Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques chez la souris dans un modèle d’inflammation de type 2 induit par cytokines
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des clients extérieurs apportent leurs molécules candidates, s'engagent à avoir validé leur toxicité in vitro, et le porteur les teste ensuite sur une inflammation provoquée chez la souris par injection de cytokines. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements immunologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque souris peut recevoir jusqu'à 36 administrations de composés et de cytokines, jusqu'à deux par jour selon la voie, et jusqu'à neuf prélèvements sanguins effectués sur animal vigile, l'injection de cytokines déclenchant une inflammation douloureuse qui peut faire perdre du poids. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour ce type d'essai, et ajoute que ses clients s'engagent à recourir à l'expérimentation animale faute d'autre solution à leur connaissance.
Objectifs
Les maladies inflammatoires de type 2, telles que l’asthme sévère et la dermatite atopique, reposent sur des mécanismes immunologiques complexes impliquant à la fois des signaux initiateurs et des voies d’amplification. Malgré les avancées thérapeutiques, un besoin médical important persiste pour les patients qui ne répondent pas suffisamment aux traitements actuels. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant l’inflammation de type 2 dans un modèle murin pertinent et reproductible. Le modèle repose sur l'administrationde molécules actives du système immunitaire. Ce modèle permet d’activer de manière contrôlée les voies immunitaires clées impliquées dans l’inflammation de type 2, reproduire des caractéristiques physiopathologiques observées chez l’Homme, et modéliser à la fois les phases d’initiation et d’amplification de la réponse inflammatoire. Les molécules candidates seront administrées selon des schémas préventifs et/ou thérapeutiques afin d’évaluer leur efficacité à réduire les marqueurs d’inflammation, leur impact sur les voies immunitaires ciblées et leur potentiel à moduler des axes clés.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des données précliniques essentielles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies inflammatoires de type 2. Les bénéfices attendus concernent la validation de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans les phases d’initiation et d’amplification de l’inflammation, la démonstration de l’efficacité de molécules candidates dans un modèle in vivo pertinent. À terme, ces études pourraient conduire à améliorer la prise en charge des patients atteints d’asthme sévère ou de dermatite atopique modérée à sévère, réduire la fréquence des exacerbations respiratoires et des poussées cutanées et proposer des traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients insuffisamment contrôlés par les thérapies actuelles.
Procédures
Prélèvements de sang : maximum 9 prélèvements (3 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/souris). Administrations de composés + cytokines : maximum 36 administrations (2x/semaine à 2x/jour selon la voie d’administration; 30 secondes/souris).
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal, la douleur pourra générer une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourront provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Pour les traitements en gavage, aucune douleur n'est attendue mis à part un léger stress (quelques secondes) lié à la contention des animaux. Le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire les douleurs inflammatoires.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation de type 2 chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Ces nouvelles thérapies sont en premier lieu testées et validées sur des lignées cellulaires afin de sélectionner les doses à appliquer in vivo pour l'étude d'efficacité. Cependant, les méthodes substitutives à l’expérimentation animale ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament, tests nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires. Nos clients s'engagent à ce que la toxicité des composés ainsi que du véhicule fourni soit validée in vitro sur des modèles pertinents avant leur passage en étude in vivo. Ils s’engagent également à recourir au modèle animal car il n’existe pas à leur connaissance d’autre modèle à même d’évaluer l’efficacité de leur molécule.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (10 souris/groupe) pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 2 variables. Le nombre d’animaux a été minimisé tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour détecter l’effet biologique attendu entre le groupe contrôle sain et les groupes malades, caractérisé par une différence significative.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec des enrichissements que nous ferons varier au cours de l’étude : cylindres de coton, des frisures kraft ainsi que des dômes/tunnels et objet de rongeage en bois dès leur arrivée. Cela permettra de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal. Une grille de score avec des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, un analgésique sera administré et des croquettes humides seront ajoutés dans les cages. Si une amélioration est observée 24h après, et que l’animal est toujours en surveillance renforcée, l’administration d’analgésique pourra être renouvelée (renouvelable à partir de 8h si besoin, sous avis vétérinaire). Dans le cas contraire, l’animal sera mis à mort. Dans le cas d'une analyse de la capacité pulmonaire, la pléthysmographie sera effectuée sous anesthésie générale avec administration d'un analgésique et anesthésique local. La température corporelle sera maintenue constante entre 37 et 38°C par un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développés sur les souches de souris dont les génomes possèdent 99% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendue. - La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines minimum) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature
Analyse de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire après repas dans différents modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à trois jeûnes nocturnes de douze heures, puis à des prélèvements sanguins pratiqués au niveau de l'œil sous anesthésie, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite par dislocation cervicale. Le projet compare la production d'un médiateur inflammatoire après un repas entre des souris porteuses d'une mutation rendant ce système plus actif, des souris ordinaires et des souris privées de certains éléments du système immunitaire. Le porteur qualifie la mise à jeun d'"indispensable" à la réalisation de tests métaboliques. Il justifie par ailleurs le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire "contre les infections sévères" et invoque un modèle d'infection "bien validé", alors que le protocole décrit ne comporte aucune infection.
