du volume sanguin de l’animal. Nous estimons à 64 le nombre d’animaux qui subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Celle-ci sera précédée d’une injection d’anti- douleur, et suivie par une ou plusieurs injections de traitement. Les animaux pourront subir également des prélèvements de sang dans les 72h qui suivent la chirurgie, dans la limite de 7,5 % du volume sanguin de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour reproduire le sepsis présentent des changements de comportement. Ils ont tendance à s’isoler, montrent une faiblesse physique qui affecte leur démarche, et peuvent avoir des écoulements, comme un nez qui coule. On observe également une perte de poids et une baisse de leur température corporelle.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de collecter les échantillons et mesurer les changements aux niveaux tissulaires, cellulaires ou moléculaires. Certains animaux pourront être gardés en vie, s’ils ont subi une procédure modérée ou légère et ne démontrent pas de signes pathologiques. Ils seront alors réutilisés.
Remplacement
Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Dans le cas où notre projet révèle certains mécanismes qui peuvent être étudiés sur cellules, nous remplacerons l’utilisation de modèles animaux par les cultures cellulaires.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons aussi optimisé les prélèvements sanguins et les échantillons de tissus (cœur, foie, reins, poumons, glandes surrénales, muscles, moelle épinière, et omentum) prélevés après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé "test de supériorité" (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Enfin, les variations des données collectées seront analysées à l’aide d’une méthode statistique spécifique (analyse de variance à deux facteurs) pour évaluer les effets du modèle et du traitement.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive, car cela pourrait fausser nos résultats. Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons cinq critères standardisés, chacun noté sur 4 points, permettant d’obtenir un score global sur 20 : • L’état physique, le comportement, et les sécrétions seront vérifiés visuellement. • Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. • La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Les rongeurs seront placés dans des armoires ventilées, où la température et la pression seront contrôlées. Ils auront un accès permanent à l’eau, à la nourriture, ainsi qu’à du papier et du coton pour construire leur nid. Nous ajouterons également des éléments d’enrichissement pour encourager le jeu et l’activité. Étant des animaux sociaux, aucun rongeur ne sera isolé dans sa cage, sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires.
Choix des espèces
Depuis 40 ans, plus de 10 000 études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. Une étude future pourrait se concentrer sur les mécanismes physiopathologiques liés à l’administration de la supformine. L’utilisation de souris est donc recommandée, notamment pour faciliter de futures comparaisons avec des souris transgéniques. Enfin, le rat présente l’avantage de fournir un volume de sang suffisant pour réaliser plusieurs analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les différences entre individus Les souris seront âgées de quelques jours à 24 mois. Cette grande amplitude permettra de moduler le système immunitaire dès le plus jeune âge et d’évaluer les effets de nos traitements sur des souris âgées plus représentatives des patients touchés par le sepsis. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 400 g et agés de 5 à 10 semaines lors de leur utilisation soit l’âge de leur maturité sexuelle pour cette espèce. La grande majorité des animaux (80-90%) seront des souris. Les rats (10-20%) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang, et ce afin de réduire le nombre d'animaux employés.
Evaluation de l’efficacité prophylactique de candidats vaccins dans un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae, responsable de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables de septicémie sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Plusieurs candidats vaccins ont déjà montré des résultats intéressants in vitro et in vivo. L’objectif du projet est d’affiner les résultats précédemment obtenus et qui ont permis de sélectionner un candidat. Ce vaccin a été optimisé et a servi de base dans la préparation de 5 autres vaccins afin d’induire une production d’anticorps permettant la prévention d’une infection septicémique à Klebsiella pneumoniae. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la souris afin d’évaluer l’efficacité potentielle de ces 6 candidats vaccins sur la prévention du sepsis à K. pneumoniae ; Le développement de vaccins prophylactiques contre K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un ou plusieurs candidats vaccin contre une infection à K. pneumoniae. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces différentes solutions. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Une injection de bactéries de 3 secondes - 6 administrations de vaccins de 5 secondes - 2 prélèvements de sang de 15 secondes sous anesthésie volatile
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - Injection des bactéries : la nuisance principale sera liée ici au geste technique et à l’apparition du sepsis. - Pré-immunisation : les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins dans la cuisse droite et gauche et au prélèvement sanguin. Ces souris seront ensuite infectées par les bactéries. Ici une phase de sepsis est également attendue chez certains animaux S’agissant d’une étude de suivi de mortalité, il se peut qu’un animal se retrouve seul dans sa cage (2 jours maximum dans la phase pilote et 15 jours au maximum dans la phase d’efficacité).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (86). Les animaux seront tous infectés et ne pourront donc pas être réutilisés.
Remplacement
L’évaluation de l’efficacité d’un candidat vaccin ne peut être réalisée sans le concours complexe d’un modèle animal. La reproduction des différentes étapes menant au sepsis ne peut être réalisée in vitro. Également, la production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. Aussi, il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 8 à 10 animaux par groupe seront afin d’obtenir une analyse statistique robuste pour évaluer l’efficacité ou non de ces différents traitements.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 8-10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Des phases d’habituation ont été prévues. Ils seront suivis étroitement (toutes les 4h) durant les différentes phases de l’étude. Ce genre d’étude a déjà été réalisé au sein du laboratoire et nous permet d’avoir une bonne compréhension de l’infection et ainsi de prédire à quel moment l’animal est susceptible de montrer des signes de souffrance et donc d’augmenter la fréquence de surveillance en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Même si aucun effet toxique n’a été rapporté dans une étude précédente sur d’autres composés, la tolérance des nouveaux candidats vaccins produits n’est pas connue a priori et des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. L’administration des vaccins et le prélèvement se feront sous anesthésie volatile. Au cours de l’étude de suivi de mortalité, il se peut qu’un animal se retrouve seul dans sa cage. Dans ce cas, un enrichissement supplémentaire sera alors ajouté (igloo, jouet …). De plus, les animaux seront hébergés dans des cages transparentes afin que le contact visuel et auditif soit toujours maintenu pour limiter au maximum le stress de l’animal qui pourrait se retrouver seul dans sa cage.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point d’un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae dans d’autres projets. Des souris mâles et femelles seront utilisés dans cette étude pour évaluer l’impact du paramètre genre sur la réponse vaccinale. Des souris de 5 semaines (+ 1 semaine de stabulation) seront nécessaires pour la phase de pré-immunisation afin que l’infection se fasse à l’âge de 11 semaines avec une système immunitaire mature. La phase pilote (sans pré-immunisation) demandera donc des souris de 10 semaines (+ 1 semaine de stabulation).