Les projets approuvés

Les 528 souris de ce projet sont des NSG, dépourvues de défenses immunitaires, ce qui permet d'y greffer des cellules cancéreuses humaines et les expose au moindre germe opportuniste. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, greffées par voie intraveineuse et sous-cutanée, puis soumises à des gavages et des injections intrapéritonéales cinq jours par semaine, avec une imagerie sous anesthésie chaque semaine. Le porteur signale la fatigue et l'amaigrissement qui accompagnent le développement tumoral. Toutes seront tuées, une partie en cours de protocole à chaque étape, pour prélever les tissus.

Objectifs

Le projet concerne l’étude de la mise en dormance des cellules souches cancéreuses (CSC) dans la moelle osseuse. Deux modèles de cancer seront utilisés en comparant les cellules souches leucémiques et les cellules de cancer gastrique. Le projet s'appuie sur nos résultats en amont et ceux de la littérature. Les données de la littérature confirment que les CSC sont capables d’aller dans la moelle des os comme les cellules leucémiques et de s’y cacher. Ces mécanismes semblent similaires à la dormance des cellules souches leucémiques dans la moelle osseuse. Les objectifs des approches mises en place sont de mimer ce qui a été observé chez les patients de manière à étudier comment les CSC au travers de mécanismes de dormance deviennent insensible aux thérapeutiques au sein de la moelle osseuse et comment elles sont capables depuis le site de la moelle osseuse d’initier à nouveau un cancer en comparant dans notre cas aux leucémies greffées en sous-cutanée qui ne colonisent jamais la moelle osseuse.

Bénéfices attendus

Les greffes réalisées associées à des analyses moléculaires vont conduire à l’identification de facteurs et de voies qui permettent aux CSC de s’adapter dans la moelle osseuse. La validation des rôles de ces facteurs et de leurs voies in vivo permettra de prouver leurs implications dans la persistance des cellules cancéreuses mais aussi de définir des voies d’action pour bloquer ces mécanismes.

Procédures

Les animaux vont être greffés par injection en intra-veineux et en sous-cutanée une seule fois (1 min), recevoir des traitements par gavage oral ou injection intra péritonéale : Injection intrapéritonéale pour chaque animal (1 min ; 5/semaine), gavage (30s ; 5/semaine) Imagerie nécessite une anesthésie de 15 min au cours de laquelle l’imagerie est réalisée en 10min. Réalisation hebdomadaire.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront de l’inconfort dû aux injections pour la greffe et au développement tumorale qui s’accompagne fréquemment de fatigue et d’amaigrissement. Du stress sera induit par les imageries hebdomadaires et de l’inflammation liée aux gavages quotidiens en semaine conduisant à des nuisances légères. Enfin, nous utilisons des souris NSG immunodéficientes et qui malgré des manipulations en conditions stériles peuvent avoir un risque de contamination par des agents pathogènes opportunistes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En cours de procédure, à chaque étape les animaux sont euthanasiés et les différents tissus d’intérêts sont prélevés.

Remplacement

Pour répondre à nos objectifs tout en diminuant au maximum le recours à des animaux, nous utilisons la modélisation in vitro et ex vivo de la moelle osseuse. De plus, au fil du temps, le suivi bibliographique nous permet d'avoir des mises à niveau régulières pour savoir si nous devons poursuivre la validation d'une molécule ou en changer. Par contre, pour atteindre nos objectifs, des études précliniques sont indispensables. Les modèles murins et xébrafish sont les seul utilisés à ce jour en hématologie.