Objectifs
L’inflammation est une réaction normale et bénéfique de l’organisme, car elle aide à lutter contre les infections et à réparer les tissus. Cependant, lorsqu’elle devient chronique ou excessive, elle peut avoir des effets néfastes et contribuer au développement de maladies métaboliques comme le diabète. Nous nous intéressons à une protéine située à l’intérieur des cellules et impliquée dans la modulation de la réponse inflammatoire. Lorsque cette protéine est activée, elle entraîne la production d’une molécule essentielle de l’inflammation, un médiateur pro-inflammatoire bien connu. Une alimentation trop riche ou un excès de nutriments peuvent activer ce système et favoriser une inflammation légère mais persistante, souvent associée à des troubles métaboliques. Notre équipe a identifié de nouveaux mécanismes qui régulent cette protéine et montré que certaines modifications chimiques de celle-ci peuvent influencer son activité. Pour mieux comprendre ces phénomènes, nous étudions des souris porteuses d’une mutation qui rend ce système légèrement plus actif. Nous comparerons leur production de ce médiateur clé de la réponse immunitaire après un repas à celle de souris normales et de souris dépourvues de certains éléments du système inflammatoire. Pour cela, les animaux subiront une période de jeûne nocturne, suivie d’une réalimentation pendant deux heures, puis d’un prélèvement sanguin destiné à analyser différents marqueurs de l’inflammation. Ces travaux visent à mieux comprendre le lien entre nutrition, inflammation et maladies métaboliques, afin d’éclairer les mécanismes en jeu et d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Plus largement, ces expériences aideront à comprendre la réponse inflammatoire transitoire après un repas et le rôle de certaines protéines dans ce processus, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements, par exemple en ciblant les médiateurs pro-inflammatoires et des protéines impliquées dans la modulation de la réponse inflammatoire.
Procédures
Chaque souris est soumise à 3 jeûnes de 12h, 6 pesées (5sec chacune) et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie (durée 5 secondes).
Impact sur les animaux
La mise à jeun pendant la nuit peut induire un certain stress chez la souris. Toutefois, cette procédure est indispensable pour la réalisation de tests métaboliques, conformément aux pratiques couramment utilisées dans ce domaine. Elle permet d’harmoniser le statut métabolique des animaux avant l’étude des marqueurs métaboliques et immunologiques après le repas. Les prélèvements sanguins au niveau de l’œil peuvent également être sources de stress ou d’inconfort. Cependant, ils seront réalisés sous anesthésie générale, complétée par l’application d’un analgésique local (pommade oculaire) afin de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans procédure seront mis à mort selon une méthode réglementaire. Les souris seront euthanasiées par la dislocation cervicale après la procédure.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ou l’utilisation d’outils informatiques ne pourraient refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’étude sur un animal entier est donc indispensable à visée exploratoire et nous utiliserons un modèle d’infection bien validés dans d’autres études..
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé. L’utilisation des mâles et des femelles limitent ainsi la perte d’animaux.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées pour réduire au maximum l’inconfort et le stress subis par les animaux. Leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans la procédure. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique. De plus, les souris seront hébergées en groupe. Les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance des animaux deux fois par semaine nous permettra d'identifier précocement tout changement physique (blessure), ou de comportement qui sont des signes de stress. Des points limites bien définis permettent de limiter la souffrance animale a minima.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie, avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement. Des modèles génétiquement modifiés sont d'ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (6 à 24 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Développement d’un candidat (immunocytokine) à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers dans un modèle de souris humanisées
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur atteignant 1 500 mm3, une baisse de mobilité, un isolement : ces signes marquent la fin de l'étude pour les souris concernées, surtout dans les groupes témoins non traités. 440 souris de sept semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et tumeurs. Chacune reçoit une greffe tumorale au flanc, sept injections intrapéritonéales, jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie, neuf pesées et une quinzaine de mesures de tumeur sur cinq semaines. L'enjeu est de départager plusieurs candidats immunocytokines et d'en retenir un, dont le développement industriel et réglementaire sera poursuivi en vue d'essais cliniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser et développer une nouvelle immunocytokine destinée au traitement de différents types de cancers, dans le but d’améliorer la réponse thérapeutique chez les patients qui échappent aux traitements actuel. Les molécules testées ont déjà montré in vitro leur capacité à augmenter fonctionnalité des cellules humaines anti-tumorales en présence du traitement actuel. Dans un premier temps, plusieurs candidats seront comparés à travers une étude pharmacocinétique, afin de sélectionner la molécule la plus prometteuse. Ensuite, le candidat retenu sera évalué, sur la base de son profil dose-réponse et de sa compatibilité avec les traitements déjà existants, permettant de reproduire plus fidèlement la réponse immunitaire et de valider son potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le meilleur candidat sera validé et son développement industriel et règlementaire sera poursuivi en vue de la réalisation d’essais cliniques. Ces nouvelles thérapies, capables de cibler plus spécifiquement les cellules tumorales, présentent une efficacité supérieure aux traitements actuels et pourraient offrir une alternative thérapeutique aux patients réfractaires au traitement actuel.
