Les projets approuvés

50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 5 âgées de 75 à 85 semaines, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs oreilles. Chaque animal reçoit sous anesthésie une blessure à l'emporte-pièce dans l'oreille, dont la cicatrisation est suivie jusqu'à 21 jours, certains subissant en plus trois injections intrapéritonéales puis une saignée partielle avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le projet cherche à établir le rôle de cellules immunitaires appelées basophiles dans la réparation de la peau, avec l'espoir lointain de traiter des plaies chroniques. Pour arriver à cinquante individus, le porteur compte chaque oreille comme un "individu unique" et divise ainsi par deux l'effectif déclaré.

Objectifs

Une mauvaise cicatrisation de la peau accroit les risques d’infection et de formation excessive de tissu cicatriciel. Ce problème est fréquent chez les personnes âgées. Il y a un réel besoin de comprendre comment les tissus et le système immunitaire interagissent pour contrôler les différentes étapes de la cicatrisation. La cicatrisation est contrôlée en partie par des cellules immunitaires résidentes de la peau : les macrophages. Normalement, ces macrophages réparent les tissus et les nettoient de leurs cellules mortes : ils sont appelés «M2». Lors d’une blessure, ils perdent ce statut et deviennent inflammatoires : ils sécrètent des molécules qui tuent les microbes mais qui occasionnent également des dommages collatéraux au tissu environnant. Une bonne réparation du tissu nécessite donc que les macrophages redeviennent «M2». Les basophiles sont des cellules immunitaires sanguines capables de sécréter des molécules favorisant la transformation des macrophages de la peau en macrophages M2. Des expériences préliminaires nous ont permis d’observer que des basophiles infiltraient la peau pendant les 3 premières semaines du processus de cicatrisation. Cela nous laisse penser que les basophiles ont un rôle à jouer dans la cicatrisation. Le but de ce projet est de déterminer les conséquences de la sécrétion de molécules pro-«M2» par les basophiles sur les macrophages au cours des différentes phases de la cicatrisation. Pour ce faire nous allons déléter spécifiquement les basophiles ou les molécules qu’ils sécrètent in vivo sur des souris adultes ou âgées, et observer l’évolution de la cicatrisation, de l’inflammation cutanée, et de l’activation des leucocytes de la peau. Cela permettra d’affiner notre connaissance du contrôle qu’exerce le système immunitaire sur la cicatrisation, et ainsi de mieux comprendre pourquoi la cicatrisation peut être défectueuse afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour faciliter la cicatrisation de personnes âgées.

Bénéfices attendus

La finalisation de ce projet nous permettra de démontrer formellement que les basophiles favorisent la résolution de l’inflammation et la cicatrisation de la peau dans un contexte sain mais également dans le cadre du vieillissement. Ces avancées fondamentales pourront permettre d’imaginer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour favoriser la cicatrisation des plaies chroniques, qui sont un enjeu clinique majeur du 21eme siècle.

Procédures

Les animaux seront bléssés aux oreilles par un punch stérile sous anesthésie générale. La cicatrisation de leur blessure sera ensuite observée pendant de 1 à 21 jours. Certains animaux subieront trois injections péritonéales . De plus, parmi ces animaux, certains subieront une injection intravasculaire sous anesthésie, en présence d'un collyre antalgique, avant de subir une exsanguination partielle et d’être sacrifiés par dislocation cervicale toujour sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Des expériences précédentes nous ont permis d’observer que les biopsies d’oreilles ne s’infectaient quasiment jamais et n’induisaient pas de phénotype dommageable. Nous n’avons pas observé non plus de signes de démangeaisons et pensons qu’il s’agit du modèle le moins invasif possible pour étudier la cicatrisation de la peau chez la souris. Cependant, il existe un risque très rare que les oreilles des souris développent une légère infection au niveau de la blessure, qui semble associée à des combats ou des grattages importants. Notre expérience d’injection intrapéritonéale de toxine diphtérique chez la souris nous a montré qu’aux doses utilisées il n’y avait aucun effet détectable sur la santé ou le comportement des souris. L’injection intraveineuse pour le marquage intravasculaire est très bien décrit, nous l’avons déjà utilisé sans que cela n’ait entrainé un phénotype détectable chez les animaux. Il s’agit d’une procédure sous anesthésie sans réveil.

