Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées :
- 235 projets autorisés en avril 2026 (01/05/2026)
- 296 projets autorisés en mai 2026 (01/06/2026)
Etude du rôle fonctionnel de molécules de signalisation impliquées au cours de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.
Procédures
Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.
Devenir
L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.
Remplacement
L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.
Réduction
Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.
Choix des espèces
Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.
Caractérisation du potentiel thérapeutique de sucres complexes dans la régénération de la jonction neuromusculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les troubles générant une instabilité de la synapse, ou jonction neurone-muscle (NMJ), sont fréquents dans plusieurs maladies neuromusculaires. Ces troubles amplifient un déclin moteur, quand ils n’en sont pas directement la cause. Cette relation est confirmée par des expériences qui montrent qu’en réduisant la fragmentation des NMJ, on améliore la force motrice dans un modèle animal de Myopathie de Duchenne (DMD). L'identification des mécanismes de stabilisation de la NMJ est donc cruciale pour la découverte de traitements innovants contre des maladies neuromusculaires dévastatrices et actuellement incurables. Des sucres complexes particuliers appelés héparanes sulfates pourraient intervenir comme mécanisme stabilisateur des NMJ. Ces sucres complexes ainsi que les enzymes à l’origine de leur production diminuent de manière parallèle à la fragmentation de la NMJ chez les DMD. Cette corrélation temporelle est conforme au rôle stabilisateur des synapses de ces molécules et suggère que ce rôle est perdu dans la DMD. Notre but est de rétablir ce rôle chez les animaux DMD en réexprimant ces molécules de surface modifiées afin de stabiliser la NMJ et de promouvoir la récupération fonctionnelle des muscles. Trois objectifs seront poursuivis : 1) augmenter l'expression des enzymes responsables de l’expression de ces molécules de surface modifiées, 2) étudier l'impact de peptides inhibiteurs de ces molécules sur l'intégrité des NMJ in vivo, et 3) tester l'efficacité de l’utilisation in vivo de mimétiques des molécules de surface modifiées sur la stabilisation des NMJ dans la DMD.
Bénéfices attendus
La NMJ est au centre d’un spectre de maladies neuromusculaires, en comprendre la dérégulation permet d’adresser de nouvelles avenues thérapeutiques pour des maladies rares. Notre recherche explore la manière dont des héparanes sulfates (HS) spécifiques régulent la stabilisation de la NMJ dans la DMD. En élucidant le rôle de motifs sulfatés spécifiques dans les HS, nous souhaitons améliorer la compréhension de la fonction musculaire et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux traitements pour les maladies musculaires.
Procédures
Dans ce projet, le traitement sera administré par injections dans un muscle de chacune des pattes arrières, soit 2 injections par animal à chaque fois. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement injectés avec un médicament contre la douleur, injection qui pourra être répétée toutes les 12 heures pendant 2 à 3 jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un test fonctionnel pour évaluer la réponse nerf-muscle sera réalisé sur des animaux endormis complètement (anesthésiés au moyen d’une injection). Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute. Au total 60 animaux, desquels : - 24 recevant : 1 injection d’un médicament contre la douleur, 2 injections du traitement (une dans chaque patte), et 1 injection pour l’anesthésie. - 16 recevant : 4 injections d’un médicament contre la douleur, 8 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 4 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie. - 20 recevant : 12 injections d’un médicament contre la douleur, 24 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 12 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Des études antérieures réalisées avec ce type de molécules sur d’autres modèles animaux n’ont révélé ni toxicité ni effets secondaires. Sur cette base, aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans le cadre de ce projet. Les injections seront réalisées directement dans un muscle de chaque patte, ce qui peut provoquer une légère douleur locale. Ces injections seront effectuées chez des animaux âgés de 4 - 16 semaines, à un stade de la maladie où les muscles sont encore peu affectés de sortes que l’injection ne devrait avoir qu’un faible impact négatif. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge maximal de 16 semaines, puis mis à mort avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie, afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie. L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser au maximum les nuisances pour les animaux, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques essentielles à l’évaluation de cette approche thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des trois procédures pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps d’une structure multipartite requérant l’interaction entre de nombreux types cellulaires (fibre musculaires, motoneurones, cellules de Schwann, kranocytes). De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Préalablement aux essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité des thérapies testées a été démontrée sur des cultures de cellules musculaires. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans connaissance d'un mécanisme biologique robuste, préalablement établi in vitro. La stratégie proposée ici consiste à cibler spécifiquement le muscle plutôt que tout autre organe, permettant de réduire la dose administrée et la toxicité virale sur certains organes tels que le foie. Les stratégies passant par l’utilisation des molecules spécifiques proposés dans ce projet ont déjà été validées sur des animaux de plus petite taille. Le présent projet est la dernière étape chez l'animal visant à confirmer son efficacité en condition réelle, c'est-à-dire sur un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie que le traitement vise à corriger, y compris dans la complexité de la réponse de l'organisme à l'administration du traitement.