Procédures
Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (9 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 9 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intrapéritonéale candidat ou traitement actuel sur animal vigile (7 injections, 1 minutes maximum chacune, soit 7 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements max, 2 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 2/3 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement : le stress et la douleur liés aux manipulations, comprenant les traitements, les prélèvements sanguins, les pesées, ainsi que la contention nécessaire lors des injections (sous-cutanées pour l’implantation tumorale puis intrapéritonéales pour l’administration des traitements). L’injection de cellules tumorales entraîne la formation d’une tumeur au niveau du flanc des animaux. Des effets indésirables (tumeur qui atteint 1500mm3, hypomotilité, isolement) peuvent apparaître en fin d’expérimentation, en particulier chez les groupes témoins non traités par les candidats ou le traitement de référence, en raison de la progression tumorale.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des organes et tumeurs.
Remplacement
Les immunocytokines (notre molécule thérapeutique) agissent dans un environnement biologique complexe (réseau immunitaire, cellules stromales, microenvironnement tumoral, vascularisation), or ces interactions ne peuvent être correctement reproduites dans un système in vitro (culture cellulaire, organoïdes) ou simulées par modélisation informatique. Les paramètres essentiels (pharmacocinétique, biodistribution, élimination, effets immunitaires systémiques) nécessitent un organisme entier pour être évalués.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. Notre savoir-faire sur les modèles tumoraux, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe. Ainsi, 10 animaux par groupe permettent d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives de croissance tumorale ou de survie entre groupes , en tenant compte de la variabilité biologique inhérente aux modèles tumoraux syngéniques.
Raffinement
Nous assurons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur, en complément de celle réalisée par le personnel animalier. Des points limites précoces ont été définis et seront systématiquement appliqués. Lorsqu’un point limite est atteint, plusieurs mesures peuvent être mises en œuvre selon la situation : adaptation du suivi, retrait de l’animal de l’étude, ou mise à mort lorsque cela est nécessaire. Pour les injections (cellules tumorales ou traitements), nous appliquons de la lidocaïne sur le site d’injection quelques minutes avant la procédure. Les animaux sont anesthésiés localement pour les injections sous-cutanées et intrapéritonéales, et par isoflurane lors des prélèvements sanguins.
Choix des espèces
L’utilisation d'une première souche de souris est essentielle pour étudier la durée de vie et l’élimination de nos candidats, car elles portent une partie d’anticorps humaine. Chez la souris normale, ces mécanismes sont différents de ceux de l’être humain. Le modèle choisi reproduit le fonctionnement humain et permet donc d’obtenir des résultats plus proches de la réalité. Les souris de la deuxieme souche utilisée sont, elles, nécessaires pour tester l’efficacité de nos traitements lorsqu’ils sont associés au traitement actuel, un médicament qui agit uniquement sur la version humaine d’une protéine. Ce modèle permet donc de vérifier si notre traitement fonctionne comme prévu chez l’homme. Enfin, les lignées tumorales utilisées permettent d’évaluer nos candidats dans deux types de cancers : l’un résistant et l’autre sensible à ce médicament. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines (20g environ), correspondant à la phase jeune adulte. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, la croissance corporelle stabilisée et la prise tumorale reproductible. Cela limite la variabilité interindividuelle et assure la pertinence des résultats obtenus.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Exploitation de l’activité des cytokines dans des environnements chimiques tumoraux complexes pour optimiser les immunothérapies dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules tumorales pour 9 704 d'entre elles, puis traitées par une injection quotidienne pendant cinq jours, 9 934 souris vont être utilisées et toutes tuées pour prélever sang et organes. 824 sont anesthésiées deux fois par semaine pendant trente minutes pour un suivi des métastases par imagerie, 3 900 subissent des prélèvements sanguins, et 2 240 reçoivent une seconde injection de cellules tumorales soixante jours après la première. Le porteur écrit avoir écarté tout analgésique parce qu'il pourrait modifier les réponses immunitaires étudiées, et compte sur des points limites pour arrêter les procédures. Toutes les atteintes décrites sont qualifiées de légères et de courte durée, sans que rien n'explique pourquoi 300 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 9 634 d'un niveau modéré.
Objectifs
Les cytokines (messagers du système immunitaire) et les thérapies cellulaires ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de divers cancers. Cependant, l’efficacité de ces thérapies peut être considérablement influencée par l’environnement chimique extracellulaire (acidité, concentration élevée de certaines molécules, température, …) En effet, l'environnement qui entoure la tumeur est caractérisé par des propriétés chimiques uniques (comme une acidité élevée) qui peuvent avoir un impact sur le fonctionnement des cytokines et des cellules immunitaires. Il a été démontré que l’environnement acide altère l’activité de certaines cytokines et nuit à l’efficacité des thérapies cellulaires. De même, la concentration élevée de certaines molécules dans l’environnement des cellules peuvent moduler la fonction des cellules immunitaires et influencer l’efficacité des immunothérapies. Comprendre comment ces facteurs modulent les messagers du système immunitaire (ou cytokines) et l’activité cellulaire est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Notre laboratoire se concentre sur l'étude de l'impact de l'environnement chimique extracellulaire sur la fonction de deux cytokines en particulier et sur les thérapies cellulaires. Nous visons à créer de nouvelles variantes de cytokines et de thérapies cellulaires optimisées pour fonctionner dans des microenvironnements spécifiques, caractéristiques des tumeurs, afin d'améliorer leur efficacité thérapeutique. Ainsi, en développant des variantes de cytokines conçues pour fonctionner de manière optimale dans ces microenvironnements spécifiques, nous visons à surmonter les limitations imposées par le microenvironnement tumoral et à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires.