Réduction

Combinaison des lots témoins lorsque l'on teste plusieurs molécules sur la même cible. Utilisation d’un test de puissance pour définir le nombre d’animaux/groupe. Tests statistiques utilisés pour l’analyse des résultats. De plus, l’expérimentation ne comportera plus que 12 animaux greffés par lot car l’analyse statistique a montré que cela est suffisant pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Des soins adaptés sont réalisés (poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Ces critères réunis permettront d’établir un score pour intervenir à bon escient. De la nourriture enrichie est donnée après la greffe. Les animaux utilisés étant immunodéficients, les différentes procédures sont réalisées de manières à prévenir tout dommages par des mesures barrières.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour ce projet de formation des cellules sanguines humaines car elle est possible et bien documentée. Les souris sont utilisées en raison de leurs capacités à accepter des cellules humaines : 1). Une forte immunodépression de par l’absence de cellules immunitaires. 2). La capacité d´extrapoler les résultats à l’homme. 3). L´expérience d´utilisation en recherche.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour étudier leurs poumons, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des inhalations intranasales sous anesthésie, des particules virales et des injections abdominales répétées destinées à supprimer certaines cellules immunitaires. Le projet cherche à lever un frein immunitaire empêchant les cellules du poumon de se reprogrammer. Les applications en médecine régénérative, jusqu'au cœur ou au foie, sont annoncées à terme, quand les inhalations et les injections répétées, elles, sont immédiates.

Objectifs

Durant le développement, une cellule souche est capable de se spécialiser en n’importe quelle autre cellule différenciée et mature ayant une fonction définie. Cet état de différenciation est réversible et cela a été montré récemment notamment grâce à des travaux démontrant la possibilité de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche en utilisant des gènes particuliers. Diverses études ont montré que cette reprogrammation cellulaire ne fonctionnait pas systématiquement dans tous les tissus à cause de la présence de certains freins. Parmi ces tissus, le poumon semble contenir un frein qui empêche ses cellules de se reprogrammer, même s’il est connu comme ayant la capacité de se régénérer. De ce fait, le but est d’identifier ce frein puis de le lever afin de comprendre le processus de reprogrammation cellulaire dans le poumon. Des études préliminaires nous ont permis d’identifier le système immunitaire comme frein potentiel à cette reprogrammation cellulaire dans le poumon. Dans ce contexte, nous souhaiterions étudier l’interaction entre la reprogrammation cellulaire du tissu pulmonaire avec le système immunitaire.

Bénéfices attendus

La reprogrammation cellulaire d’un tissu peut avoir lieu sous certaines conditions en levant certaines barrières responsables du blocage de la reprogrammation. Nous souhaiterions donc approfondir notre étude dans un modèle de souris où nous allons supprimer certaines cellules du système immunitaire et étudier le chemin des cellules en cours de reprogrammation dans le poumon. Les connaissances issues de ce travail pourraient, à terme, contribuer au développement de nouvelles approches en médecine régénérative, visant à favoriser la réparation des tissus endommagés. Ces avancées pourraient avoir des retombées plus larges, au-delà du poumon, pour améliorer les stratégies de régénération d’autres organes et soutenir la recherche de traitements innovants pour des maladies aujourd’hui difficiles à soigner telles que les insuffisances cardiaques ou hépatiques.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord, au jour 0, soumis à une anesthésie et à une inhalation par voie intra-nasale d’un composé qui va permettre la déplétion de cellules immunitaires dans le poumon. Pour l’anesthésie et l’inhalation, la procédure totale dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes d’administration par inhalation et réveil). Au jour 3, les animaux sous anesthésie inhalent des particules virales, et recevront une injection au niveau de l'abdomen d’un composé déplétant les cellules immunitaires qui se trouvent dans la circulation sanguine. Le geste dure environ 4 minutes (2 minutes d’anesthésie, 2 minutes inhalation). L’injection au niveau de l'abdomen se fera en 15 secondes en maintenant la souris, déjà anesthésiée, en contention sur le dos (geste maitrisé dans notre laboratoire). Pour la totalité de la procédure, l’inhalation intra-nasale sera réalisée 2 fois, au jour 0 et au jour 3. L’injection dans l'abdomen sera, quant à elle, réalisée trois fois : au jour 3 sur souris anesthésiées, au jour 6 et 9 sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

Un saignement, une irritation et ou un grattage excessif de la région nasale peuvent apparaitre à la suite de l’administration intra-nasale. Pour effectuer l’injection intrapéritonéale, la souris sera maintenue sur le dos grâce à une contention. Ce geste causera un stress temporaire chez l’animal. Les effets indésirables liés à l’injection au niveau de l'abdomen sont limités au site d’injection. En effet, l’apparition de rougeur, d’une nécrose ou d’un saignement est possible.

