Les projets approuvés

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un anticorps anticancéreux par perfusion intraveineuse de trente minutes, placé sur une chaise de contention pendant environ quarante minutes. Les trois subissent quatorze prélèvements sanguins totalisant 53 ml en quatre semaines, et les deux qui poursuivent la seconde phase dix-huit de plus, pour 65 ml en cinq semaines. Deux seront tués pour le prélèvement de leurs organes, le troisième gardé en vie et réutilisable après accord du vétérinaire. L'objet immédiat de l'étude est d'affiner les doses et les protocoles d'études réglementaires ultérieures, elles aussi menées sur des primates.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets biologiques ainsi que le devenir dans l’organisme d’un anticorps développé pour cibler et éliminer les cellules tumorales dans le cadre du développement d’un futur traitement anticancéreux destiné à l’homme. Cet anticorps sera administré par voie intraveineuse chez le macaque en administration unique à trois doses distinctes (phase 1) puis selon un schéma d’administrations répétées (cinq injections) à deux niveaux de dose (phase 2). La selection des deux doses pour les administrations répétées sera basée sur les résultats des adminsitrations uniques. Cette étude permettra d’identifier les doses et les modalités d’administration les plus adaptées en vue de la réalisation de futures études à plus grande echelle et réglementaires. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection des doses du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps capable de créer une thérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études à plus grandes echelles puis des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner la meilleure dose et le meilleur schéma d’administration mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Trois animaux réaliseront la phase 1 et à l’issue de cette phase, deux animaux continueront vers la phase 2 Les animaux vigiles recevront un candidat médicament par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (faible, moyenne, haute) lors de la première phase puis deux doses seront selectionnées pour poursuivre les administrations répétées (x5) pour la seconde phase. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Pour la seconde phase, es animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 14 prélèvements de 1 à 5 ml, pour une volume total prélevé de 53 ml sur 4 semaines en phase 1 et 18 prélèvements de 1 à 8,5ml, pour une volume total prélevé de 65 ml sur 5 semaines en phase 2. Les animaux seront vigiles mais une sédation sera envisagée en cas de besoin. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur les cellules de l'immunité, une réaction de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements.

Devenir

Deux doses seront sélectionnées en fin de procédure 1 pour être évaluée dans la procédure 2 (sur 2 animaux). L’animal non utilisé pour la procédure 2 sera gardé en vie et pourra être réutilisé (après accord du vétérinaire). En fin de procédure 2, tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité du candidat médicament.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 3 primates répartis en 3 lots de 1. Il a été réduit au minimum. La période de washout (periode d'elimination de l'organisme du candidat médicament) entre les deux phases permet de réutiliser 2 animaux pour l’évaluation des doses répétées ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique. Des points limites précoces et spécifiques ont été définis et seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, notamment en ce qui concerne les populations de lymphocytes T γδ et l'expression des cibles impliquées dans le mécanisme d'action du candidat médicament, le macaque a été retenu dans le cadre de ce projet. L’anticorps cible des récepteurs présents chez le macaque mais absents ou très différentes chez les rongeurs. En effet les rongeurs ne possèdent pas de système γδ comparable à celui de l'Homme. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet car certaines études montrent que les animaux matures (>4,5ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques.

Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, seule façon selon le porteur d'identifier les fibroblastes associés aux cellules B. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, adultes et nouveau-nés. Chacune subit des injections tous les trois jours pendant trois semaines, trois gavages, une injection sous-cutanée dans la patte arrière sous anesthésie et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant dix minutes au maximum pour être injectés et génotypés par biopsie de tissu. Toutes sont tuées en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs ganglions lymphatiques.

Objectifs

Les anticorps protègent contre des pathogènes mais provoquent aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique les cellules B, productrices d’anticorps, et des fibroblastes qui sont en contact directe avec les cellules B. Dans cette étude nous cherchons à comprendre comment ces fibroblastes se différencient et comment ils participent à la réponse immunitaire. Ce savoir pourrait avoir des implication dans la vaccination contre des infections ou pour le traitement de maladies autoimmunes.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la formation des fibroblastes associés au cellules B et leur implication dans la réponse immune. Ces résultats pourraient avoir des retombées à moyen terme sur une nouvelle application en découvrant des nouveaux médicaments contre des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.

