Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées : 257 projets autorisés en mars 2026 (01/04/2026)
Evaluation d’approches pharmacologiques ciblant une protéine mitochondriale sur la chronologie du cancer colorectal, la fonctionnalité des muscles cardiaques, vasculaires et squelettiques chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Objectifs
L’ion calcium est impliqué dans différents processus favorisant le développement du cancer. A l’échelle cellulaire, les variations de calcium intra-mitochondrial sont essentielles à la production d’énergie pour la cellule. Or, dans les cellules cancéreuses, les mitochondries présentent divers degrés de dysfonctionnement. Ainsi, le développement de nouveaux agents visant spécifiquement ces organites suscite un intérêt croissant dans la lutte contre le cancer. La sortie de calcium de la mitochondrie dépend d'une protéine mitochondriale. Dans le cancer colorectal, cette protéine joue un rôle ambivalent : une diminution de son expression et de son activité entraine une réduction significative de la croissance tumorale, mais semble ensuite favoriser l’apparition de métastases ainsi qu’une résistance à la chimiothérapie. Toutefois, ces résultats proviennent d’expériences in vitro, réalisées sur des cellules probablement adaptées à l’absence de cette protéine. L’utilisation d’approches pharmacologiques ciblant spécifiquement cette protéine apparaît donc indispensable pour mieux comprendre son rôle dans la progression du cancer colorectal. Le calcium mitochondrial joue également un rôle crucial dans la régulation des cellules musculaires. Chez les patients atteints de cancer, le fonctionnement de ces cellules peut être altéré par la maladie elle-même et/ou par les traitements anti-cancéreux, entraînant des complications qui détériorent fortement la qualité de vie des patients. Les effets de stratégies pharmacologiques ciblant la protéine mitochondriale étudiée n’ont pas encore été étudiés sur les organes comportant des cellules musculaires. Ce projet a donc pour objectif d’étudier l’impact systémique du développement du cancer colorectal et des traitements ciblant la protéine d'intérêt, à l’aide d’un modèle de rat génétiquement modifié. Ce modèle est porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains et constitue un modèle pertinent pour reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale.
Bénéfices attendus
À court terme (pendant et juste après le projet) : - Meilleure compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans la progression du cancer colorectal. - Acquisition de données sur les effets du cancer colorectal et des inhibiteurs de la protéine d'intérêt sur la physiologie cardiovasculaire, musculaire et intestinale dans un organisme entier. Comparaison entre la chimiothérapie conventionnelle et l’approche innovante (inhibition de la protéine d'intérêt). - Identification de signatures biologiques associées à la modulation de la protéine d'intérêt et au développement tumoral, en tenant compte non seulement de la tumeur mais aussi des organes périphériques (muscles cardiaques et squelettiques, intestin, foie, tissu adipeux). - Meilleure gestion des effets secondaires : compréhension des impacts métaboliques des approches pharmacologiques ciblant la protéine d'intérêt pour mieux anticiper et limiter les complications cliniques chez les patients. - Production de données essentielles pour justifier le passage à des essais cliniques précoces d’inhibiteurs de la protéine d'intérêt. À long terme (5-10 ans et au-delà) : - Développement de nouvelles classes de médicaments ciblant la protéine d'intérêt, pouvant compléter ou remplacer certains traitements classiques du cancer colorectal. - Intégration des connaissances dans les stratégies personnalisées de traitement du cancer colorectal, en tenant compte du profil tumoral et des comorbidités du patient. - Amélioration de la qualité de vie : réduction des complications cardiovasculaires et musculaires liées aux cancers digestifs et à leurs traitements, grâce à des thérapies mieux tolérées. - Extension à d’autres pathologies : les connaissances acquises pourraient bénéficier à la recherche sur d’autres cancers, mais aussi sur des maladies cardiovasculaires et métaboliques.
Procédures
Injection sur animal vigile de traitement anticancéreux par voie intrapéritonéale 2 fois par semaine pendant 9 semaines (< 5 minutes à chaque fois). Pesée des animaux vigiles : 3 fois/semaine pendant 6 semaines puis 1 fois/jour pendant 3 semaines (< 1 minutes à chaque fois). Mesure de la pression artérielle chez le rat vigile, 2 fois par animal (< 10 minutes à chaque fois). Injection par voie intrapéritonéale d’un anesthésique sur animal vigile (1minute) puis échographie cardiaque (5 minutes). Prélèvement du bloc coeur-poumons sous anesthésie générale profonde 1 fois/animal pendant moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Stress durant le transport des animaux. Stress ponctuel lié à la manipulation/contention des animaux lors des pesées, de la mesure de la pression artérielle et des injections intrapéritonéales. Douleur au niveau des sites d’injection du traitement ou du solvant. Le cancer et le développement tumoral peuvent entrainer des symptômes d'intensité limitée : une perte de poids, une perte d’appétit et une réduction de la mobilité à cause de la cachexie cancéreuse.