Bénéfices attendus
Cette étude fournira des informations précieuses sur le rôle de l’environnement chimique extracellulaire dans l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires dans le traitement du cancer. En comprenant d’abord comment les cytokines classiques (normales) sont affectées par le microenvironnement entourant les cellules, nous serons mieux placés pour concevoir et développer des cytokines modifiées qui seront adaptées pour fonctionner de manière optimale dans des microenvironnements spécifiques. Les résultats de cette étude pourraient conduire au développement de nouvelles stratégies visant à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires, bénéficiant ainsi aux patients atteints de cancer. De plus, comprendre l’impact de cet environnement sur la fonction des cellules immunitaires et l’efficacité du traitement contribuera à notre connaissance de l’immunologie tumorale et guidera la conception d’immunothérapies plus efficaces.
Procédures
Après leur arrivée et acclimatation (7 jours), les 9934 souris seront manipulées tous les 2 jours pendant 2 semaines avant le début des procédures pour réduire leur stress et les habituer à la manipulation humaine. Nous évaluerons d'abord la sûreté de nos traitements. Pour cela, 90 souris recevront les traitements à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min) puis 1 injection d'indicateur de toxicité sous anesthésie gazeuse (10 min). Ce projet comporte plusieurs parties dont plusieurs étapes sont communes. 9704 souris recevront une injection de cellules tumorales ou métastatiques (1 min). Puis, afin d'étudier les caractéristiques de notre traitement, les 9560 souris recevront ce dernier (ou placebo) par injection à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min). Parmi ces animaux, 2240 souris (140 naïfs et 2100 déjà exposées aux cellules tumorales) recevront une nouvelle injection de cellules tumorales 60 jours après la première (1 min). De plus, 824 souris recevront une injection 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse (anesthésie: 30 min) afin de suivre le développement des métastases par imagerie. Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés sur 3900 souris (3520 prélèvements uniques + 380 prélèvements 1 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole, 3 min) En parallèle, l'ensemble de ces souris seront testées pour différents paramètres afin d'évaluer le mode de fonctionnement et l'efficacité de nos traitements. Test 1 : 1820 souris recevront 2 injections de traitement ou placebo à 3 jours d'intervalle (30 sec) Test 2 : 390 souris recevront le traitement ou placebo soit par injection 1 fois par jour pendant 11 jours soit par 1 injection tous les 3 jours jusqu'à la fin de l'expérience (30 sec) Test 3 : 900 souris recevront 2 injections de molécule d'intérêt (ou placebo) à 6 jours d'intervalle et 2700 souris recevront 1 injection de molécule d'intérêt (ou placebo) 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec) Test 4 : 50 souris recevront 1 injection d'une molécule permettant d'étudier la tumeur 13 jours après l'injection des cellules (30 sec) Test 5 : 720 souris recevront 1 injection 3 jours avant les traitements puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec). Test 6 : 160 souris seront irradiées 2 fois à 3h d'intervalle (irradiation: 10 min) puis 13 jours après l'injection des cellules et 1 jour avant le début de nos traitements, 160 animaux recevront 1 injection de cellules immunitaires (1 min)
Impact sur les animaux
Les injections de cellules tumorales entraîneront une douleur et un stress légers de courte durée et conduiront, en fonction du modèle, au développement de tumeurs pouvant entraver la liberté de mouvement des animaux. L'évolution de la pathologie induite (développement tumoral) pourrait causer une perte d'appétit et le cas échéant, une perte de poids. Les thérapeutiques envisagées seront administrées par injection ce qui entraînera une douleur et un stress légers de courte durée mais répétés à chaque administration de traitement. Les prélèvements sanguins seront source de stress pour les animaux lors de la contention et causeront une douleur et un stress légers de courte durée au moment de l'acte qui sera unique ou répété en fonction du modèle étudié.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. En effet, la récupération d’échantillons (sang, organes) est essentielle pour déterminer l’efficacité de nos thérapies.
Remplacement
Dans la mesure du possible, nous menons des études in vitro poussées pour caractériser au mieux l'activité et le profil de sécurité de nos traitements d'intérêt avant de proposer des expériences sur les animaux. Ces études comportent l'évaluation de nos traitements d'intérêt dans différents environnement, leurs effets sur différents types cellulaires et leur absence de toxicité sur les cellules. En tirant parti de ces systèmes utilisant des cellules, nous générons des données précliniques robustes sur les mécanismes d'action, la puissance et les profils de sécurité de nos traitements d'intérêt fournissant ainsi une base scientifique solide pour les études in vivo proposées. Cette approche s'aligne sur le principe de remplacement car nous utilisons avec succès des méthodes sur cellules pour remplacer une partie importante des études sur les animaux qui auraient autrement été nécessaires.
Réduction
Pour chaque test que nous effectuons chez l'animal, nous recueillons un très grand nombre de données et d'informations à travers différents paramètres d'analyse. Cette approche permet d’obtenir un maximum d’informations pour chaque animal réduisant ainsi le nombre total requis d’animaux. Nous avons effectué des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris requis par groupe pour obtenir des résultats robustes sur la base de nos données in vitro et in vivo déjà obtenues et des études publiées utilisant des modèles similaires. Pour l’analyse de nos données, nous prévoyons d'utiliser des méthodes statistiques appropriées pour analyser les différences entre les groupes de traitement. Nous utiliserons également des modèles statistiques afin de procéder au mieux à l’analyse des résultats obtenus.