Procédures

Des souris vigiles sont soumises à des injections tous les trois jours (durée < 1 min) pendant 3 semaines. Les souris vigiles sont gavées 3 fois (durée < 1 min). Les souris anesthésiées sont soumises à une injection d’un agent induisant une réponse immunitaire (durée < 1 min). Des prélèvements de sang sont effectués sur animal vigile (durée du prélèvement quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les injections des souriceaux et leur génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires. Cela peut être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors de la biopsie de tissu. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent être source de stress et de l’anxiété tout comme une douleur légère de courte durée pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Aucune habituation n’est prévue pour les nouveau-nés ou animaux juvéniles. Il n’y pas d’acclimatation nécessaire. L’anesthésie est prévue pour les injections par voie sous-cutanée dans la patte arrière afin de cibler spécifiquement les ganglions poplités et inguinaux. Les sites de prélèvement sous-mandibulaires sont alternés. Le bien-être de l’animal est évalué tous les jours par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement et la locomotion. Les critères sont notés sur une fiche de score. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Si le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Les souris sont hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour connaitre plus sur le mécanisme de la formation et la fonction des cellules du ganglion lymphatique. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes où se trouvent ces cellules et une souris génétiquement modifié qui permet d’identifier ces cellules. Il n’existe aujourd’hui aucun autre moyen pour les identifier. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature. Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du système immunitaire impliquant la formation de ces cellules. La souris génétiquement modifiée est justifiée par être le seul moyen d’identifier les fibroblastes associés aux cellules B.

Marquées à l'oreille, injectées deux fois sur animal vigile et trois fois sous anesthésie, saignées six fois, 192 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des pseudo-virus du VIH recouverts d'anticorps, des particules dépourvues de matériel génétique viral, associés à un vaccin, pour mesurer si la combinaison produit une réponse immunitaire plus durable que le vaccin seul. Le porteur indique avoir retenu la souris pour éviter le recours aux primates non-humains, le VIH n'infectant que peu d'espèces. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure, pour l'analyse complète de leur système immunitaire.

Objectifs

Le VIH est un virus qui attaque le système immunitaire. Aujourd'hui, les traitements antirétroviraux permettent de contrôler efficacement l'infection, mais ils ne permettent pas d'éliminer complètement le virus. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc à l'étude pour aider le système immunitaire à mieux contrôler l'infection.Parmi elles, l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître un grand nombre de variants du VIH a montré des résultats prometteurs. Ces anticorps se fixent sur les particules virales et facilitent leur reconnaissance par certaines cellules du système immunitaire. Ce mécanisme peut aussi contribuer à stimuler les défenses naturelles de l'organisme contre le VIH. Cependant, cette stimulation reste souvent insuffisante pour obtenir une protection durable chez la plupart des patients. Pour renforcer cette réponse immunitaire, il est envisagé d'associer ces anticorps à un vaccin thérapeutique conçu pour stimuler spécifiquement certaines cellules immunitaires capables de reconnaître et de combattre le VIH. L'évaluation de cette stratégie combinée est toutefois difficile, car le VIH infecte très peu d'espèces animales. Afin d'éviter le recours à des modèles primates non-humains, cette étude utilise chez la souris des particules appelées « pseudo-virus ». Ces particules ressemblent au VIH mais ne contiennent aucun matériel génétique viral. Elles ne peuvent donc ni infecter les cellules ni se multiplier, ce qui les rend sûres à utiliser en laboratoire. En administrant ces pseudo-virus préalablement recouverts d'anticorps, il est possible de reproduire certains mécanismes de reconnaissance du VIH par le système immunitaire et étudier la réponse immunitaire qui en résulte. L'objectif est de déterminer si l'association entre le vaccin et les anticorps permet d'obtenir une réponse immunitaire plus forte et plus durable que le vaccin seul.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront notamment d'identifier les meilleures conditions d'administration de ces deux traitements, par exemple l'ordre dans lequel ils doivent être administrés ou le type d'anticorps le plus efficace. Ces connaissances pourront contribuer à la conception de futurs essais cliniques chez l'Homme visant à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le VIH allègeant le traitement actuel et donc favorisant une meilleure qualité de vie chez les patients vivant avec le virus.