Réduction
Le projet a été optimisé pour utiliser un nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre une significativité scientifique et statistique adéquate. La taille d’échantillon a été calculée, recommandant l’utilisation optimale de 10 animaux par groupe. Ce chiffre a été validé par d’autres projets achevés présentant des caractéristiques similaires en termes d’état de développement, de stratégie et de paramètres évalués. Les résultats seront analysés par des tests statistiques qui permettront de confirmer ou infirmer des différences entre plusieurs groupes de variables. Chaque animal sera exploité de manière optimale, en recueillant un maximum de données (analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles) à partir des mêmes animaux, prélèvements et échantillons. Ainsi, nous garantissons que les objectifs scientifiques du projet pourront être atteints tout en réduisant le nombre d'animaux enrôlés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des portoirs équipés de cages ventilées, situés dans des locaux où la température et l’hygrométrie sont rigoureusement contrôlées. Pour leur bien-être, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 par cage à l’âge d’un mois. Puis nous réduisons ce nombre jusqu’à atteindre 3 animaux par cage pour les animaux de plus de 600 grammes. L’isolement n’existe jamais. Afin de favoriser leur bien-être et de limiter les comportements stéréotypés, ils bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant un contact hebdomadaire alterné avec différents éléments tels que du coton aggloméré, des bâtonnets de bois, du papier kraft plié en accordéon, des rouleaux de carton et un hamac. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les injections, grâce à l’utilisation de molécules contre la douleur ou pour induire le sommeil. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement. De plus, ils seront familiarisés avec l’expérimentateur pendant 2-3 jours avant le début des procédures, ce qui permettra de diminuer leur réponse au stress et d’assurer des conditions expérimentales plus harmonieuses.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi dans ce projet présente un système neuromusculaire soumis aux mêmes phases de développement pathologique que chez l’humain et qu’on ne retrouve pas chez d’autres modèles animaux. Ce modèle de rat DMD présente les iso-enzymes médiant la sulfatation des HS, conservées chez l’humain, d’où sa pertinence pour la compréhension physiologique et son intérêt pour les maladies neuromusculaires humaines. Les animaux seront injectés à 4 semaines. La fragmentation des NMJ est perceptible dès 2 mois et est déjà maximale à 7 mois. Les traitements visent à prévenir sur la période 1-4 mois l’apparition de la fragmentation de la NMJ au moment où elle s’installe et s’amplifie. .