Raffinement
Nous nous engageons à affiner nos protocoles et nos pratiques pour maximiser le bien-être des animaux et minimiser la souffrance et la détresse. Nos stratégies de raffinement englobent de multiples aspects du soin des animaux. Avant toute procédure, les animaux seront acclimatés un minimum de 7 jours dans leur zone d’hébergement. De plus, des actes d’habituation seront réalisés par les expérimentateurs afin de familiariser les animaux à la manipulation humaine. Tout acte pouvant entraîner souffrance, détresse ou stress sera réalisé sous anesthésie. Notre équipe examine attentivement le potentiel d'inconfort associé à chaque intervention et prend des mesures pour atténuer ces effets. Cela garantit que les animaux ne subissent pas de douleur ou de détresse inutile. Nous travaillerons également en étroite collaboration avec le personnel de l’établissement utilisateur ainsi que la structure de bien-être animal y étant rattachée afin de minimiser la souffrance et la détresse. Cela implique de maintenir des conditions environnementales appropriées et de fournir un espace et des ressources adéquats. L'enrichissement de l'environnement fera partie intégrante de notre programme de soins aux animaux. Des éléments et des structures d'enrichissement seront fournis pour permettre aux souris de présenter des comportements naturels, améliorant ainsi leur bien-être et favorisant des résultats expérimentaux plus pertinents sur le plan biologique. L’utilisation d’analgésiques a été écartée dans ce protocole car ces derniers pourraient moduler les réponses immunitaires étudiées (effets décrits dans la littérature). Pour cela, des points limites stricts et spécifiques pour chaque procédure ont été déterminés et dès l'apparition de l'un d'entre eux, les animaux seront immédiatement mis à mort afin de limiter tout stress ou souffrance.
Choix des espèces
Nous nous sommes concentrés sur le modèle murin qui a l’avantage de présenter des similitudes avec le modèle humain et pour lequel nous disposons d’un large panel d’outils moléculaires pour son étude. Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. De plus, il s’agit du modèle le plus utilisé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux des résultats. Les données disponibles dans la littérature faisant référence aux modèles de cancers que nous utilisons impliquent l'utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines d'âge. De plus, ces modèles sont bien établis au laboratoire, nous souhaitons donc garder les mêmes conditions expérimentales.
Régulation de la réponse de la microglie aux cytokines et de la clairance des dépôts amyloïdes et des agrégats de tau par le remodelage des glycanes sulfatés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le bout de leur queue est coupé sous anesthésie pour les génotyper, et 486 d'entre elles sont utilisées dans les expériences proprement dites, réparties sur cinq ans. Ces souris portent des mutations qui provoquent une maladie d'Alzheimer : le porteur indique que les petits nés de femelles porteuses du gène hAPP meurent à un taux d'environ 15 % dans les six premiers mois, et que les souris porteuses du gène Tau pèsent 15 % de moins que les autres. Le projet cherche à savoir si une enzyme dégradant certains sucres aide les cellules immunitaires du cerveau à évacuer les dépôts de la maladie, travail fondamental dont le porteur tire l'ambition d'une "nouvelle stratégie de traitement". Dans la rubrique raffinement, il écrit que les lignées utilisées "ne présentent aucun problème physique ou physiologique".
Objectifs
Le projet de recherche vise à comprendre comment les molécules cérébrales appelées glycanes sulfatés régulent l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer par les cellules immunitaires du cerveau dans des modèles de souris. Nous étudierons si un modèle de souris dont le gène d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés est augmenté ou un modèle de souris dont le gène d'une enzyme générant des glycanes sulfatés n'est pas fonctionnel dans les cellules immunitaires du cerveau, serait bénéfique pour l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer in vivo. Des études animales sont nécessaires pour examiner ces possibilités de limiter la progression de la maladie par l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés ou par l'élimination d'une enzyme génératrice ou d'une molécule de protéine présentatrice dans de cerveau de modèles murins de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
La modification des glycanes sulfatés dans les cellules immunitaires du cerveau in vivo aura un impact sur la recherche en matière de neuroinflammation et de neurodégénérescence. L'analyse des rôles régulateurs des glycanes sulfatés nous permettra de comprendre en détails les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules immunitaires cérébrales éliminent les substances responsables dans le cerveau de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse des cellules immunitaires du cerveau in vitro est applicable au criblage de composés chimiques susceptibles de potentialiser le traitement thérapeutique des patients affectés par la neurodégénérescence. Les résultats du profilage de l'expression des gènes et de la mise en évidence d'une expression génétique altérée permettraient de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques impliquées dans la cause de la maladie d'Alzheimer. Nos données déjà obtenues montrent que l'augmentation d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés améliore l'élimination des maladies cérébrales responsables de la maladie in vitro, indiquant la faisabilité du projet proposé et ouvrant la voie à de nouvelles approches pour contrôler les causes de la maladie d'Alzheimer. Les concepts innovants concernant la modification des glycanes sulfatés dans le cerveau seront étendus à un autre modèle murin de la maladie d'Alzheimer appelé tauopathie. Dans l'ensemble, notre objectif ultime est de développer une nouvelle stratégie de traitement de la maladie d'Alzheimer, afin de contribuer à l'amélioration de la santé et du bien-être, ainsi qu'au bien-être social et économique. Il s'inscrit dans la priorité nationale « Plan maladies neurodégénératives ».