Devenir

Les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire d'étudier leurs poumons.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du système immunitaire dans la reprogrammation des cellules du poumon, nous sommes dans l’obligation de recourir à un modèle animal. Des études in vitro faites dans notre laboratoire n’ont pas permis de valider notre hypothèse car il ne nous est pas possible de récapituler le système immunitaire in vitro. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la médecine régénérative (discipline permettant de réparer ou remplacer les tissus abimés grâce à des cellules souches) il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce à un logiciel tenant compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (26 par lot et nous aurons 4 lots de souris) dans notre procédure sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement sur les 4 jours suivant l’administration par voie intra-nasale et intrapéritonéale afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 2 fois dans la semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites (Grille de score) conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. Notre procédure implique l’ingestion d’un médicament dans de l’eau de boisson. Au vu du goût amer de ce médicament, du glucose est rajouté dans l’eau afin d’en augmenter l’appétence.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent d’étudier la reprogrammation cellulaire à l’échelle de l’organisme. Nous utiliserons des souris entre l’âge de 6 et 8 semaines car c’est à cet âge que le geste de l’administration par voie intra-nasale fonctionne le mieux. Technique ayant été validée lors d’un projet antérieur.

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit des gavages, une autre deux chirurgies successives, une greffe de cellules tumorales dans le pancréas puis une injection dans la rate pour provoquer des métastases au foie. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires dans la progression d'un cancer du pancréas très agressif. Le porteur présente les organoïdes comme incapables de reproduire le processus métastatique et conclut à la nécessité du modèle vivant.

Objectifs

L’adénocarcinome canalaire pancréatique est un cancer très agressif, qui se propage fréquemment vers le foie. Chez de nombreux patients, des métastases hépatiques sont déjà présentes au moment du diagnostic. Il se développe à partir de lésions précancéreuses (appelées PanIN), mais les mécanismes qui conduisent à leur progression vers un cancer invasif et à la formation de métastases restent mal compris. Des études récentes montrent que le foie peut être modifié avant même l’arrivée des cellules tumorales, créant un environnement favorable aux métastases, appelé niche pré-métastatique. Les macrophages, cellules immunitaires importantes du microenvironnement tumoral, semblent jouer un rôle clé dans ces processus. Cependant, leur implication précise dans la progression de l'adénocarcinome canalaire pancréatique et dans l’apparition des métastases hépatiques n’est pas encore clairement établi. L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle des macrophages dans la progression des lésions précancéreuses vers un cancer invasif et dans l’initiation des métastases hépatiques, en utilisant un modèle murin génétique. Plus spécifiquement, ce projet vise à : Étudier l’évolution des macrophages dans le pancréas au cours de la progression tumorale. Analyser le rôle des macrophages du foie dans la formation de la niche pré-métastatique. Évaluer l’impact de la modification des macrophages sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre le rôle des macrophages dans le développement du PDAC et des métastases hépatiques, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la progression des lésions précancéreuses vers un cancer pancréatique invasif, en s’intéressant en particulier au rôle du microenvironnement tumoral. Il vise également à améliorer nos connaissances sur la formation des métastases de ce cancer, un problème majeur de santé publique. La présence de métastases empêche souvent les patients de bénéficier d’une chirurgie, qui reste actuellement le traitement curatif le plus efficace pour ce cancer. Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dissémination tumorale est donc essentiel. Ce projet analysera les changements qui affectent les macrophages au cours du développement tumoral et de la formation de la niche métastatique, ainsi que leur rôle dans ces processus. Les résultats pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Enfin, les données produites seront partagées en libre accès afin de soutenir d’autres travaux de recherche utilisant les mêmes modèles expérimentaux.