Étude des fonctions génétiques et des caractéristiques épigénomiques des noyaux musculaires à la jonction neuromusculaire et à la jonction myotendineuse à l’aide d’AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées. Les noyaux situés dans la partie centrale des cellules musculaires sont en contact avec les motoneurones. Cette région est appelée la jonction neuromusculaire (JNM). La contraction de nos muscles commence au niveau de la JNM lorsque les motoneurones stimulent les cellules musculaires. Une JNM défectueuse est observée dans diverses maladies musculaires et peut entraîner de nombreux symptômes dévastateurs. Les noyaux situés aux extrémités des cellules musculaires sont en contact avec les tendons. Cette région est appelée jonction myotendineuse (JMT). Elle est responsable de l'amortissement de la force contractile du muscle. La JMT est la partie la plus touchée par les blessures lorsque nous faisons de l'exercice et revêt donc une grande importance pour la régénération et la réadaptation musculaires. Ces régions sont toutes les deux essentielles au bon fonctionnement du muscle squelettique, et il est nécessaire de mieux comprendre leur fonctionnement. Récemment, mon équipe a identifié de nombreux gènes qui ne sont exprimés que dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Cette découverte nous offre une nouvelle opportunité d'étudier la biologie de ces deux jonctions. Sur la base de ce contexte, nous avons deux objectifs dans ce projet. 1) Nous allons étudier les fonctions des gènes spécifiques de la JNM ou de la JMT que nous avons découverts. Nous injecterons dans le muscle des virus porteurs de petites séquences d’ARN ciblant les gènes d’intérêts qui réduiront leur expression lorsqu'ils sont présents dans une cellule. Si ces gènes jouent un rôle important dans la fonction de la JNM ou de la JMT, la perte de son expression entraînera des symptômes liés à une déficience de l’une ou l’autre de ces jonctions. 2) Nous isolerons des noyaux au niveau de la JNM ou de la JMT pour étudier plus en détail l'organisation des structures dans ces noyaux. Cela nous permettra de comprendre comment ils se spécialisent alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la même cellule. Pour ce faire, nous injecterons des virus exprimant des protéines fluorescentes uniquement dans les noyaux de l’une ou de l’autre de ces jonctions. La fluorescence nous permettra d'isoler ces noyaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra d'identifier de nouveaux gènes qui sont essentiels à la fonction de la JNM ou de la JMT et fournira également des informations sur la façon dont ces domaines musculaires sont formés. Cela présente de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice et des maladies qui provoquent des défaillances d’une de ces deux jonctions. La conception de notre projet a également pour avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés. À terme, l'analyse complète de la fonction d'un gène nécessite la génération de lignées de souris génétiquement modifiées. Cependant, la modification génétique des souris est très longue et coûteuse, et il est donc difficile d'étudier tous les gènes par cette méthode. Dans notre étude, nous utilisons des virus pour réduire l'expression des gènes recherchés. Cela nous permet de tester rapidement la fonction d'un grand nombre de gènes candidats et d'identifier les gènes à privilégier pour une étude plus approfondie à l'avenir. Par conséquent, notre conception a l'avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux par rapport à l'étude de chaque gène individuel par modification génétique.
Procédures
1. Injection intramusculaire, intraveineuse ou intrapéritonéale : Il s'agit d'interventions très rapides dont seule l’introduction de l’aiguille provoque une douleur. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, elles retourneront dans leur cage d'origine. 2. Mesure de la force de préhension (String, Grip et Hanging) et entraînement ou non à l'exercice excentrique : Il s'agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris feront 1 série de mesure de la force de préhension et/ou non 1 entrainement à l’exercice excentrique une seule fois 4 à 10 semaines après l’injection de virus adéno-associés. Les mesures de force de préhension des 3 tests (String, Grip et Hanging) ne prennent qu’1 à 2 min par souris avec 10 min entre chacun des 3 essais/test et 20 min entre 2 tests. L’exercice excentrique comprend 3 jours de 15 à 20 min d’habituation suivi d’un jour d’exercice de 60 min comparable à un exercice physique intense. Elles seront ensuite euthanasiées 30 min, 1 jour, 2 jours et 3 jours après l’exercice excentrique ou immédiatement après les mesures de force de préhension pour les animaux qui ne feront pas l’exercice excentrique pour réaliser un suivi de la réparation musculaire.