Devenir
Les rats ayant subis une échographie uniquement seront réutilisés dans un autre projet. Pour les groupes d’animaux témoins et traités, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs ainsi que plusieurs organes pour caractériser l'effet biologique des traitements. Nous devons pour cela procéder au prélèvement du bloc cœur-poumons, ce qui entraine la fin de vie de l’animal.
Remplacement
L’un des principaux défis de la recherche sur les effets systémiques de la tumeur sur l’hôte réside dans les défaillances multi-organiques qui en résultent. Cette complexité rend le développement de modèles expérimentaux particulièrement difficile. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement ces interactions. Les altérations métaboliques étendues et les atteintes de plusieurs organes compliquent fortement la conception d’approches pertinentes. La recherche dans ce domaine s’appuie notamment sur l’utilisation de biopsies humaines, exploitées directement ou utilisées pour établir des lignées cellulaires et des organoïdes. Cependant, ces approches présentent des limites : quantité et qualité variables des échantillons, accès restreint à certains organes (cœur, intestin, foie) et contraintes éthiques. De plus, les lignées cellulaires immortalisées ne reflètent pas la complexité fonctionnelle des tissus dans leur contexte physiologique. Ces limites nous conduisent à recourir à des modèles animaux et à des expérimentations in vivo, seules approches permettant d’étudier de manière intégrée l’impact de la tumeur sur l’organisme entier.
Réduction
L’étude comporte une étape préliminaire comportant au maximum 10 animaux ainsi que quatre groupes expérimentaux de rats comprenant chacun 13 animaux, soit un total de 62 rats. Ce nombre a été défini pour maintenir un équilibre éthique et scientifique, en garantissant une puissance suffisante pour détecter des effets modérés à forts à l'aide d'outils statistiques tout en limitant l’usage d’animaux.
Raffinement
Une phase d’habituation sera mise en place pour limiter le stress des animaux. Tous les animaux seront hébergés dans un milieu enrichi. Après chaque mesure expérimentale et chaque administration, l’animal recevra une récompense alimentaire. Les animaux seront étroitement surveillés pendant toute la durée du traitement avec, le cas échéant, l'utilisation d'un analgésique et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Notre modèle de rat génétiquement modifié, porteur d'une mutation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux humains, permet de reproduire fidèlement la tumorigenèse intestinale. Ce modèle ne se limite pas à l’étude du développement tumoral : il offre également la possibilité d’analyser les conséquences systémiques du cancer sur l’organisme entier. Ainsi, il permettra d’évaluer à la fois la charge tumorale et l’impact de la maladie sur des fonctions clés telles que la motilité intestinale, la fonction cardiovasculaire et la physiologie musculaire squelettique. Grâce à cette approche intégrative, ce modèle est idéal pour générer des données essentielles à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques et pour justifier, le cas échéant, le passage à des essais cliniques précoces. Les animaux utilisés dans ce projet seront à un stade adulte et âgés de 12 semaines au début du traitement. Ce choix repose sur des considérations physiologiques et méthodologiques. En effet, il s’agit d’une période où l’organisme a atteint sa maturité fonctionnelle et présente une stabilité métabolique, cardiovasculaire et musculaire, conditions indispensables pour obtenir des données fiables et interprétables.
Etude du muscle squelettique chez les rongeurs par Imagerie et Spectroscopie par Résonance Magnétique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Le phénomène de résonance magnétique nucléaire (RMN), a permis de développer les techniques d’imagerie médicale non invasive depuis plusieurs décennies. Les nombreuses innovations qu'a connues la RMN, en imagerie (IRM) et aussi en spectroscopie (SRM), laissent entrevoir de nouvelles applications. Les techniques d’IRM et de SRM sont des outils puissants dans le domaine des pathologies neuromusculaires et cardiaques (suivi de l’infiltration graisseuse, de l’inflammation, de l’œdème, des atteintes métaboliques…) et sont sans cesse en développement. Le projet soumis ici a pour but de développer dans la durée de nouvelles méthodes d’imagerie et de spectroscopie RMN pour améliorer l’évaluation du muscle squelettique et cardiaque chez les rongeurs. Ces outils pourront ensuite être utilisés en routine dans les projets en expérimentation animale ou transposés en clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - D’un point de vue cognitif, il va permettre d’améliorer notre connaissance sur le tissu musculaire, sa structure et son fonctionnement. - D’un point de vue recherche préclinique, il va permettre la mise en place d’outils d’évaluation du muscle et le développement de nouveaux biomarqueurs du tissu musculaire. Ces nouveaux outils et biomarqueurs pourront ensuite être transposés en recherche clinique.