Procédures

Certains animaux auront 3 ou 4 gavages, durée 1 minute. D'autres animaux auront deux chirurgies successives : Injection de cellules tumorales dans le pancréas (greffe orthotopique, durée 10 minutes) puis injection dans la rate de cellules tumorales (10 jours plus tard) pour induire des métastases hépatiques (durée 10 minutes). Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les gavages induiront un stress transitoire léger. Les souris modèles présenteront par la suite une fragilité liée à l’activation de l’oncogène après l’administration de tamoxifène. Le développement progressif de lésions PanIN puis d’un cancer pancréatique invasif (PDAC) peut entraîner une contrainte chronique modérée, se traduisant notamment par une perte de poids, une diminution de l’activité et une altération de l’état général. Dans le modèle orthotopique, induit par chirurgie, les souris subiront deux interventions chirurgicales. Un stress léger et transitoire pourra être ressenti avant l'anesthésie. Ces procédures en elles-mêmes peuvent provoquer une douleur temporaire, et une légère perte de poids. Par la suite, la croissance des tumeurs, en particulier au niveau du foie, peut également entraîner des douleurs et un amaigrissement progressif. L’intensité globale des nuisances est estimée comme modérée selon le stade de la maladie, le modèle utilisé et les points d'arrêt prévus.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures. Dans le modèle génétique génétique, les souris seront mises à mort à différents stades de la progression tumorale afin de permettre l’analyse des tissus, notamment le pancréas, le foie, les poumons et la rate. Ces prélèvements sont nécessaires pour étudier le microenvironnement tumoral et pré-métastatique à l’aide de différentes techniques biologiques. La mise à mort de tous les animaux est indispensable pour permettre l’analyse des tissus.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro avancés, tels que les organoïdes et tumoroïdes, existent pour étudier le cancer, ils ne permettent pas de reproduire correctement le processus métastatique, qui implique des interactions complexes entre plusieurs organes. Ce projet s’intéresse en particulier au rôle du système immunitaire, notamment des macrophages et des monocytes circulants, dans la progression du cancer pancréatique depuis les lésions précancéreuses jusqu’au PDAC invasif. L’étude de ces interactions nécessite un environnement physiologique complet et un suivi à long terme, qui ne peuvent pas être obtenus avec des modèles in vitro seuls. Des approches in vitro seront néanmoins utilisées en complément pour confirmer certains résultats obtenus chez l’animal, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer entièrement l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été limité au strict minimum, en s’appuyant sur les données de la littérature et sur des calculs statistiques d’effectif. Après la mise à mort, de nombreuses cellules, y compris des populations rares, seront collectées afin d’étudier leur rôle dans les tumeurs pancréatiques et les métastases hépatiques à différents niveaux d’analyse (cellulaire, moléculaire et transcriptomique). Chaque animal permettra ainsi de produire un grand nombre de données, optimisant l’utilisation de chaque individu et contribuant à la réduction globale du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes, dans la limite de cinq animaux par cage, afin d’éviter l’isolement, sauf en cas de nécessité liée à des comportements agressifs. Leur environnement est enrichi avec du matériel adapté (papier, abris en carton) pour réduire le stress. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’équipe de recherche et le personnel de l’animalerie afin d’assurer un suivi rigoureux de leur état de santé. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués pour limiter toute souffrance. Les procédures ont été adaptées pour réduire au maximum les nuisances. Des anesthésies locales ou générales sont utilisées lorsque nécessaire lors des injections, avec des aiguilles fines. Pour les prélèvements sanguins, des dispositifs permettant de contrôler précisément les volumes prélevés sont employés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude car il nous permet d'utiliser des modèles de tumeurs issus de lignées cellulaires murines ainsi qu'un modèle spontanné qui se rapprochent des pathologies humaines. Ses ressemblances en termes de physiologie nous permettent d'étudier le rôle du système immunitaire dans le processus tumoral dans sa globalité.