Procédures
Le bout de la queue sera coupé pour le génotypage. Cette intervention sera effectuée sous anesthésie. Le nombre total d'animaux prévu pour cette intervention est de 2580. Les souris pour les experimentations seront mises à mort. L'anesthésie générale et l’analgésie seront appliquées avant l'euthanasie. Cette procédure sera effectuée pour toutes les souris nécessaires aux expériences, soit 486 souris au total sur 5 ans.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer, que nous utiliserons dans ce projet, présentent des déficits de la mémoire spatiale et de l'apprentissage. Les petits nés de femelles porteuses du gène responsable de la maladie, appelé hAPP, ont un taux de mortalité d'environ 15 % au cours des six premiers mois de leur vie. Les souris porteuses d'un autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, ont un poids réduit de 15 % par rapport aux souris non transgéniques. Elles ont un taux de mortalité d'environ 3%. La coupe de la queue pour le génotypage entrainent une douleur légère de courte durée. Les souris seront mises à mort après anesthésie et analgésie.
Devenir
Pendant la durée de la procédure, les animaux seront maintenus en vie. Puis, à la fin du protocole, les souris seront euthanasiées selon la procédure et les organes seront prélevés afin que nous puissions effectuer les expériences planifiées.
Remplacement
Des lignées de cellules immunitaires cérébrales de souris immortalisées et des essais biochimiques et biologiques seront utilisés en parallèle dans le laboratoire. Les objectifs du projet proposé sont d'étudier les effets bénéfiques d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés sur les fonctions des cellules immunitaires cérébrales et d'examiner si l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés pourrait réduire la masse des matériaux responsables de la maladie dans le cerveau des souris modèles de la maladie d'Alzheimer in vivo en facilitant l'activité soutenue des cellules immunitaires cérébrales au fil du temps. Dans cette phase, l'utilisation d'animaux est essentielle.
Réduction
Le nombre de souris est réduit en utilisant chaque hémi-cerveau pour deux expériences différentes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Ce plan expérimental a déjà été publié dans la littérature ce qui permet de réduire au minimum statistique le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de cinq dans un milieu enrichi (un bâton, un tunnel ou dôme ou papier craft) dans des cages de taille suffisante et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera surveillé tous les jours. Les différentes lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. L'ensemble des procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Elles seront menées par du personnel qualifié et formé afin d’éviter tout stress ou inconfort de l’animal et avec une attention particulière sur la gestion de la douleur. Nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en lien avec le responsable du bien-être animal. Pour cela nous observerons les paramètres critiques définis par un ensemble de points limites. Les animaux présentant un de ces paramètres critiques seront euthanasiés. Pendant toute la durée du protocole, les animaux seront surveillés et si besoin traités pour empêcher la douleur.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement utilisé pour les études sur la maladie d'Alzheimer. Les modèles murins de la maladie d'Alzheimer sont largement utilisés pour les études de recherche fondamentale. De plus, de nombreux outils sont disponibles chez la souris (anticorps, kit et appareil), permettant une exploitation maximale des tissus obtenus. Des souris âgées de 3 mois, 6-9 mois et 15-18 mois seront utilisées. Dans le modèle de souris de la maladie d'Alzheimer, qui surexprime le gène responsable de la maladie, appelé hAPP, les niveaux de matériaux responsables de la maladie dans une région particulière du cerveau, importante pour la mémoire, commencent à augmenter vers l'âge de 6 semaines. Les substances pathogènes deviennent évidentes dans les régions particulières du cerveau nécessaires à la mémoire. Ce phénotype est progressif, avec des pics importants à l'âge de 8-10 mois. Une augmentation significative de l'activation des cellules immunitaires du cerveau a été observée dans ces régions à l'âge de 6-9 mois. Dans le modèle de souris qui exprime l’autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, les matériaux responsables de la maladie qui affectent directement les cellules neuronales et provoquent une perte de mémoire commencent à apparaître vers l'âge de 6 mois. Ces phénotypes ont fait l'objet de nombreuses publications dans le monde entier et ont permis d'accumuler des données utiles pour l'étude de la maladie d'Alzheimer.
Modèle de PK/PD inflammatoire : mesure des cytokines inflammatoires produites après stimulation ex vivo de cellules immunitaires sanguines issues d’animaux traités avec des composés pharmaceutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1250
Le protocole dépend de la molécule testée et de sa pharmacologie, dans un travail de tri de candidats médicaments mené en amont d'études d'efficacité plus longues. 1 550 souris et 1 250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement une ou deux fois par jour, par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale selon le composé, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique n'attendre aucun signe clinique, tout en reconnaissant que les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus, et justifie la mise à mort par le volume de sang requis, les animaux ne pouvant "survivre décemment à une grosse ponction sanguine".
Objectifs
L’objectif est de mettre en place un modèle de pharmacocinétique/pharmacodynamique inflammatoire. Pour cela, nous quantifierons les cytokines inflammatoires sécrétées ex vivo, en réponse à des stimuli ex vivo, par les cellules immunitaires sanguines exposées aux composés in vivo ou par des cellules immunitaires sanguines de culture exposées au plasma des souris traitées in vivo.