Procédures

1x Marquage à l’oreille sur animaux vigiles (quelques secondes) 6x Prélèvement de sang sur animaux vigiles (quelques secondes) 2x injections sur animaux vigiles (quelques secondes) et 3x injections sur animaux anesthésiés (quelques minutes)

Impact sur les animaux

Les souris ressentiront une légère douleur aux moment du marquage à l'oreille et au moment des injections et des prélèvements de sang.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour une analyse complète de leur système immunitaire.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles d’induction et stimulation de réponse spécifiques chez l’homme sur des cellules dérivés du sang périphérique mais seuls les animaux vivants permettent une analyse de la réponse cellulaire mémoire induite lors d’une vaccination, le paramètre d’intérêt de cette étude.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. La taille des groupes ont été calculés à partir de données expérimentales préalables afin de garantir que l'étude puisse détecter une amélioration statistiquement significative de la réponse immunitaire. La composition des groupes a été réalisée dans le but de minimiser leur nombre tout en garantissant que les effets observés puissent être attribués au co-traitement et non à l'un des traitement seul.

Raffinement

Les gestes expérimentaux impliquant une douleur chez l'animal et un potentiel dommage chez l'animal sont les injections ainsi que les prélèvements de sang. Les injections se feront sous anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane, les animaux seront observés jusqu'à leur réveil complet de l'anesthésie et feront l'objet d'une vérification de l'absence de saignement persistant, de détresse ou de complication locale. Suite à l'injection, si des signes de lésions sont observés, un traitement par un antiseptique sera appliqué. Suite à l'injection du vaccin ou aux prélèvements de sang , si des signes de lésions cutanées sont observés, un traitement par un antiseptique cutanée sera appliqué. La surveillance des animaux sera un suivi visuel de leur comportement et morphologie 3 fois par semaine durant l’ensemble du traitement et portera sur l'évaluation de leur état global et l’apparition des points limites généraux. Les signes précoces d’une détérioration de la santé de l’animal tels qu'une diminution de l'activité, une altération du toilettage une posture anormale, des signes d’un manque d’alimentation et le cas échéant des soins seront prodigués tel que une complémentation alimentaire et un accès à la nourriture facilité, un enrichissement par l'ajout d'un carré de coton favorisant la confection d'un nid et diminuant le stress de l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement jusqu'à la disparation des symptômes.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Les études précédentes montrent que le vaccin est immunogène chez la souris où de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Des souris de 5-6 semaines d’âge seront utilisées. Il est admis qu’à partir de l’âge de 5 à 6 semaines, le système immunitaire des petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant la vie d’adulte et permettant des conclusions pouvant être appliquées à l'Homme.

Génétiquement modifiées pour exprimer un gène humain, les souris de ce projet sont élevées et transportées dans des cages séparées pour ne pas être mêlées à d'autres lignées. 400 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis une chimiothérapie ou des anticorps par voie intrapéritonéale, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à cinq semaines, avec mise à mort le jour même si le score de douleur atteint 8 ou si la tumeur s'ulcère. Toutes sont tuées par inhalation de CO2, pour une ponction cardiaque post mortem et le prélèvement des ganglions, de la rate et de la tumeur.

Objectifs

De nombreux mécanismes suppresseurs déjouant la surveillance du système immunitaire ont été mis en évidence lors du développement des tumeurs. Parmi ceux-ci, les points de contrôles immunitaires notamment ceux exprimés par les cellules myéloïdes représentent donc des cibles thérapeutiques intéressantes pour restaurer une réponse immunitaire efficace et éradiquer les tumeurs. La compréhension de ces points de contrôles immunitaires représente ainsi un enjeu crucial en sante pour les patients atteints de cancer et permettent de développer l'immunothérapie pour bloquer ces points de controle qui a révolutionné les traitements des patients cette dernière décennie. Aussi, il est important de déterminer le rôle de ces points de contrôles dans des modèles in vivo de tumeurs chez la souris par le blocage à l'aide d'anticorps thérapeutiques pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le blocage de la molécule chez le rongeur permettrait de mettre en évidence l'importance de la molécule étudiée dans le développement du cancer et ainsi de générer à long terme de nouveaux médicaments pour les patients atteints de cancers.