6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".

Objectifs

La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.

Bénéfices attendus

La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.

Devenir

18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.

Raffinement

Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules tumorales directement dans le pancréas, ce qui provoque un adénocarcinome, puis les euthanasie cinq semaines plus tard alors que toutes ont développé un cancer avancé. Il indique que ce stade terminal, marqué par une ascite et des changements de comportement, entraînerait une grande souffrance si la mort n'était pas donnée, une grille de score pouvant avancer la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la relation entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Cette étude permettra de déterminer le rôle exact du TNFR2 sur l’activation du système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral et ainsi en voir l'effet sur la croissance tumorale. Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle pour la détermination des meilleurs protocoles de traitement des tumeurs du pancréas.

Bénéfices attendus

Le TNFR2 participe à l'activation et au maintien de l'activité des lymphocytes T régulateurs. Son absence permettrait de diminuer, voir d'abroger, l'inhibition de la réponse immunitaire antitumorale au sein du micro-envonnement immunitaire. Le bénéfice potentiel est que la réponse immunitaire anti-tumorale soit plus efficace, et permette un ralentissement, voir un arrêt de la croissance tumorale.

Procédures

Il n'y a qu'une intervention effectuée. Les animaux vont subir une opération chirurgicale afin d'effectuer une greffe orthotopique. Ce type de greffe vise à introduire des cellules au sein d’un tissu de même nature. Ainsi les cellules tumorales pancréatiques sont directement injectées dans le pancréas. Cette intervention dure 5 minutes sur un animal sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Cette intervention est accompagnée par l'administration d'analgésiques, Rimadyl et Vetergesic, ceci le jour (Rimadyl et Vetergesic) et le lendemain (Vetergesic) de l'opération. Cette administration est faite par injections intra-péritonéales pour le Rimadyl et en sous-cutanée pour le Vetergesic.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales dans le pancréas va générer l'apparition d'un adénocarinome pancréatique canalaire. Les animaux ont dans les stades terminaux de l'expérimention une déficience pancréatique associée à diiférents autres symptômes (apparition d'ascites, changements comportementaux,...). Les symptômes sont bien sur suivis via une grille de suivi, nous servant à dertiminer quand le point limite de l'expérimentation est atteint.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par dislocation cervicale (ou par asphyxie au dioxyde de carbone le cas échéant), 5 semaines après la greffe des cellules tumorales. A cette date, la mort est donnée car l'ensemble des animaux a developpé un cancer du pancréas avancé. Ce stade peut entrainer une grande souffrance dans les jours qui suivent si la mort n'est pas donnée. Il s'agit d'un point limite de la procédure. Cependant les souris peuvent être sacrifiées avant suivant la grille de suivi de souffrances décrite auparavant et rattachée en annexe 2. En effet si le score de souffrance atteint 4 avant la ciquième semaine, la ou les souris sont mises à mort.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la relation entre le systeme immunitaire et la tumeur, notamment à cause de differents types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas des modèles experimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la meilleure solution pour étudier l’effet de l’absence du TNFR2 sur les cellules immunitaires, nous ne pouvons donc pas élaborer une stratégie de remplacement efficace.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient signifiants. Ce nombre, impliquant les 2 groupes, est estimé à 40 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans ce cadre. Ce calcul est détaillé sur un document rattaché à ce projet nommé annexe 1

Raffinement

Pour les strategie de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques de notre modèle. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille qu’à partir du jour 10 après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille n’apparaissent qu’à partir du jour 18 après la greffe tumorale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort. Nous donnons également deux produits analgésiques différents, dispensés avant, pendant et après l’opération pour réduire au maximum la souffrance physique

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et donc présentent une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.