Bénéfices attendus
Ce modèle permettra une meilleure caractérisation de nos composés thérapeutiques en établissant une relation entre la pharmacocinétique in vivo (concentration en fonction du temps) et la pharmacodynamique (effet pharmacologique en fonction du temps). Ce modèle nous aidera à mieux sélectionner nos composés avant une évaluation dans des modèles d’efficacité in vivo plus longs et plus complexes.
Procédures
Une contention douce permettra la pesée et le traitement 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Pour la même raison, l’administration pourra se faire par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale. Le prélèvement sanguin sera réalisé soit sous anesthésie et sans réveil avant mise à mort, soit après que les animaux aient été euthanasiés.
Impact sur les animaux
La douce contention des animaux nécessaire pour la pesée et le traitement, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress et un inconfort. Malgré la très bonne formation du personnel technique, il pourrait dans de rares cas y avoir des conséquences dues aux administrations ou aux prélèvements. Les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus.
Devenir
Les analyses ex vivo nécessitent beaucoup de sang total. Les animaux seront mis à mort car ils ne pourraient survivre décemment à une grosse ponction sanguine.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leurs mécanismes d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). L’intérêt de ce projet étant d’étudier l’effet du composé sur les cellules sanguines, nous ne pouvons utiliser à ce stade de modèle in vitro pertinent.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests in vitro puis cellulaires. Seules les molécules présentant une activité sur les tests cellulaires sans toxicité apparente et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été publié pour la molécule de référence de ce projet et a prouvé son intérêt scientifique. Nous utiliserons les données et les conditions utilisées pour cette molécule afin d’ajuster le nombre minimal d’animaux nécessaires. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-être Animal émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris ou par 2 à 3 rats. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge ou tunnel en carton pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposent d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Nous n’attendons pas de signes cliniques dans ce projet. Néanmoins, des critères cliniques et des points limites sont définis dans une liste pour determiner un score de suivi des signes cliniques. En cas d'atteinte de points limites et/ou d’observation de comportement non attendu, des mesures seront prises en accord avec le vétérinaire pour arrêter toute souffrance.
Choix des espèces
Les rats et souris entrent dans la plupart de nos études précliniques sur nos candidats médicaments. La concentration dans le sang des composés testés sont bien connus grâce aux études de pharmacocinétiques préalablement réalisées chez ces espèces ; ces données seront utilisées pour planifier les temps de prélèvements sanguins. Le choix de l’espèce sera choisi en fonction des caractéristiques intrinsèques des composés, selon les résultats de pharmacocinétique plus ou moins favorables entre rats et souris (des métabolismes différents induisent parfois des expositions et des cinétiques différentes). Il n’y a pas d’indication spécifique sur le choix de l’âge autre qu’une maturité immunitaire. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines pour les souris et 7 à 10 semaines pour les rats.
Evaluation de l’effet antitumoral d’une thérapie cellulaire sur la croissance tumorale et impact de l’ajout de cytokines sur l’effet de cette thérapie, dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à dix-neuf injections sous la peau, trois injections dans la veine de la queue et un prélèvement de sang : 80 souris dépourvues de système immunitaire subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur sang et leur tumeur. Chaque animal porte une tumeur humaine greffée sous la peau, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine pendant huit semaines au maximum. Le projet vise à vérifier chez la souris l'effet de cellules immunitaires modifiées qui ont déjà éliminé des cellules cancéreuses en culture, pour des cancers de l'ovaire et du sein. L'effectif de 80 animaux repose sur un "outil statistique" que le porteur ne nomme pas.
Objectifs
L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer la capacité de cellules immunitaires reconnaissant notre cible à éliminer les cellules cancéreuses des 2 types de cancer dans ce modèle de souris.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.
Procédures
Pour réaliser l’unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les injections intraveineuses (1 injection par semaine pendant 3 semaines, soit 3 IV/souris) se feront au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Pour la procédure 1, les injections sous-cutanées de la molécule de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique seront réalisées trois fois par semaine pendant 8 semaines maximum soit 19 injections sous cutanée au total. La souris est maintenue 15 secondes pour ce geste. Ces injections seront réalisées dans la procédure 2 que si elles démontrent un effet bénéfique sur l’efficacité du traitement. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales en sous-cutanée dans le flanc droit de la souris devrait entrainer une douleur temporaire et légère. A la suite de cette injection les animaux développeront des tumeurs localisées sous la peau de l’animal. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure au pied à coulisse et n’entraînera aucune douleur, à l’exception peut-être d’un léger stress temporaire. L’injection sous-cutanée de molécule de soutien des cellules lymphocytes pourrait entrainer un désagrément voire une douleur temporaire légère. L’injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées pourrait engendrer une douleur légère passagère intraveineuse. Le prélèvement sanguin peut entraîner une douleur modérée, qui est atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.
Remplacement
Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité d’une thérapie utilisant des cellules immunitaires modifiées. Les animaux sévèrement immunodéprimés correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité de ce type de traitement, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.
Réduction
La première procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée à la fois dans la procédure 2 et, par la suite, pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour garantir la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal, afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaires pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques minutes avant le prélèvement.