Impact sur les animaux
Les procédures d'injection ou les tests de phénotypage musculaire eux-mêmes ne causeront pas d'effets indésirables. Cependant, comme la délivrance systémique de virus adéno-associés peut également diminuer l'expression des gènes candidats dans d'autres tissus que les muscles ciblés, des effets indésirables inattendus, en raison de leur faible musculature, pourraient être observés.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires après manipulation des gènes cibles. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Notre travail se concentre en particulier sur les sous-types nucléaires spécifiques à l'intérieur des cellules musculaires qui sont formés par l'interaction entre les cellules musculaires et d'autres types de cellules au niveau des JNM et des JMT. De plus il est impossible de mesurer les effets de la réduction de l’expression des gènes cibles sur la force musculaire avec une études réalisée sur des cellules. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro car elles impliquent différents types de cellules et de structures complexes.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : Avant d'injecter les virus capables de réduire l’expression des gènes d’intérêts chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Mesure 2 : La conception de notre projet présente l'avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés pour les expériences. En effet, le nombre de nouveaux gènes candidats dont nous avons découvert l'expression dans les noyaux de la JNM ou de la JMT rend difficile l'étude de tous les gènes en générant des lignées mutantes. Par conséquent, le criblage des gènes candidats prometteurs par une étude utilisant des virus a pour avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés à l'avenir. Mesure 3 : Pour un des objectifs, le prélèvement de l'échantillon de contrôle et de l'échantillon expérimental sera réalisé sur le même animal (par ex : muscle tibial antérieur gauche = contrôle et muscle tibial antérieur droit = expérimental) ce qui permettra de réduire de moitié le nombre total d'animaux utilisés. Mesure 4 : Pour les tests fonctionnels, de multiples expériences seront réalisées chez la même souris. Mesure 5 : Nous déterminerons la meilleure construction permettant de marquer les noyaux de la JNM ou de la JMT. Pour l'isolement de ces noyaux, nous injecterons les deux muscles afin de maximiser le nombre de noyaux extraits d'une souris. Mesure 6 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter. Les souris seront placées sur une plaque chauffante à 37°C pour éviter l'hypothermie et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques par injection de virus adéno-associés sont mieux établies dans ce modèle. Ces facteurs nous permettent d'obtenir un maximum de résultats par animal et de minimiser le nombre total d'animaux utilisés. En outre, le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir des gènes exprimés dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet. Pour les 2 objectifs, les injections de virus adéno-associés seront effectuées à l'âge de 2 à 3 mois (jeune adulte) car c'est le moment où nous avons caractérisé l'expression des gènes spécifiques de la JNM et de la JMT dans notre étude récente.
Étude des fonctions génétiques et des caractéristiques épigénomiques des noyaux musculaires à la jonction neuromusculaire et à la jonction myotendineuse à l’aide d’AAV.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées. Les noyaux situés dans la partie centrale des cellules musculaires sont en contact avec les motoneurones. Cette région est appelée la jonction neuromusculaire (JNM). La contraction de nos muscles commence au niveau de la JNM lorsque les motoneurones stimulent les cellules musculaires. Une JNM défectueuse est observée dans diverses maladies musculaires et peut entraîner de nombreux symptômes dévastateurs. Les noyaux situés aux extrémités des cellules musculaires sont en contact avec les tendons. Cette région est appelée jonction myotendineuse (JMT). Elle est responsable de l'amortissement de la force contractile du muscle. La JMT est la partie la plus touchée par les blessures lorsque nous faisons de l'exercice et revêt donc une grande importance pour la régénération et la réadaptation musculaires. Ces régions sont toutes les deux essentielles au bon fonctionnement du muscle squelettique, et il est nécessaire de mieux comprendre leur fonctionnement. Récemment, mon équipe a identifié de nombreux gènes qui ne sont exprimés que dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Cette découverte nous offre une nouvelle opportunité d'étudier la biologie de ces deux jonctions. Sur la base de ce contexte, nous avons deux objectifs dans ce projet. 1) Nous allons étudier les fonctions des gènes spécifiques de la JNM ou de la JMT que nous avons découverts. Nous injecterons dans le muscle des virus porteurs de petites séquences d’ARN ciblant les gènes d’intérêts qui réduiront leur expression lorsqu'ils sont présents dans une cellule. Si ces gènes jouent un rôle important dans la fonction de la JNM ou de la JMT, la perte de son expression entraînera des symptômes liés à une déficience de l’une ou l’autre de ces jonctions. 2) Nous isolerons des noyaux au niveau de la JNM ou de la JMT pour étudier plus en détail l'organisation des structures dans ces noyaux. Cela nous permettra de comprendre comment ils se spécialisent alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la même cellule. Pour ce faire, nous injecterons des virus exprimant des protéines fluorescentes uniquement dans les noyaux de l’une ou de l’autre de ces jonctions. La fluorescence nous permettra d'isoler ces noyaux.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra d'identifier de nouveaux gènes qui sont essentiels à la fonction de la JNM ou de la JMT et fournira également des informations sur la façon dont ces domaines musculaires sont formés. Cela présente de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice et des maladies qui provoquent des défaillances d’une de ces deux jonctions. La conception de notre projet a également pour avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés. À terme, l'analyse complète de la fonction d'un gène nécessite la génération de lignées de souris génétiquement modifiées. Cependant, la modification génétique des souris est très longue et coûteuse, et il est donc difficile d'étudier tous les gènes par cette méthode. Dans notre étude, nous utilisons des virus pour réduire l'expression des gènes recherchés. Cela nous permet de tester rapidement la fonction d'un grand nombre de gènes candidats et d'identifier les gènes à privilégier pour une étude plus approfondie à l'avenir. Par conséquent, notre conception a l'avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux par rapport à l'étude de chaque gène individuel par modification génétique.