Devenir

Les analyses prévues nécessitent la mise à mort des animaux pour leur prélever leur sang et/ou leurs oreilles.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer ces animaux pour étudier le rôle des basophiles dans la cicatrisation cutanée. Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. De plus les basophiles sont des cellules circulant dans le sang. Il est donc impossible de remplacer l'étude la cicatrisation in vivo par l'étude de la cicatrisation d'explants de peau.

Réduction

L’étude de la cicatrisation au niveau de l’oreille nous permet de considérer chaque oreille comme un « individu unique » afin de diviser par deux le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse de la puissance statistique nous apprend que la comparaison de groupes de quatre oreilles peut nous permettre d'observer une variation moyenne de 50% avec une puissance de 84%. Répéter chaque expérience une deuxième fois nous permettra de confirmer nos observations, de regrouper nos résultats et d’observer une variation moyenne de 30% avec une puissance de 80%, ce qui semble suffisant pour représenter un effet biologique concret. Il est nécessaire de rajouter une marge de 10% sur le nombre d’échantillons afin d’éviter toute place du hasard dans notre évaluation statistique. Ainsi il apparait que l’utilisation de groupes de 10 oreilles soit 5 individus serait optimale pour étudier nos variables d’intérêt. Nous estimons que cette analyse est également valable pour les individues agés.

Raffinement

Nous pouvons étudier la cicatrisation en réalisant une biopsie stérile de 2mm de diamètre sur l’oreille des souris. Cette procédure légère est couramment utilisée pour identifier les animaux en animalerie, ou pour faire des microprélèvements de peau humaine. Dans le but d’éviter de générer toute forme de douleur, cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. La cicatrisation (inflammation, réépithélialisation, revascularisation, fibrose), le recrutement et le profil des basophiles et des macrophages et leur sécrétion de molécules peuvent être facilement observés par différentes techniques. Des modèles de souris modifiées au niveau des basophiles (déficientes ou dont les basophiles ne peuvent exprimer certains facteurs) permettront d’apporter des réponses précises à nos hypothèses en évitant d’utiliser des méthodes invasives. Les prélèvements de sang se feront uniquement post-mortem, avant de prélever d’autres organes. Nous étudierons l’influence des basophiles sur les 3 premières semaines de cicatrisation de la peau. Les interventions expérimentales sur animaux vivants se limiteront à l’administration quotidienne (orale ou intrapéritonéale) de traitements connus à des doses inoffensives, pour au maximum quatre jours consécutifs. Le bien-être de tous les individus sera relevé quotidiennement pendant ces traitements à l’aide d’une grille d’évaluation incluant une mesure de poids, l’observation de la posture (prostration, poil hérissé) du comportement et de l’évolution de la plaie. Ces différentes observations nous permettrons de déterminer le point-limite entrainant l’arrêt des expérimentations pour les individus concernés. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, et leurs organes analysés. Aucun traitement induisant la mort ou une souffrance soutenue de l’animal n’est prévu dans le présent projet. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Ils sont élevés en conditions standardisées en accord avec la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons de nidification ou tunnels en plastique) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Même si aucune des procédures ne doit induire de souffrance/mal-être manifeste de l’animal, en cas d’observation de tels signes les animaux concernés seront euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’utiliser des modèles animaux génétiquement modifiés qui nous permettent d’étudier le rôle du basophile in vivo. Ceux-ci n’existent qu’en modèle murin. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines (45 individus). 5 animaux seront utilisés âgés car l’intérêt de l’étude et d’observer le rôle des basophiles dans le défaut de cicatrisation associé au vieillissement (de 75 à 85 semaines).