Choix des espèces
Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.
Etude de l’impact des inhibiteurs de points de contrôles en présence de cytokines anti-tumorales sur la réponse anti-cancéreuse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées d'une tumeur sous la peau du flanc ou directement dans la glande mammaire, 3 069 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie de trente minutes puis restent endormies deux à trois heures pour de l'imagerie, et toutes sont manipulées chaque jour pour mesurer la tumeur. Le projet cherche à comprendre pourquoi les immunothérapies ne guérissent qu'une minorité de patients, moins de 30 % selon le porteur. Celui-ci écrit que les immunothérapies ne sont pas toxiques et que la tumeur ne gênera l'animal ni pour bouger ni pour s'alimenter, tout en fixant un volume tumoral au-delà duquel la souris est tuée.
Objectifs
Ces dix dernières années, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau, etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera en une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et en orthotopique au niveau de la glande mammaire. Pour l’injection dans la glande mammaire, les souris seront anesthésiées. La piqûre d'aiguille en sous cutanée ou en orthotopique dans la glande mammaire pour l’injection de tumeur entraîne une douleur légère de courte durée. Il en est de même pour les injections en intra-veineuse des immunothérapies ou des d’autres molécules. Les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La pousse de la tumeur pourra engendrer un inconfort pour la souris qui sera léger et pris en charge.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires en 2 dimensions ou des organoïdes (structures en 3 dimensions mimant certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet un suivi longitudinal d’un même animal. Dès que possible, les différents tests seront effectuées sur les mêmes animaux et les expériences de séquençage entier ou d’ARN aussi, afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ les nombres d'animaux par groupe qui nous permettra d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale ainsi que les effets cages. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.
Raffinement
Les immunothérapies ne sont pas toxiques à la différence des traitements conventionnels. Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites précoces et spécifiques sont établis pour raffiner les procédures et les mettre à mort si le point limite est atteint. En cas de déshydratation, les souris pourront être réhydratées. Un suivi fréquent sera réalisé pour évaluer l’état de l’animal et la pousse de la tumeur. L’animal sera mis à mort si le volume de la tumeur atteint le point limite. Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui ne rencontrera aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Pour pallier l’inconfort de la pousse de la tumeur, une litière douce sera utilisée pour le bien être des animaux. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. En cas d’hypothermie, les cages seront chauffées. Dans les cas d'exérèse de la tumeur mammaire chez certaines souris, une administration d’’analgésique pourra avoir lieu, afin de prévenir la douleur.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Etude du rôle d’une cytokine et de sa voie de signalisation dans le vitiligo
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rasées et greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome, 392 souris reçoivent au quatrième puis au dixième jour des anticorps qui lèvent le frein immunitaire, avant de subir au douzième jour l'ablation chirurgicale de la greffe et de la peau au-dessus. Une dépigmentation apparaît vers le trente-cinquième jour, et le suivi se poursuit par une anesthésie gazeuse hebdomadaire pendant seize semaines pour peser, mesurer et photographier, avec quatre prises de sang. 400 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées entre un et neuf mois pour les prélèvements. Le porteur décrit un arbre décisionnel dont les points limites comprennent la prostration, la taille maximale de la greffe, la nécrose et le saignement.
Objectifs
Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 35 jours, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 9 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.
Procédures
392 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 5min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 10min). Puis, 1 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée : 16 semaines x 3min). Entre 1 et 4 mois, en plus du suivi visuel, nous prélèverons 3 fois 100µl de sang pour analyser les cellules circulantes du système immunitaire ( 3x1min). Puis, à la fin de l'expérience (de 4 à 9 mois), nous pourrons encore prélever une 4ème fois 100µl de sang pour nos analyses.
Impact sur les animaux
La piqure d’injection des cellules en intradermique dans le flanc gauche sous anesthésie légère gazeuse peut entrainer une rougeur. 392 animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, uniquement au niveau du point d’injection des cellules. La résection par chirurgie, d’une durée de 5 à 8 minutes, entraine au réveil un état de stress lié à un léger manque de mobilité de la patte arrière à cause de la pose de 2 points de suture et des 4 à 5 agrafes le long des berges de la plaie. Durant les premières minutes après le réveil, une douleur est ressentie par les animaux qui présentent des signes (dos vouté, raideur de la patte postérieure gauche, marche avec les pattes postérieures écartées). Après 10min, les souris retrouvent leur mobilité et un comportement normal (grooming, activité exploratoire, interaction sociale). Les sites d’injections d'analgésique en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse légère peuvent présenter une rougeur. Les prises de sang effectuées à la joue nécessitent une contention stressante pour l’animal pendant 30s. La pression sur la joue pour arrêter le saignement ajoute du stress.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.
Remplacement
Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.
Réduction
Ce protocole sera appliqué à un maximum de 400 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.
Choix des espèces
La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du vitiligo. D'après la publication de référence, nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines car l'induction du vitiligo est maximal à cette période et les injections ne sont pas génées par le stade anagène du développement du système pileux.
Évaluation de l’intérêt thérapeutique de vecteurs AAV codant pour des cytokines d’intérêt dans le domaine des cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".
Objectifs
L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).
Bénéfices attendus
L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.
Procédures
- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes
Impact sur les animaux
Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.
Remplacement
Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.