Les projets approuvés

Pour produire directement dans le corps des cellules immunitaires modifiées censées attaquer les tumeurs, 1 770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes et de tumeurs. Chacune reçoit des injections dans la tumeur sous anesthésie, au moins six prises de sang et cinq séances d'imagerie, pendant que la tumeur grossit. Le porteur ramène ces atteintes à un inconfort modéré et transitoire, et décrit la croissance tumorale comme une gêne progressive. Les souris seront mises à mort dès qu'un volume tumoral maximal sera atteint, seuil dont le RNT ne donne pas la valeur.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle approche de traitement du cancer visant à activer directement, dans l’organisme, certaines cellules du système immunitaire pour qu’elles reconnaissent et détruisent les cellules tumorales. Contrairement aux méthodes actuelles, qui nécessitent de modifier ces cellules en laboratoire avant de les réinjecter, cette stratégie permettrait de produire ces cellules directement dans le corps, de façon plus simple et potentiellement plus rapide. Les travaux seront réalisés chez la souris, dans des modèles de tumeurs, afin de reproduire au mieux certaines situations observées chez l’humain. Dans un premier temps, l’objectif est de vérifier que cette approche permet bien de produire ces cellules immunitaires modifiées dans l’organisme, et qu’elles sont capables de fonctionner correctement. Les chercheurs étudieront notamment leur capacité à reconnaître et attaquer les cellules tumorales, leur répartition dans le corps, leur durée de présence, ainsi que leur tolérance par l’organisme. L’état de santé des animaux sera suivi attentivement afin de détecter d’éventuels effets indésirables. Dans un second temps, l’efficacité de cette approche sera testée sur différents types de tumeurs. Les stratégies les plus prometteuses seront sélectionnées, puis éventuellement combinées avec d’autres approches visant à renforcer la réponse immunitaire. L’efficacité du traitement sera évaluée en suivant l’évolution des tumeurs et la capacité des cellules immunitaires à pénétrer dans celles-ci. Ce projet permettra de mieux comprendre le potentiel de cette nouvelle approche et de déterminer si elle pourrait, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements contre les cancers, en particulier les tumeurs solides.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre et évaluer une nouvelle approche de traitement du cancer, qui consiste à produire directement dans l’organisme des cellules capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales. Cette stratégie pourrait représenter une alternative aux méthodes actuelles, qui sont plus complexes et nécessitent de manipuler les cellules en laboratoire avant de les réinjecter au patient. Les résultats attendus permettront tout d’abord de vérifier que cette approche fonctionne réellement, c’est-à-dire que ces cellules sont bien produites dans le corps et qu’elles sont capables d’agir contre les tumeurs. Le projet permettra également d’identifier les approches les plus efficaces parmi plusieurs options testées, et de mieux comprendre leur comportement dans l’organisme, notamment leur répartition, leur durée de présence et leur tolérance. Dans un second temps, l’efficacité de cette stratégie sera évaluée sur différents types de tumeurs, afin de confirmer son potentiel dans des situations variées et proches de la réalité des cancers humains. Certaines combinaisons de stratégies pourront aussi être testées pour voir si elles permettent d’améliorer encore les effets du traitement. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles formes d’immunothérapie plus simples à mettre en œuvre, potentiellement plus accessibles et moins coûteuses que les traitements actuels. Il pourrait également ouvrir la voie à de nouvelles solutions pour traiter les tumeurs solides, pour lesquelles les options restent aujourd’hui limitées.