Procédures
1. Injection intramusculaire ou intrapéritonéale : Il s'agit d'interventions très rapides dont seule l’introduction de l’aiguille provoque une douleur. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, les elles retourneront dans leur cage d'origine. 2. Mesure de la force de préhension (String, Grip et Hanging) et entraînement à l'exercice (Rotarod et Treadmill) : Il s'agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris feront les 3 mesures de la force de préhension (lot 1 et 2 de la procédure 3) et un des 2 entrainement à l’exercice (uniquement lot 2 de la procédure 3) 3 fois par jours, 1 fois par semaine chacun des tests sur une période de 7 semaines après l’injection d’AAV. Elles retourneront ensuite dans leur cage d'origine. 3. Mesure de la force contractile in situ : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les procédures d'injection ou les tests de phénotypage musculaire eux-mêmes ne causeront pas d'effets indésirables. Cependant, comme la délivrance systémique de virus adéno-associés peut également diminuer l'expression des gènes candidats dans d'autres tissus que les muscles ciblés, des effets indésirables inattendus, en raison de leur faible musculature, pourraient être observés. La mesure de la force contractile in situ est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant la fin des effets de l’anesthésie afin d’éviter toute douleur ou effet indésirable.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires après manipulation des gènes cibles. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Notre travail se concentre en particulier sur les sous-types nucléaires spécifiques à l'intérieur des cellules musculaires qui sont formés par l'interaction entre les cellules musculaires et d'autres types de cellules au niveau des JNM et des JMT. De plus il est impossible de mesurer les effets de la réduction de l’expression des gènes cibles sur la force musculaire avec une études réalisée sur des cellules. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro car elles impliquent différents types de cellules et de structures complexes.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : Avant d'injecter les virus capables de réduire l’expression des gènes d’intérêts chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Mesure 2 : La conception de notre projet présente l'avantage de réduire le nombre d'animaux utilisés pour les expériences. En effet, le nombre de nouveaux gènes candidats dont nous avons découvert l'expression dans les noyaux de la JNM ou de la JMT rend difficile l'étude de tous les gènes en générant des lignées mutantes. Par conséquent, le criblage des gènes candidats prometteurs par une étude utilisant des virus a pour avantage de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés à l'avenir. Mesure 3 : Pour un des objectifs, le prélèvement de l'échantillon de contrôle et de l'échantillon expérimental sera réalisé sur le même animal (par ex : muscle tibial antérieur gauche = contrôle et muscle tibial antérieur droit = expérimental) ce qui permettra de réduire de moitié le nombre total d'animaux utilisés. Mesure 4 : Pour les tests fonctionnels, de multiples expériences seront réalisées chez la même souris. Mesure 5 : Nous déterminerons la meilleure construction permettant de marquer les noyaux de la JNM ou de la JMT. Pour l'isolement de ces noyaux, nous injecterons les deux muscles afin de maximiser le nombre de noyaux extraits d'une souris. Mesure 6 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter. Les souris seront placées sur une plaque chauffante à 37°C pour éviter l'hypothermie et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques par injection de virus adéno-associés sont mieux établies dans ce modèle. Ces facteurs nous permettent d'obtenir un maximum de résultats par animal et de minimiser le nombre total d'animaux utilisés. En outre, le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir des gènes exprimés dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet.