Les projets approuvés

Une chirurgie de trente minutes à une heure pour atteindre le cerveau, puis des injections répétées toutes les deux semaines par cathéter pendant six mois, voilà ce qui attend une partie des 2 075 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. D'autres reçoivent des injections sanguines hebdomadaires, également jusqu'à six mois, et peuvent être gardées six mois de plus après la dernière. Le travail cherche à réduire la production d'une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson, chez des souris porteuses du gène humain entier. Les molécules retenues pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques, formulation que le porteur emploie deux fois, quand la douleur modérée, le risque d'infection et la perte de poids sont annoncés au présent.

Objectifs

Notre équipe travaille sur des traitements potentiels pour la maladie de Parkinson. Cette maladie peut parfois être liée à des changements dans certains gènes, qui perturbent le fonctionnement et la survie des neurones. Un de ces gènes joue un rôle important car il peut entraîner l’accumulation d’une protéine dans le cerveau, ce qui contribue au développement de la maladie. Notre approche consiste à trouver des futurs traitements capables de réduire la production de cette protéine, dans le but de ralentir ou limiter la progression de la maladie, et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier un ou plusieurs outils thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la maladie de Parkinson. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules efficaces et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.

Procédures

Chaque animal ne reçoit qu’un seul type d’injection (dans le sang ou le cerveaux) avec une seule molécule, pour voir si elle est efficace. Les injections dans le sang sont rapides (moins d’une minute) et peuvent être répétées toutes les semaines, jusqu’à 6 mois. Les injections dans le cerveau nécessitent une chirurgie qui dure entre 30 minutes et 1 heure. Elles peuvent aussi être répétées (durée d’environ 5 minutes, sans chirurgie grâce à un cathéter, ) toutes les deux semaines, pendant un maximum de 6 mois. Les souris pourront être gardées jusqu’à 6mois après la dernière injection.

Impact sur les animaux

Les injections dans le sang ou dans le cerveau peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. Elles peuvent également entraîner un risque de faible perte de poids et de risque d’infection.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser, au niveau des organes, les effets des molécules injectées.

Remplacement

La recherche en bioinformatique de candidats et les analyses réalisées sur modèles cellulaires permettent d’effectuer un premier criblage des molécules. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, qui permet d’évaluer l'efficacité de la molécule.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les conditions réglementaires en vigueur. La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une efficacité suffisante de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anésthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce).

Choix des espèces

L’utilisation de souris portant le gène humain entier nous permettra d’évaluer la capacité de nos molécules à diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie dans le cerveau. La souris étant l’un des modèles les plus utilisés et les mieux documentés en recherche préclinique, ce modèle est particulièrement pertinent pour ce type d’étude. L’objectif étant de diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie de Parkinson qui se développe chez l’adulte, les études seront réalisées à partir du stade jeune adulte chez la souris jusqu'à un âge plus avancé.

Pour reproduire la maladie de Parkinson, 2 112 souris reçoivent des injections répétées d'une substance chimique neurotoxique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est dépourvue d'une protéine par modification génétique. Le porteur affirme que cette substance n'affecte pas le bien-être des souris dans ses conditions, tout en listant prostration, dos voûté, poils ébouriffés et perte de poids parmi les signes de détresse surveillés. L'objectif reste de mieux comprendre la mort des neurones, sans retombée directe annoncée.

Objectifs

La maladie de Parkinson est aujourd’hui l’une des principales causes de troubles du mouvement, juste après les accidents vasculaires cérébraux. C’est aussi la maladie neurologique qui progresse le plus rapidement dans le monde. Elle touche le cerveau et perturbe le contrôle des mouvements. Les personnes atteintes peuvent présenter des tremblements, des gestes plus lents ou une raideur musculaire. Mais la maladie ne se limite pas aux problèmes moteurs : elle peut aussi affecter le sommeil, l’humeur et parfois la mémoire ou la concentration. La maladie de Parkinson est complexe et évolue avec le temps. Il est donc essentiel de mieux la comprendre pour pouvoir, à terme, améliorer les traitements. Notre projet de recherche consiste à développer un modèle expérimental de la maladie chez la souris en utilisant une substance chimique, qui a été associée à un risque accru de développer la maladie de Parkinson. Ce modèle nous permet de reproduire certains mécanismes de la maladie et d’étudier plus précisément la mort des cellules du cerveau, c’est-à-dire leur disparition progressive. Grâce à ces travaux, notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine essentielle au bon fonctionnement du cerveau. En étudiant des animaux chez lesquels cette protéine est absente, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson. Ces recherches permettront également de définir les meilleures conditions expérimentales pour étudier cette maladie en laboratoire, afin d’obtenir des résultats fiables et utiles pour la recherche biomédicale.

Procédures

Une partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 2 semaines. L'autre partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

D'après les données de la littérature notre substance chimique n'affecte pas le bien-être animal dans les conditions expérimentales de notre étude. Néanmoins, les principaux signes de détresse sont une position recroquevillée, le dos voûté, les poils ébouriffés, les yeux fermés, une respiration accélérée et une perte de poids.

Devenir

A l'issue de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses nécéssaires au projet scientifique.

Remplacement

L’étude de la maladie de Parkinson nécessite un organisme entier. Notre étude doit nécessairement se faire sur l’animal pour comprendre l'effet de notre substance chimique. Cependant nous menons en parallèle des études sur cellules.

Réduction

Les animaux sont élevés au sein de notre établissement utilisateur et l’élevage est dimensionné afin de limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans les procédures. Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel.

Raffinement

Les souris sont hébergées collectivement dans la zone de production de l’animalerie dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification avec un cycle d’éclairage normal. Elles sont nourries et abreuvées ad libitum. Les animaux sont régulièrement manipulés et observés par les animaliers lors du change ou par les expérimentateurs. Selon les observations suivantes : perte de poids chez les animaux en croissance et les adultes, état du pelage, état de la litière, posture/mobilité et comportements indésirables, des moyens de raffinement seront utilisés pour réduire, éviter ou atténuer toute forme de souffrance. Compte tenu de la toxicité connue de la substance administrée, les animaux traités seront surveillés quotidiennment même si, d'après la littérature, le bien-être n'est pas affecté dans nos conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études de la maladie de Parkinson, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Nous disposons d'une lignée murine dépourvue d'une protéine pour effectuer des analyses nécécessaires au projet scientifique et le traitement des animaux par la substance chimique sert de modèle de la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6, 9 et 12 mois pour développer le modèle.

Les souris qui montrent les premiers signes moteurs, une démarche saccadée, sont mises à mort avant que la paralysie ne les empêche de se nourrir. 312 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie sous anesthésie, une inoculation d'agrégats d'alpha-synucléine humaine qui reproduit une forme de maladie de Parkinson ou d'atrophie multisystématisée et conduit à la paralysie. Le porteur indique comparer douze formes de la protéine agrégée pour relier leur structure à la sévérité de la maladie, la mise à mort servant à prélever et analyser le cerveau.

Objectifs

L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions du cerveau des patients atteints de maladie de Parkinson ou d’atrophie multisystématisée, où elle se présente sous une forme agrégée. De structures différentes selon les maladies, ces agrégats sont associés à une gravité particulière dans le cas de l’atrophie multisystématisée, rendant les patients rapidement dépendants d’un fauteuil roulant et avec une survie inférieure à 10 ans. Le projet vise à disposer d’échantillons cérébraux de souris modifiées génétiquement, avec des lésions bien identifiées et caractérisées, afin de pouvoir analyser à très haute résolution la structure spatiale de la protéine alpha-synucléine formée lors de l’apparition de la maladie induite par un panel de différents agrégats d’alpha-synucléine inoculés à la souris. Le but est de mieux comprendre les relations entre structures moléculaires de la protéine et sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires pathologiques de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et de la structure à l’échelle atomique de la protéine pathologique. Il s‘agit en particulier de mieux comprendre pourquoi l’atrophie multisystématisée présente, parmi les différentes maladies associées à cette même protéine, une gravité particulière aboutissant en quelques années seulement à la mort des patients.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement à l'âge de 6-8 semaines, réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 312 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet d’une inoculation réalisée sous anesthésie générale et locale. Ces inoculations peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Réalisées afin de reproduire la maladie humaine, ceci entraîne l’apparition précoce des premiers signes cliniques moteurs qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal. La confirmation de ces premiers signes cliniques détermine la décision de mise à mort des animaux selon une grille de scoring, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’expression d’une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduit irrémédiablement à une paralysie, survenant plus précocément suite à l’inoculation d’alpha-synucléine sous forme agrégée. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et la pathologie cérébrale, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 12 groupes expérimentaux, correspondant à 12 formes d’alpha-synucléine agrégée différentes, sont constitués chacun de 26 souris adultes, mâles et femelles. Dans chaque groupe expérimental 14 souris sont prévues afin de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation, des lésions et des caractéristiques biochimiques de la protéine présente dans le cerveau. Les 12 autres souris sont prévues pour extraire et purifier cette protéine afin d’étudier sa structure spatiale à très haute résolution.

Raffinement

Les inoculations dans le cerveau sont réalisées sous anesthésies générale et locale, après administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages ventilées par groupes de 5 mâles ou 5 femelles, suivis quotidiennement, et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6-8 semaines, dans lesquelles l’expression d’alpha-synucléine humaine permet les comparaisons des durées de survie et des caractéristiques de la maladie. Seule cette lignée de souris particulière permet aujourd’hui à la fois la reproduction d‘une diversité des pathologies et de leurs sévérités, telle qu’elle existe chez l’homme, et une analyse structurale de la protéine en cause.

Pour présélectionner des candidats médicaments contre la maladie de Parkinson, 720 rats reçoivent une substance qui réduit transitoirement des messagers chimiques du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le modèle reproduit des symptômes moteurs réversibles, ralentissement et rigidité, avant injections, gavages et prélèvements de liquide céphalorachidien. Le porteur le présente comme un "filtre précoce" épargnant des animaux à des études plus invasives. Il en fait un argument de réduction, tout en prévoyant de tester jusqu'à quarante candidats médicaments de ses clients sur cinq ans.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par un dysfonctionnement progressif du cerveau. Les traitements actuellement disponibles permettent d’améliorer les symptômes moteurs, mais leur efficacité reste incomplète et s’accompagne d’effets secondaires importants, notamment l’apparition de mouvements involontaires chez une grande majorité de patients. Le besoin de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc majeur. L’objectif du projet est d’identifier de nouveaux candidats médicaments capables d’améliorer les symptômes moteurs de type parkinsonien. Pour cela, nous proposons d’utiliser un modèle chez le rat. Une substance sera administrée afin de réduire transitoirement certaines substances chimiques du cerveau. Ce modèle reproduit de manière réversible certains symptômes moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson, tels que les mouvements ralentis, la réduction de l’activité locomotrice ou la rigidité. Contrairement aux modèles classiques qui provoquent des lésions irréversibles du cerveau, cette approche n’entraîne pas de destruction des cellules nerveuses. Elle permet ainsi de limiter le recours à des procédures lourdes et de réduire le nombre d’animaux soumis à des interventions invasives. L’intérêt principal de ce modèle réside dans son rôle de filtre précoce dans le développement préclinique. Il permet d’obtenir rapidement une première indication de l’efficacité d’un traitement sur les symptômes moteurs liés à une diminution de certaines substances chimiques du cerveau. Seules les molécules démontrant un effet bénéfique dans ce modèle seront ensuite évaluées dans des modèles plus invasifs reproduisant la perte progressive de certains neurones. Ainsi, l’utilisation de ce modèle contribue directement à la réduction du nombre d’animaux exposés à des approches lésionnelles sévères. En résumé, le projet vise à présélectionner des molécules actives sur les symptômes moteurs de type parkinsonien dans un modèle à sévérité limitée, avant d’engager des études approfondies dans d’autres modèles. Cette démarche s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en limitant le recours aux modèles invasifs aux seuls candidats présentant un intérêt thérapeutique démontré. 40 candidats médicaments pourront être testés dans ce projet (4 groupes x 10 études, sur 5 ans).

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques. Ce modèle permettra à nos clients de sélectionner les molécules qui feront l’objet d’études nécessitant une approche plus invasive. Ce modèle permet de réduire le nombre d’animaux qui subiront une approche plus invasive grâce à la pré-sélection de molécules d’intérêt. Les molécules qui ne montrent aucun effet sur l’amélioration des troubles moteurs induits dans ce modèle ne seront pas retenues pour des études plus approfondies. Cette démarche bénéficie à la fois au respect des principes de raffinement et de réduction, et à nos clients, en permettant d’orienter les efforts de financement vers les candidats thérapeutiques les plus pertinents. Les résultats de ce projet seront accessibles à court terme, les tests comportementaux étant réalisés peu de temps après l’injection de réserpine et s’effectuant dans la journée.