Procédures

Les animaux (400 au total) seront injectées par des cellules tumorales par voie sous cutanée (en 15 secondes) et seront traités par de la chimiothérapie ou des anticorps thérapeutiques en intrapéritonéal en 5 secondes). Le suivi des souris (croissance de la tumeur) sera suivi sur 5 semaines maximum et certaines souris seront prélevées pour leurs organes 14 jours après l'injection des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une souffrance au niveau de la peau injectée par la tumeur en sous cutanée mais il est rarrement observé de dégradation de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, nous prélèverons le sérum du sang (ponction cardiaque après la mort), les ganglions, rate et la tumeur à jour 14 après euthanasie de l'animal par inhalation de CO2. Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures experimentales car ces animaux ayant reçu des injections de cellules tumorales ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le meilleur modèle pour regarder l'effet d'une molécule sur la croissance tumorale et la survie est in vivo et en utilisant des animaux génétiquement modifiés; il existe une alternative de modèles tumoraux en 2 dimensions, ou organoïdes. Cependant, à ce stade avec des organoïdes, il ne serait pas possible d'analyser le rôle de cette molécule dans ce contexte tumoral car pour l'instant les études sur les organoides de tumeurs permettent uniquement de regarder des molécules exprimées par les lymphocytes T et non des molécules exprimées par des cellules myéloides comme c'est le cas ici. Par ailleurs, la réponse immune anti-tumorale est complexe et fait intervenir de multiples acteurs cellulaires qu'il est difficile à reproduire à l'heure actuelle dans les modèles in vitro lorsque l'on souhaite étudier la réponse immune anti-tumorale dans sa globalité.

Réduction

Pour les expériences in vivo, le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué à l'aide du logiciel en ligne « Experimental Design Assistant » (https://eda.nc3rs.org.uk/eda/login/auth) en fonction de l'ampleur estimée de l'effet et de l'écart-type (variabilité basée sur les données antérieures obtenues) pour les différents tests non paramétriques, avec un seuil de signification p < 0,05 et une puissance fixée à 0,90. La taille de l'échantillon avec EDA indique un total de 10 souris par groupe (controle et injecté par anticorps) par procédure respectivement, dans au moins 2 expériences distinctes. Les données seront analysées à l'aide de GraphPad Prism. La mise en évidence de différences éventuelles entre ces groupes sera effectuée à l’aide de tests statistiques non paramétriques, sur des séries non appariées, puisque ni la normalité des distributions parentes, ni l’analyse de l’égalité des variances ne peuvent être réalisées dans de tels protocoles sans sacrifier un nombre important d’animaux. Les analyses statistiques porteront majoritairement sur des comparaisons de moyenne à l’aide du test U de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'animalerie selon les normes qui leur sont propres afin de ne pas ajouter un stress supplémentaire au protocole utilisé. Les animaux sont suivis tous les 3 jours pour la croissance tumorale dans les modèle sous cutanés d'adénocarcinome du colon et de fibrosarcome afin de suivre la croissance tumorale et détecter le plus précocement une douleur et d’y mettre un terme, soit par traitement antalgique, soit par sacrifice de l’animal si la souffrance ne peut pas être contrôlée. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) et de souffrance conduira à l’euthanasie de l’animal selon le système de score indiqué en tableau en annexe et si le score est supérieur ou égal à 8, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié le jour même par inhalation de CO2. Par ailleurs, l'animal sera systématiquement euthanasié si une ulcération de la tumeur est observée.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de CLEC-1, nous devons utiliser des souris hCLEC-1 (Knock In KI) pour tester son rôle dans des modèles expérimentaux de développement tumoral. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour exprimer le gène humain clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangées à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo de l'effet de l'anticorps est essentielle et ces souris qui ont cette modification génétique avec le CLEC-1 humanisé permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe en clinique. Les souris receveuses de tumeurs seront utilisées entre 8 et 12 semaines d'âge (souris adultes) car il faut un système immunitaire adulte. Les souris seront également prélevées pour leurs organes lymphoïdes secondaires ou leur moelle osseuse à 8-12 semaines (âge adulte). Pour les chimères, les souris seront utilisées entre 10-12 semaines après reconstitution pour que le repeuplement hématopoïétique soit optimal.