Procédures

Injection intra tumorale sous anesthésie : 2 x 5 minutes = 10 minutes Manipulation pour mesures et pesées sur animaux vigiles : 2 x 1min / semaines Prélèvements de sang sur animaux anesthésiés : 6 prélèvements de sang minimum x 2 min = 12 minutes Imagerie sur animal anesthésié : 5 mesures minimum x 10 min = 50 min

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées dans ce projet peuvent entraîner un inconfort modéré et transitoire chez les animaux. Les injections et les prises de sang répétées peuvent générer un stress passager. L'activation du système immunitaire induite par le traitement peut provoquer une légère baisse d'activité ou une perte de poids temporaire. Dans les expériences impliquant des tumeurs, la croissance de celles-ci peut entraîner une gêne progressive. Des phénomènes inflammatoires liés à l'activation des cellules immunitaires modifiées sont également possibles. L'ensemble de ces effets sera surveillé attentivement tout au long de l'étude, et des mesures adaptées seront prises dès l'apparition de tout signe de détresse.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car des organes/tumeurs seront récupérés.

Remplacement

Les méthodes alternatives, telles que les modèles cellulaires ou informatiques, ne permettent pas de répondre aux questions posées par ce projet. En effet, étudier comment des cellules immunitaires modifiées se développent, se déplacent et agissent dans l'organisme nécessite un système vivant complet. Les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire, les organes et les tissus ne peuvent pas être reproduites en laboratoire ou par simulation informatique. L'utilisation d'un modèle animal est donc indispensable pour évaluer l'efficacité et la tolérance de cette approche dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été calculé de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Dans un premier temps, de petits groupes de 5 animaux sont utilisés pour identifier rapidement les approches les plus efficaces et éliminer celles qui ne fonctionnent pas. Dans un second temps, des groupes de 10 animaux sont constitués pour évaluer l'efficacité du traitement sur des tumeurs, un effectif nécessaire pour tenir compte de la variabilité biologique de ces modèles. Cette approche progressive permet de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire à chaque étape du projet.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été conçues afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les manipulations (injections, prélèvements sanguins, imagerie) seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, selon des protocoles standardisés. Les prélèvements sanguins respecteront les volumes et fréquences recommandés. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie adaptée afin de limiter le stress et les mouvements. Dans les modèles tumoraux, une surveillance clinique régulière sera mise en place, incluant le suivi du poids, de l’état général et du comportement. Des points limites stricts seront appliqués, notamment en cas d’atteinte d’un volume tumoral maximal ou d’altération de l’état général. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation (5 par cages) , avec enrichissement du milieu (tunnel et frisotis + ajout d’un morceau de bois à ronger si nécessaire).

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus adaptée à ce projet car elle est largement utilisée en recherche sur le cancer et le système immunitaire, et de nombreux outils scientifiques sont disponibles pour ce modèle. Les tumeurs utilisées sont spécifiquement compatibles avec les souris employées, ce qui permet de les étudier dans un organisme avec un système immunitaire intact et fonctionnel, proche des conditions réelles. Des souris jeunes adultes, âgées d'environ 7 semaines, seront utilisées. Cet âge correspond à un système immunitaire pleinement mature, garantissant des résultats fiables et reproductibles. Dans la première partie du projet, les animaux seront âgés d'environ 11 semaines en fin d'expérience. Dans la seconde partie, impliquant des tumeurs, la durée de suivi sera adaptée à la vitesse de croissance des tumeurs étudiées.

166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées au plus tard quatre-vingts jours après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une irradiation corporelle totale de 2 Gy, une à deux injections de cellules leucémiques humaines et une injection intrapéritonéale par semaine, et 130 d'entre elles sont saignées trois fois. La progression tumorale attendue entraîne une baisse d'activité, une perte de poids et des tumeurs abdominales, le porteur écrivant que les souris ne seront pas gardées au-delà de ce délai pour leur éviter de souffrir. Il qualifie ce modèle de "mondialement reconnu" et d'"indispensable" pour valider toute étude préclinique de thérapie cellulaire humaine.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

200 souris immunodéprimées se voient greffer des tumeurs humaines puis injecter des cellules CAR-T, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur a régressé, une reprise de croissance étant jugée toujours possible. Elles peuvent développer une gêne respiratoire ou une paralysie des membres arrière selon la tumeur implantée. Le porteur présente le passage in vivo comme "incontournable" après des essais sur cellules.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer. . Le projet se déroule dans 2 EU différents.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du sein et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d’accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue (EU1). Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions (EU1). Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Des imageries par bioluminescence nécessiteront des injections de luciférine qui se feront en IP sur animal vigile (EU2). Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront mis à mort après anesthésie générale à l’isoflurane (EU2).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peut occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisances comme une nécrose pourrait apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 1500 mm3 pour les tumeurs sous cutanées). L’apparition de gêne respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une parésie des membres arrière peuvent être observées (pour la tumeur Raji).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une puissance statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées trois fois par semaine pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur. De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

Irradiées puis soumises à une lymphodéplétion chimique pour accepter la greffe, les souris de ce projet portent un lymphome B implanté. Elles sont 1 152, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, une irradiation, une injection de cellules CAR-T, des injections d'inducteur et d'anticorps, puis une prise de sang. Le porteur indique que les souris traitées contrôlent d'abord la tumeur avant de rechuter, ce qu'il présente comme une bonne reproduction de l'échec observé chez la moitié des patients, et conclut à la mise à mort de tous les animaux pour analyser leurs tumeurs.

Objectifs

Les lymphomes B représentent le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde occidental et le 9ème cancer le plus mortel. Il touche environ 15 000 personnes par an en France. Malgré les progrès des traitements conventionnels (chimiothérapie, immunothérapie), une part significative des patients ne répond pas aux traitements ou rechute quelques mois après. La première ligne de traitement repose sur de la chimiothérapie. En cas de non-réponse à ce traitement, la deuxième ligne de traitement repose sur une immunothérapie dite de thérapie cellulaire génique : les cellules CAR-T : des lymphocytes T du patient reprogrammés au laboratoire puis réinjectés. Ce protocole a pour but d’aider le système immunitaire du patient à reconnaître et tuer les cellules tumorales . Ce traitement à été révolutionnaire, mais encore 50% de ces patients ne répondent pas ou rechutent rapidement. Il a été démontré un épuisement rapide de ces cellules CAR-T après l’injection chez le patient, qui peut être expliqué par un microenvironnement tumorale très immunosuppressif notamment causée par un certain compartiment du système immunitaire, les cellules myloides. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser l’efficacité des cellules CAR-T afin d’augmenter le taux de succès qui est actuellement de 50%.

Bénéfices attendus

Modification : Pour le lymphome (1) , nous avons réalisé différents protocoles incluant différentes concentrations de CAR-T cells. Nous avons démontré que 6x10^5 CAR-T était la concentration la plus adéquate afin d’avoir un contrôle tumoral maximal. Cependant, certaines souris répondent de manière partielle avec une rechute systématique de la tumeur. Ainsi notre modèle murin actuel reproduit bien ce qui se passe chez l’homme, le traitement par cellules CAR-T est efficace initialement, mais les souris vont présenter une rechute. Pour le lymphome (2) la quantité de CAR-T cells injectée se base la littérature. Ces modèles permettent donc d’évaluer des stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la réponse au traitement des Lymphome Diffus à Grandes Cellules B indépendemment de leur origine génétique. L’idée d’une partie de ce projet est ainsi de modifier ces CAR-T et d’étudier cette nouvelle dynamique de contrôle tumorale. Le bénéfice sera de trouver la nouvelle version du CAR-T permettant un contrôle tumoral maximal et ainsi obtenir une meilleure survie chez l’animal, sans rechute. Fin de modification

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux incluront : Injection unique de cellules tumorales (durée : 1 minute, anesthésie locale). Irradiation (durée : 5 minutes, vigile sans anesthésie car non douloureuse). Injection de cellules CAR-T (durée : 2 minutes).sous anesthésie générale . Injection de l'inducteur (Durée 1 min sous anesthésie anesthésie locale). Injection des Anticorps ( Durée 1 min, anesthésie locale). Prise de sang unique (durée : 2 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Modification Les animaux auront un type de cancer appelé lymphome, ce qui peut entraîner fatigue, perte de poids modérées. L'irradiation à faible dose et la lymphodépletion avec injection de cyclophosphamide sont bien tolérée et ne provoque pas d’augmentation des infections. Le syndrome de libération de cytokines a été jugé modéré dans les études précédentes et sera surveillé attentivement. Fin de modification

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en raison de la présence de tumeurs et afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour : •Étudier l’interaction entre la totalité du microenvironnement tumoral et les cellules CAR T. •Il est également intéressant d’étudier les différentes populations immunitaires (notamment compartiment myéloide) dans la moelle osseuse et leur dynamisme après l’injection des CAR-T •Observer l’impact de la modulation du compartiment myéloïde sur la réponse tumorale. Ces différentes études cruciales ne peuvent pas être réalisées par des modèles in vitro ou ex vivo. Il faut pour cela un organisme entier. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro ou d’organoïdes associant cellules tumorales, cellules myéloïdes et cellules CAR-T. L’ensemble des publications dans ce domaine repose sur de l’expérimentation animale. Des modèles organoïdes sont effectivement importants à développer, mais ne sont actuellement pas du tout disponibles.

Réduction

Le nombre de souris est limité au minimum possible. Un calcul de puissance a permis de déterminer ce nombre. L’utilisation de logiciels d'aide à la conception et de statistiques nous ont permis d’optimiser ces données. Des méthodes statistiques seront également utilisées pour exploiter les résultats.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes) des procédures expérimentales sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections simples seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des points limites stricts ont été définis et seront appliqués. La surveillance des animaux en procédure sera faite par un examen clinique quotidien.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines.

Jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale, chacune précédée d'une injection sur animal vigile, et six à sept prélèvements de sang sans anesthésie : 101 souris femelles dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques humaines leur sont injectées, puis des cellules CAR-T dites universelles, cette version modifiée du projet doublant les injections du médicament qui facilite la prise de greffe. Le porteur annonce de probables maux de tête et nausées, et un déficit moteur des membres inférieurs si la tumeur atteint la moelle osseuse. Toutes sont mises à mort pour prélèvement de tissus, ou plus tôt si un point limite est atteint.

Objectifs

Notre corps possède des défenses naturelles contre les maladies : le système immunitaire. Celui-ci est constitué notamment de cellules tueuses, qui peuvent éliminer des cellules infectées ou anormales. Cependant lors d’un cancer, ces cellules n’ont pas forcément la capacité de reconnaître les cellules cancéreuses. Ainsi le cancer se propage. Une nouvelle approche de thérapie cellulaire, appelée CAR-T, améliore cette capacité à cibler les cellules cancéreuses. Les cellules tueuses issues d’un patient atteint d’un cancer sont modifiées génétiquement pour que celles-ci ciblent au mieux les cellules cancéreuses. Cependant, cette approche est 100% personnalisée : longue, coûteuse et incertaine. Pour contourner ces limites, nous développons une alternative : des cellules tueuses reprogrammées « universelles » issues d’un donneur sain et non pas d’un patient. Ces cellules universelles peuvent s’adapter au système immunitaire de chaque patient sans risque de rejet, rendant le traitement plus rapide et accessible. L’objectif de cette étude est de tester ces cellules universelles dans un modèle de souris afin d’observer leur comportement et leur efficacité contre le cancer. Nous voulons notamment vérifier si une modification spécifique améliore leur action anticancéreuse en bloquant un certain mécanisme biologique. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et accessibles contre le cancer, en simplifiant la production des cellules CAR-T pour une utilisation en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats positifs de ce projet pourraient aboutir à la mise sur le marché d'un nouveau médicament de thérapie cellulaire pour les patients en impasse thérapeutique. Ce médicament sera à la fois plus puissant et plus sûr que les traitements actuels, produit à des coûts drastiquement diminués (puisqu'il s'agit d'une thérapie cellulaire universelle) et donc disponibles à l'ensemble des patients qui en ont besoin. De plus, cela permettra d’avoir un modèle de souris pertinent pour les études des cellules tueuses reprogrammées.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection de cellules tumorales par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection de cellules thérapeutiques matures ou immatures par voie intraveineuse, sans anesthésie (1x/souris, durée ~5 minutes). Injection d’un médicament afin de permettre la prise de greffe des cellules thérapeutiques immatures (1x/souris MODIFICATION : 2X/SOURIS, durée ~1 minutes). Imagerie sous anesthésie générale, jusqu’à 12 fois par souris (durée ~10 minutes par session, 1x/semaine), précédée de l’injection d’un agent de détection de la tumeur sur souris vigile (jusqu’à 12x/souris, durée ~1 minute). Prélèvements sanguins, réalisés sans anesthésie (6-7x/souris, ~1 minute, 1x/2semaines) soit sous anesthésie générale (1x/souris, ~5 minutes, pour le dernier prélèvement).

Impact sur les animaux

Stress : l’ensemble des manipulations, contentions et transports peut engendrer un stress chez les souris. Douleurs légères : potentiellement présentes après injection intraveineuse (de cellules CAR-T matures, non matures) ou abdominale et prélèvements sanguins sous antidouleur. Probables maux de tête et nausée par suite du traitement avec un médicament. Altération de l’état général : possible en lien avec le développement tumoral exemple : perte de poids. Déficit moteur des membres inférieurs : possible si la tumeur atteint la moelle osseuse des membres.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car nous prélèverons des tissus post-mortem pour analyse ou si un point limite est atteint en cours de procédure.

Remplacement

Les cellules tueuses du cancer ont été étudiées en laboratoire. Cependant, la réponse du système immunitaire est très complexe, car elle implique différents types de cellules et des interactions spécifiques. Cela rend difficile d’étudier la réponse complète seulement en laboratoire. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris pour ces recherches thérapeutiques, car on ne peut pas encore se passer d'un modèle préclinique avant les essais clinique chez l'Homme. De plus, on utilise des souris modifiées et disponibles à l'achat pour avoir un système immunitaire humain, ce qui permet de tester des cellules humaines directement applicables ensuite en essai clinique. Avant d'être testées chez la souris, les cellules ont été validées dans notre laboratoire selon nos meilleures connaissances. Nous obtenons ainsi des informations qui ne peuvent être obtenues que chez la souris et nous les utiliserons pour réduire encore davantage le recours aux expérimentations animales à l'avenir.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. En effet, un outil statistique a été utilisé pour calculer le bon nombre d’animaux à utiliser. Suivre les animaux au fils du temps par des analyses répétées comme l’imagerie (grossissement de la tumeur) et le contrôle du sang entraîne une meilleure analyse de l’effet biologique, ce qui permet des expériences à haute puissance avec un faible nombre de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi quotidien des animaux afin de d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Des points limites clairs sont définis pour arrêter le projet afin de limiter la souffrance des animaux. Un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie de l’animal sera mis en place et du gel hydratant oculaire sera appliqué afin d’éviter un dessèchement lors des séances d’imagerie. Les animaux seront placés sous anesthésie générale et auront des antidouleurs adaptés. De plus, ce projet fait suite à une étude bibliographique afin de raffiner au maximum les expériences, les injections et les prélèvements. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Nous utiliserons exclusivement des souris femelles génétiquement modifiées dépourvues de système immunitaire. Ces modèles permettent la greffe de cellules humaines, le développement d’un système immunitaire humanisé, ainsi que la croissance de tumeurs humaines. En plus de leur grande sensibilité aux agents pathogènes, nécessitant des conditions d’élevage en milieu stérile, ces souris présentent une apparence et un comportement comparables à ceux de leurs congénères non modifiées. Le choix d’utiliser uniquement des femelles est motivé par nos observations expérimentales précédentes: chez les femelles, les tumeurs se développent de manière plus régulière, homogène et prévisible, ce qui améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Des souris âgées de 4-8 semaines sont utilisées, afin d’observer si le développement des cellules humaines s’effectue de manière plus optimale en l’absence d’interaction avec les cellules immunitaires de souris.

Aucune souris ne sera gardée vivante au-delà de quatre-vingts jours après l'injection des cellules leucémiques, ni si son état atteint un point limite. 166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une irradiation du corps entier, puis des cellules leucémiques humaines dans la veine, une injection hebdomadaire dans le ventre et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang étalées sur neuf semaines, en restant éveillées à chaque fois. Le porteur attend une perte de poids et des tumeurs abdominales, et cherche à montrer qu'un type de cellules immunitaires modifiées s'épuise moins vite qu'un autre, une comparaison dont il renvoie les retombées cliniques à un second temps.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

Injectées de cellules de lymphome T dans la veine ou directement dans la rate au cours d'une chirurgie, 743 souris immunodéprimées enchaînent ensuite jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale et cinq prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le développement de la tumeur peut provoquer un gonflement de l'abdomen et un déficit moteur des membres postérieurs. L'objectif est de mesurer l'efficacité de cellules CAR-T modifiées pour persister plus longtemps dans l'organisme, avec une production en laboratoire espérée d'ici cinq à dix ans. Toutes sont tuées à l'issue, leur sang et leurs organes prélevés pour compléter l'analyse d'efficacité et d'innocuité.

Objectifs

Les cellules CAR-T correspondent à un nouveau type de traitement qui utilise les cellules immunitaires du patient pour attaquer la tumeur, après modifications génétiques au laboratoire. Ces traitements ont révolutionné la prise en charge de certains cancers du sang et l’enjeu principal actuel est d’étendre l’utilisation de ces thérapies à d’autres types de cancer. Dans ce projet, nous nous intéressons à un cancer du sang rare, les lymphomes T, et nous avons développé un nouveau type de cellules CAR-T pour tenter de guérir cette maladie extrêmement agressive sans véritable traitement efficace à ce jour. Ces cellules CAR-T s’attaqueront spécifiquement à la tumeur grâce à des modifications génétiques additionnelles, qui leur permettront de persister plus longtemps dans l’organisme pour une meilleure efficacité. Les objectifs principaux de cette étude sont : - Évaluer l’efficacité antitumorale de ces nouvelles cellules CAR-T dans différents modèles murins et définir la dose minimale efficace, - Valider notre stratégie de modification génétique pour améliorer l’efficacité de ce traitement, - Évaluer la sécurité d’emploi de ce nouveau traitement. Ces résultats permettrons ensuite de valider l’évaluation de ce traitement chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats in vivo générés dans le cadre de ce projet sont extrêmement importants pour valider le transfert de cette thérapie vers la clinique. L’objectif à moyen terme est de produire ces cellules CAR-T dans des laboratoires de recherche d’ici 5 à 10 ans, afin de proposer aux patients atteints de ces cancers du sang rares un traitement innovant potentiellement curatif.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Injection des cellules tumorales par voie intra veineuse, sous anesthésie générale (1x/souris, 5 minutes) - Injection des cellules tumorales dans la rate par voie chirurgicale, sous anesthésie générale (1x/souris, 15 minutes) - Imagerie sous anesthésie générale (maximum 12x/souris, 10 minutes), précédée de l’injection d’un produit de révélation de la tumeur sur souris vigile (maximum 12x/souris, 1 minute) - Prélèvements sanguins sous anesthésie locale (4x/souris, 5 minutes) ou anesthésie général (1x/souris, 5 minutes).

Impact sur les animaux

- Stress : l’ensemble des procédures, contentions et transports peuvent générer un stress chez la souris. - Douleurs légères : après injection intra veineuse ou abdominale, chirurgie, et prélèvement de sang. - Altération de l’état général : en lien avec le développement de la tumeur ou d’un éventuel effet secondaire du traitement. - Gonflement abdominal : en lien avec le développement de la tumeur. - Déficit moteur des membres inférieurs : en lien avec le développement de la tumeur. - Infection post-opératoire : en lien avec la chirurgie, risque nul en condition d’asepsie stricte. - Mauvaise cicatrisation : en lien avec la chirurgie, risque faible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale. En effet, les animaux ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres procédures après l'injection de cellules tumorales. Le sang et les organes seront collectés lors de la mise à mort finale afin de compléter l’analyse de l’efficacité et de l'innocuité du traitement.

Remplacement

Ces nouveaux traitements basés sur l’utilisation des cellules immunitaires pour attaquer la tumeur sont préalablement testés in vitro à l’aide de lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces résultats préliminaires nous permettent de déterminer les doses et les conditions d’intérêt à étudier plus en détail in vivo afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser par la suite. Néanmoins, les tests in vitro ne sont pas suffisants pour récapituler l’ensemble des mécanismes dynamiques immunitaires en jeu avec ces immunothérapies, ainsi que leurs effets multi-organes. Les expérimentations sur les animaux sont donc indispensables avant de passer aux études chez l’homme afin d’évaluer au mieux leur efficacité mais également leur profil de tolérance.

Réduction

Méthodologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : - Évaluation in vitro approfondie sur les lignées cellulaires pour sélectionner un nombre restreint de conditions d’intérêt et de doses à tester pour l’étude in vivo. - Évaluation du nombre souris nécessaires et suffisantes pour garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables, à l’aide d’outils statistiques. - Utilisation d’un même groupe de souris contrôles non traitées pour évaluer l’efficacité de différents traitements CAR-T - Recueil du maximum d’information à partir de chaque animal, avec analyse chez un même animal de plusieurs paramètres : tests sanguins, imagerie longitudinale. - Les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi fréquent et adapté des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel animalier lors du change et les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et après application d’anesthésiques locaux. L’imagerie se fera sous anesthésie et les souris seront placées sur plateau chauffant pendant le suivi et pour le réveil afin de limiter l’hypothermie. Les chirurgies seront faites sous anesthésie et les souris recevront un analgésique, avant et jusqu’à 48h après la chirurgie. La chirurgie et le réveil se referont sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées régulièrement en post-opératoire afin de prévenir tout risque d’infection jusqu’à cicatrisation. Aucune chirurgie ne sera réalisée le vendredi pour permettre le suivi de 48h en semaine. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et extrapolables à l’homme. C’est également l’espèce où le plus d’outils sont actuellement disponibles pour permettre une étude approfondie et de répondre à notre question de recherche. Les souris immunodéprimées ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer et étudier le développement des cancers du sang et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies cellulaires. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 12 semaines en début de procédure, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire, et la tolérance au traitement est la meilleure. Cela permet aussi de comparer nos données aux autres données de la littérature qui utilisent de façon uniforme ces souris aux mêmes âges.

La moitié des souris utilisées est immunodéprimée, dépourvue de lymphocytes T et B matures, ce qui garantit selon le porteur une prise tumorale dans 100 % des cas. 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une injection sous-cutanée de cellules de corticosurrénalome puis une injection de lymphocytes modifiés par voie rétro-orbitaire, avant six mesures de tumeur au pied à coulisse ou huit échographies avec rasage des flancs. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer une douleur modérée et des métastases, et compte l'usage de souris immunodéprimées parmi ses mesures de réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Le carcinome corticosurrénalien (CCS), est un cancer agressif avec environ 35 % des patients présentant des métastases au diagnostic. Le mauvais pronostic du CCS peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients de CCS à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Malgré des traitements lourds, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, ont de faibles chances de survie à long terme. Des analyses préliminaires ont permis de mettre en évidence que la protéine CD276 est surexprimée dans les CCS de patients et que cette surexpression est associée à une diminution de la survie globale. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’utiliser des lymphocytes T modifiés génétiquement (cellules CAR [Chimeric Antigenic Receptor]-T) dans le but de reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. Ces expériences seront réalisées sur un modèle simple (souris immunodéficientes) pour la preuve de concept puis dans un modèle plus complexe de souris génétiquement modifiées reproduisant les deux altérations génétiques les plus fréquemment retrouvées chez les patients porteurs des CCS agressifs.

Bénéfices attendus

Le carcinome corticosurrénalien est un cancer agressif et de mauvais pronostic, dû au manque de thérapies efficaces. La réalisation de ce projet nous permettra d’évaluer le potentiel antitumoral de lymphocytes T modifiés génétiquement pour reconnaître CD276 exprimé à la surface des cellules cancéreuses puis de les éliminer. L’objectif de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique qui permettra à terme, d’améliorer le traitement et la survie des patients.

Procédures

- Procédure 1, sur les 24 souris : Rasage sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection sous-cutanée des cellules tumorales sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Injection intra-veineuse des cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs au pieds à coulisse. Durée 1min, 6 fois - Procédure 2, sur les 24 souris: Injection intra-veineuse des cellules cellules CAR-T sous anesthésie gazeuse. Durée 5min, 1 fois. Mesure des tumeurs par échographie sous anesthésie gazeuse + rasage des flancs. Durée 30min, 8 fois.

Impact sur les animaux

Dans la procédure 1, l’injection sous-cutanée des cellules dérivées de corticosurrénalome murin, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur légère et de courte durée au site d’implantation. La mesure des tumeurs au pied à coulisse n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger dû à la contention de l’animal. L’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. Enfin la croissance tumorale peut engendrer une douleur/gène modérée. Dans la procédure 2, l’injection par voie retro-orbitaire des cellules CAR-T, réalisée sous anesthésie gazeuse, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. L’échographie, réalisée sous anesthésie gazeuse, n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Le modèle murin de CCS avancé utilisé présente un développement tumoral et éventuellement des métastases.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer les nouvelles approches de traitement des corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro. Ainsi les premiers tests de spécificité et d’efficacité des cellules CAR-T CD276 seront réalisés sur une lignée de cellules dérivées d’un CCS métastatique, dans des conditions de culture optimales. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour des expériences de cytométrie en flux et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. En procédure 1, l’utilisation de souris immunodéficiente permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure. Cette procédure nous permettra de vérifier que les cellules CAR-T survivent, prolifèrent et s’attaquent bien aux tumeurs le tout dans d’un modèle plus rapide et à effets indésirables moins important qu’un génotype créant des tumeurs agressives. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’établissement de notre preuve de concept. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Plus précisément, les souris immunodéficientes seront hébergées dans une zone dédiée aux animaux immunodéficients avec armoire ventilée, couvercle de cage filtrant, litière autoclavée et eau filtrée. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de batons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.

Choix des espèces

Choix des espèces : Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Pour la procédure 1 nous utiliserons une souche de souris immunodéprimée, caractérisée par une absence de production de lymphocytes T et B matures. L’utilisation de cette souche permet une croissance tumorale dans 100% des cas, contrairement à l’utilisation de souris immunocompétentes et une survie/prolifération des cellules CAR-T supérieure ce qui in fine permet de résuire le nombre d’animaux utilisés. La lignée murine utilisée pour la procédure 2 est un modèle préclinique murin pertinant de corticosurrénalome métastatique reposant sur l’invalidation surrénalienne de deux gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients portant les corticosurrénalomes les plus agressifs. Stades de développement : Pour la procédure 1 nous injecterons les cellules dérivées d’un CCS métastatique murin dans les souris à l’âge de 6 semaines, âge où le système immunitaire est mature, puis les cellules CAR-T 7 jours plus tard. La croissance tumorale sera suivie pendant 14 jours supplémentaires soit un âge final de 9 semaines au moment de l’euthanasie. Pour la procédure 2, nous avons montré que notre modèle préclinique murin développe des corticosurrénalomes agressifs à partir de 4 mois et que la dissémination métastatique est évidente à 6 mois. Nous effectuerons donc le traitement avec les cellules CAR-T à 4 mois et effectuerons le suivi longitudinal de la progression tumorale par échographe jusqu’à 6 mois.