Procédures

Les animaux vont subir des injections (1 fois 1 min), des administrations de traitement dans le corps sur animal vigile ou anesthésié pour certaines injections (1 fois par jour pendant 1 jour à 2 mois maximum/1 min), des prélèvements de sang sur animaux anesthésiés, avec réveil (1 à 4 fois/1 min) et des mesures du comportement moteur (1 à 2 fois/5 min à 3 heures) et des prélèvements du liquide qui protège le cerveau sur animaux anesthésiés, sans réveil (1 fois/10 min).

Impact sur les animaux

La substance administrée est diluée dans une solution qui peut provoquer une irritation locale, une inflammation ou une douleur transitoire au point d’injection (nuisances légères). L’injection peut entrainer une hypothermie, une perte de poids et une difficulté à faire des mouvements, les animaux récupérant au bout d’environ 24 à 48h (nuisances modérées car transitoires). Les substances administrées peuvent avoir des effets indésirables, tels qu’un effet irritant du composé, un changement de comportement, une perte d'appétit ou bien de l'agressivité (nuisances légères). Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : voie orale : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. Si le traitement est administré par injection, il peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. L’inhalation du traitement peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress léger. Toutes les nuisances relatives aux méthodes d’administration ou aux tests comportementaux sont d’intensité légère.

Devenir

A l’issu de cette procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Ce modèle est généré dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Il permet de valider l’efficacité d’une molécule sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Une fois une molécule d’intérêt identifiée, son efficacité pourra être testée dans des modèles reproduisant la perte progressive des neurones impliqués dans la maladie de Parkinson. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui devront subir des expériences plus lourdes ou des chirurgies pour tester des molécules peu avancées dans le processus de développement. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes.

Raffinement

Avant toute manipulation, nous respecterons une période d'acclimatation des animaux d’au minimum 7 jours. Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Les animaux seront pesés toutes les semaines et tous les jours pendant 3 jours après l'injection sous-cutanée. Lors de ces injections, des éléments de raffinement sont prévus. Les animaux sont observés plusieurs fois par jour (2 fois par jour minimum). Les administrations de traitements peuvent être réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Certaines injections e feront sous anesthésie gazeuse. Si le traitement provoque des effets indésirables, il peut être interrompu et l’animal surveillé. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les animaux sont observés selon plusieurs critères et dans le cas où les points limites sont dépassés, une décision de mise à mort est prise par les expérimentateurs pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est utilisé dans ce modèle car le fonctionnement de son cerveau est proche de celui de l’humain, ce qui permet de reproduire fidèlement les symptômes moteurs parkinsoniens. Il dispose également de nombreux tests comportementaux validés, offrant une évaluation sensible des altérations induites et des effets des traitements. Enfin, sa taille, son comportement stable et la facilité de réalisation d’études longitudinales en font un modèle expérimental pratique et reproductible. Les rats Sprague Dawley ou Long Evans sont utilisés car nous avons une expertise sur ces souches et les tests comportementaux ont été validés sur celles-ci. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Une injection de toxines dans le cerveau pour détruire des neurones, un choc électrique de 0,7 milliampère et une restriction alimentaire : 2 280 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Plusieurs modèles de la maladie de Parkinson sont reproduits, avec pose d'une canule cérébrale et injections répétées sur quatre semaines, suivies de tests comportementaux et d'imagerie. Le protocole prévoit la mise à mort dès qu'un rat atteint des points limites : perte de 20 % du poids, prostration, automutilation ou hémorragie. L'objectif est d'identifier des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur des modèles dont le porteur reconnaît qu'ils ne reproduisent que partiellement la maladie humaine.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.

Les souris M83 sont modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine et développent entre 8 et 22 mois une maladie qui évolue vers la paralysie du train postérieur. 150 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, maintenues jusqu'à l'atteinte des points limites, toutes tuées. La démarche saccadée et la perte d'équilibre servent de signal, leur confirmation déclenchant la mise à mort avant la paralysie, et le seul acte décrit est une ponction cardiaque de deux minutes sous anesthésie. Le porteur présente cette mise à mort comme compassionnelle, quand elle sert aussi à prélever le sang dans lequel chercher des vésicules extracellulaires neuronales.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, en fonction de points limites adaptés, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 150 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.