Sept injections en huit jours, puis une ponction de sang par semaine pendant un mois et deux le même jour la dernière semaine : 786 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet compare les anticorps anti-plaquettes produits selon le contexte, transfusions répétées ou grossesse, en reproduisant chez la souris ce qui survient chez des patients transfusés et des femmes enceintes. Les souris utilisées sont génétiquement modifiées pour que leur nombre de plaquettes puisse être manipulé. Des petits de trois semaines à peine sevrés sont inclus parce qu'ils fournissent un volume de sang suffisant pour les analyses, et la mise à mort est justifiée par ce besoin de grands volumes de sang ou d'organes.

Objectifs

Les plaquettes sont des éléments essentiels qui, lors d’un saignement, permettent de le stopper en formant des caillots. La génération d’anticorps dirigés contre nos propres plaquettes sanguines) est problématique dans les maladies qui nécessitent une transfusion de plaquettes. En effet, la présence de tels anticorps chez le patient conduit à la destruction des plaquettes transfusées, qui a pour conséquence une inefficacité thérapeutique. La génération de ces anticorps peut également être observée chez la femme enceinte. Dans ce contexte, les plaquettes du fœtus présentent à leur surface des molécules provenant de la mère (« molécules du soi »), mais aussi celles du père (« molécules du non soi ») qui vont être considérées comme étrangères à la mère, et donc entrainer la production d’anticorps contre les plaquettes du foetus. Ceci peut entrainer une baisse du taux de plaquettes chez le nouveau-né, et favoriser l’apparition d’un état réfractaire plaquettaire chez la mère, si elle devait par la suite être transfusée. La probabilité d’apparition de ces anticorps, serait plus importante à partir de la troisième grossesse, la mère ayant déjà été exposée aux molécules du père lors d’une première grossesse. Nous savons à quel endroit sont produits ces anticorps, nous souhaitons à présent étudier si la quantité et le type d’anticorps produits chez la souris, va changer selon le contexte (grossesse ou transfusion de plaquettes étrangères). Pour cela, nous mimerons ce qui se passe chez l’Homme, en réalisant plusieurs transfusions de plaquettes, des plaquettes obtenues différemment, chez la souris, ou encore en suivant des femelles ayant eu plusieurs portées. Pour finir, nous étudierons également l’élimination des plaquettes, à la suite d’une transfusion faite aux femelles ayant eu plusieurs portées ou ayant été transfusées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comparer, le type et la proportion d’anticorps anti-plaquettes produits selon différentes situations. Le but étant par la suite, de pouvoir les bloquer grâce à un médicament chez des patients qui ont besoin d’être transfusés, mais ont déjà éliminé des plaquettes lors de transfusions auparavant.

Procédures

La souris vigile recevra 1 injection de 5 secondes pendant 4 jours consécutifs, suivies pour certaines, 4 jours après, d’une injection de 5 secondes pendant trois jours consécutifs. La souris vigile recevra 1 injection pendant 5 secondes avant le prélèvement de sang. La souris anesthésiée par inhalation, sera prélevée à la queue, 15 secondes, une fois par semaine, pendant 4 semaines, puis la 4ème semaine deux fois dans la même journée. La souris anesthésiée par inhalation, recevra une injection de plaquettes de 5 secondes, une fois pour certaines, et une fois par semaine pendant 4 semaines pour d’autres.

Impact sur les animaux

L’injection répétée réalisée sur animal réveillé peut entrainer un stress à la contention et une douleur au point de piqûre de l’aiguille de quelques secondes. L’injection d’anesthésiants, peut entrainer un stress à la contention, et une douleur au point de piqûre de l’aiguille de quelques secondes. Pour les procédures d’anesthésie, le rythme respiratoire peut être impacté : rythme modifié ou apnée. L'injection de plaquettes à l'animal n'a aucun effet sur sa santé, aucun choc anaphylactique et aucune inflammation n'apparaît.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car nous aurons besoin soit d’un grand volume de sang, soit de prélever des organes.

Remplacement

Les évènements induisant la production d’anticorps anti-plaquettes que l’on souhaite étudier, ne peuvent éthiquement se faire chez les patients. En effet, il parait inenvisageable de pouvoir bloquer la production de plaquettes, afin de pouvoir transfuser au patient des plaquettes d’une maturation précise, ou encore de pouvoir transfuser des plaquettes fluorescentes, ou de pouvoir réaliser des gestes invasifs comme des biopsies d’organes tels que le foie ou la rate. Or, l’apparition de ces évènements ne peut avoir lieu qu’au sein d’un organisme vivant, suite à l’interaction de différents organes, et la mise en place de mécanismes complexes, qui n’existent pas encore autre que sur le vivant.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : -Par l’acclimatation de nos souris à la pièce d'hébergement pendant deux semaines suite au sevrage ou à leur arrivée - Par l’habituation des animaux à l’expérimentateur et aux différents gestes, une fois par jour pendant 5 jours, la semaine avant le début de la procédure -Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages sont munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose + des bâtons de coton + de la frisure, afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux -Par l'utilisation d'anesthésiants et d'analgésiques adaptés lors des différents gestes sur l'animal -Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante à 38°C lors des anesthésies, et pour son réveil, dans une boite thermostatée à 38°C - Des points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous disposons des souris génétiquement modifiées qui nous permettent de modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les plaquettes sanguines de souris sont très proches au niveau fonctionnalité que celles de l’Homme. Nous utiliserons des souris de 7 à 20 semaines période où le nombre de plaquettes chez les individus est stable, et des petits de 3 semaines sevrés, pour pouvoir avoir un volume de sang suffisant pour nos analyses.

Le protocole s'arrête quand une souris atteint le score 2, soit une baisse d'activité des pattes arrière et une courbure du dos marquée, le score 3 correspondant à la paralysie du train arrière. 33 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des anticorps prélevés sur des malades atteints de myopathie nécrosante auto-immune, une injection par jour pendant dix-sept jours, quatre microprélèvements sanguins et trois tests de préhension, avant que leur muscle gastrocnémien soit prélevé. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, et attend de ce protocole qu'il ouvre la voie à de nouvelles thérapies ciblées et à des essais chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif général de notre programme est de tester l'efficacité thérapeutique d’une molécule antagoniste d’une protéine appelée Fn14 (anti-Fn14) dans un modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune (MNAI). Ce modèle est obtenu par le transfert d'anticorps de malades souffrant de MNAI. Nous utiliserons des souris immunodéficientes supplémentées avec du complément humain pour ne pas rejeter les composants humains que nous leur injectons, ce qui nous permet d’évaluer correctement le rôle curatif de la molécule anti-Fn14. Plus précisément, nous comparerons trois groupes de souris : 1) des souris non malades (transfert d’anticorps de sujet sain dès J0) ; 2) des souris malades (transfert d’anticorps de malade MNAI dès J0) ; 3) des souris malades et traitées avec l’anti-Fn14 à partir de J8. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires. L’objectif final est de voir si le médicament peut améliorer la force musculaire chez ces souris.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d’un effet bénéfique de la molécule anti-Fn14 ouvrira la voie à l’étude de nouveaux mécanismes d’action des autoanticorps et au développement de nouvelles thérapies ciblées ainsi que d’essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 4 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 17 jours soit 17 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacune. 3 grip test seront réalisés pour chacune des souris, durée moins de 1 minute. Les muscles gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pourront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.

Devenir

Le prélèvement du muscle gastrocnémien (postérieurement à la mesure de la force in situ) pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été réduit à son minimum (n=11) grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis par un calcul de puissance de déterminer exactement les effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologiques obervées lors de ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par les test adaptés.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite (score 2) dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante : Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Une évaluation quotidienne de la douleur par deux personnes indépendantes sera également mise en place par une observation des changements des expressions faciales des animaux et l’apparition de signes comme le léchage et le grattage d’une zone douloureuse, l’automutilation, la déshydratation, l’agressivité, les yeux clos, les postures anormales (dos vouté…), l’activité réduite, la diminution du toilettage, la respiration anormale, ou encore la perte de poids (mesurée par pesée). Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place 24 heures avant la première injection d''anticorps pour les animaux de tous les lots. Lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes sera atteint ou que le traitement préventif ne sera plus suffisant, un anti-douleur sera administré jusqu'à disparition de la douleur. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. De plus, lors de la mesure de la force musculaire in situ, un analgésique (buprénorphine) sera administré 30 minutes avant le début de l’intervention ; l’injection se fera en s.c. à une dose de 0,05 mg/kg.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Un implant métallique glissé sous la peau, puis un chauffage local maintenu 48 heures par un champ magnétique, jusqu'à trois fois: 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La chirurgie d'implantation dure une vingtaine de minutes, suivie de vaccinations sous anesthésie et de prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si une hausse de température modifie la production d'anticorps après une vaccination. Le porteur y voit un moyen non médicamenteux d'améliorer certaines réponses vaccinales et d'évaluer l'effet des médicaments pris contre la fièvre après un vaccin.

Objectifs

La température du corps des mammifères, dont l’homme, est finement régulée, mais elle peut augmenter, par exemple lors d’une fièvre induite par une vaccination ou par une infection. Cette augmentation de la température est connue pour influencer le fonctionnement du système immunitaire. Cependant, l’effet de la température sur la réponse immunitaire humorale, qui correspond à la production d’anticorps par des globules blancs essentiels au système immunitaire appelées lymphocytes B, reste encore mal connu. La capacité des lymphocytes B à produire des anticorps en réponse à une vaccination ou à un microbe est un processus complexe. Elle nécessite la coopération avec d’autres types de cellules du système immunitaire et la formation de structures spécialisées situées dans certains organes, comme les ganglions lymphatiques ou la rate. La réponse humorale se caractérise également par la mise en place d’une mémoire immunitaire dirigée contre la cible vaccinale ou le microbe, qui peut persister pendant plusieurs mois, voire plusieurs années. Le maintien de cette mémoire repose sur des interactions entre différents types cellulaires dans plusieurs organes, notamment la rate et la moelle osseuse. Ces mécanismes complexes sont difficiles à reproduire en laboratoire sur des cellules isolées. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment une augmentation de la température peut influencer la réponse immunitaire humorale. Pour cela, le projet utilise un modèle expérimental chez la souris permettant d’augmenter la température de manière localisée, uniquement au niveau d’un ganglion lymphatique, de 1 à 2 degrés pour mimer l’intensité de l’élévation de température dans la fièvre. Le projet comporte deux objectifs successifs : 1/ vérifier que le dispositif expérimental permet d’augmenter localement la température de manière stable et réversible, sans affecter l’état général des animaux ; 2/ étudier si cette élévation locale de la température, appliquée au moment d’une vaccination, modifie la qualité et la durabilité de la réponse immunitaire. L’objectif principal est l’évaluation de la mémoire immunitaire à long terme. Des analyses réalisées à des temps plus précoces pourront permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre l’effet de la température sur la réponse immunitaire humorale pourrait avoir un impact important dans le domaine de la vaccination. En particulier, l’élévation de la température pourrait, à terme, être envisagée comme un moyen non médicamenteux d’améliorer l’efficacité de certaines réponses immunitaires, une approche déjà explorée dans d’autres domaines, notamment en cancérologie. Par ailleurs, ce projet permettra d’évaluer plus précisément les conséquences de la prise de médicaments visant à faire baisser la fièvre après une vaccination. Cette pratique est très répandue, mais son impact potentiel sur la mise en place d’une réponse immunitaire efficace et durable reste encore mal compris. Les résultats de ce projet pourraient ainsi contribuer à améliorer les connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et à guider, à plus long terme, certaines stratégies vaccinales.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions au cours du projet. Certaines souris subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin d’implanter un petit objet métallique sous la peau au niveau du flanc. Cette chirurgie est réalisée une seule fois par animal et dure environ 20 minutes, suivie d’une période de récupération de 3 à 4 semaines avant toute autre manipulation. Après la phase de cicatrisation, les souris seront placées dans un dispositif générant un champ magnétique permettant d’induire une élévation locale de la température au niveau de l’implant. Cette élévation de température est maintenue pendant 48 heures. Dans le cadre de la validation du modèle, certaines souris seront soumises à cette procédure jusqu’à trois fois, à une semaine d’intervalle. La température locale sera mesurée par imagerie infrarouge, sans contact avec l’animal. Des mesures de température corporelle seront également être réalisées à l’aide d’une sonde rectale. Ces mesures durent en moyenne 1 à 2 minutes par animal et sont répétées à différents temps pendant les 48 heures de chauffage. Dans la seconde partie du projet, certaines souris seront vaccinées sous anesthésie générale par injection sous-cutanée au niveau de la patte arrière, une à deux fois par animal (vaccination initiale et rappel), chaque injection durant moins d’une minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés à plusieurs endroits et à plusieurs temps (jusqu’à trois fois par animal), chaque prélèvement durant environ 1 minute. Enfin, les expériences se termineront par l'euthanasie des animaux sous anesthésie, avec un prélèvement sanguin final, d’une durée d’environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

L’implantation chirurgicale de l’objet métallique peut entraîner une douleur et un inconfort modérés et transitoires, associés à une inflammation locale liée à la chirurgie, généralement limités à quelques jours après l’intervention. L’élévation locale de la température peut être associée à une sensation de chaleur localisée et à un inconfort transitoire pendant la durée du chauffage. Les vaccinations et les injections sous-cutanées peuvent provoquer une gêne locale temporaire et une réaction inflammatoire modérée au site d’injection. Les prélèvements sanguins et les mesures de température peuvent entraîner un stress passager lié à la manipulation des animaux. L'ensemble de ces interventions peut conduire a une légère perte de poids et des modifications transitoires du comportement. Les expériences se terminent par l'euthanasie des animaux.

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de permettre le prélèvement de sang en quantité suffisante ainsi que de différents organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques, rate, moelle osseuse). Ces prélèvements sont indispensables à l’analyse de la réponse immunitaire humorale, de la mémoire immunitaire induite par la vaccination et des mécanismes associés. Ces analyses nécessitent des prélèvements terminaux et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération dans le temps et l’espace entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo et de devenir des cellules mémoires capables de survivre pendant plusieurs mois. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse dans un organisme entier vivant, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au maximum (186) grâce à une organisation progressive du projet. Une première étape permet de valider le dispositif expérimental avant son utilisation, afin d’éviter de réaliser des expériences inutiles sur un grand nombre d’animaux. Des tests ont également été réalisés en dehors de l’animal pour vérifier le bon fonctionnement du dispositif. De plus, chaque animal peut être utilisé pour plusieurs mesures, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux. Enfin, le nombre d’animaux nécessaires a été calculé à l’avance afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux possible. Certaines analyses ne seront réalisées que si nécessaire, afin de ne pas utiliser d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les procédures impliquant une intervention chirurgicale, ainsi que les injections liées à la vaccination, sont réalisées sous anesthésie générale avec analgésie. Un suivi clinique quotidien est mis en place après chaque intervention et jusqu’à la fin de la procédure afin de détecter précocement tout signe de douleur, de stress ou de dégradation de l’état général. Pour cela, une grille d’observation est utilisée, prenant en compte des critères tels que la perte de poids, l’apparence générale, le comportement et la présence de signes cliniques anormaux comme un écoulement nasal, permettant d’établir un score de douleur. Des points limites ont été définis. En fonction du score de douleur et de sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie jusqu'à l'amélioration du score (les animaux seront euthanasiés après 3 jours si le score ne s'améliore pas), soit les animaux seront euthanasiés. Une perte de poids pouvant être liée à une déshydratation est prise en charge par une réhydratation adaptée. Afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux changements d’environnement, les souris sont habituées progressivement aux conditions expérimentales, notamment aux manipulations, à la prise de température et aux cages utilisées pour les expériences. Tout au long du projet, les animaux sont maintenus en groupes sociaux, sans isolement, dans un environnement enrichi comprenant des matériaux de nidification et des objets à ronger, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris a été choisie car son système immunitaire fonctionne de manière comparable à celui de l’être humain et est très bien étudié. Comme l’homme, la souris est un animal qui régule sa température corporelle, ce qui permet d’étudier de façon pertinente l’effet d’une augmentation de la température sur les défenses immunitaires. Toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines au début des interventions. À cet âge, les animaux ont une taille suffisante pour permettre les interventions chirurgicales, et leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est indispensable pour étudier correctement la réponse à une vaccination et la mise en place d’une mémoire immunitaire.