Procédures
L’ensemble des examens par résonance magnétique nucléaire (RMN), ainsi que l’induction des lésions musculaires localisées, seront réalisés sous anesthésie gazeuse. La durée maximale des examens RMN sera de 3 heures. Chaque animal pourra être soumis à un maximum de 12 examens RMN, espacés d’un intervalle minimal de 15 jours. L’induction des lésions musculaires sera brève, ne dépassant pas 15 minutes. Une analgésie préalable à la lésion sera effectuée par injection d’un analgésique. Les injections d’agent de contraste seront effectuées sur animal sédaté pendant l’examen RMN et le volume d’agent de contraste sera calculé de façon à avoir une concentration adaptée au poids corporel. À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés après sédation, afin de permettre le recueil des échantillons musculaires.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances qui sont attendues sont liés aux anesthésies mise en œuvre dans ce projet pouvant induire une détresse respiratoire, si une fréquence respiratoire inférieure à 60 cycles/minute persiste, et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut. Dans le cadre du développement des méthodes d’imagerie, l’utilisation d’un agent de contraste sera nécessaire. Cette injection n’induit pas d’effets secondaires sauf une légère irritation au moment de l’injection en qui s’accompagne d’une augmentation transitoire de la fréquence respiratoire (quelques secondes). Enfin les modèles utilisés pour la validation des méthodes d’imagerie sont des modèles de dégénérescence/régénération musculaire peu traumatiques. Les lésions musculaires mises en œuvre n’induisent pas de phénotype dommageable ni perte de fonction mais pourrait réduire transitoirement un inconfort et une réduction de la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure expérimentale, afin de permettre le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) s’inscrit dans le premier principe des 3R, Remplacer, en permettant d’évaluer in vivo un grand nombre de paramètres du tissu musculaire, réduisant ainsi le recours aux techniques invasives telles que l’histologie ou la biochimie, qui nécessitent souvent l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement d’échantillons. Toutefois, à ce jour, aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement la complexité architecturale ni le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. L’utilisation de modèles animaux demeure donc indispensable à l’étude de ces tissus. Divers modèles animaux de pathologies neuromusculaires sont disponibles, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement répandus en recherche fondamentale et préclinique en raison de leur facilité de manipulation liée à leur petite taille, ainsi que de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques phénotypiques des pathologies humaines, telles que la fibrose, les cycles de dégénérescence/régénération musculaire et les processus inflammatoires.
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiples à partir d’un même animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie RMN, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effets nocifs pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Le nombre total d’individus est de 595 individus. Les sous-groupes d’animaux sont au minimum de 10 individus. Ce nombre a été estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques standards.
Raffinement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) répond également au troisième principe des 3R, Raffinement, grâce à l’évolution continue des outils méthodologiques et aux avancées technologiques en électronique, qui permettent aujourd’hui d’atteindre, en préclinique, des résolutions environ 3000 fois supérieures à celles obtenues avec les dispositifs cliniques les plus performants. Le raffinement s’applique également aux conditions d’hébergement des animaux, maintenus en groupes dans des cages à usage unique placées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement de l’environnement (tubes en carton, copeaux pour la nidification). Toutes les procédures RMN seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité des animaux et de minimiser leur stress. Les modèles lésionnels seront mis en œuvre par du personnel qualifié, notamment pour les injections de notexine, de peptides et pour l’électroporation, réalisée sous anesthésie. La température corporelle sera maintenue à 38 degrés Celsius grâce à un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire suivie en continu à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. L’état de santé des animaux fera l’objet d’une surveillance quotidienne, conformément à la législation en vigueur, et leur poids sera systématiquement contrôlé avant chaque expérimentation afin de détecter toute perte anormale. Des points limites liés à l’état général de l’animal, la réalisation des lésions et la réalisation des examens RMN ont été définis.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et des conditions d’hébergement relativement simples qu’elles requièrent, les souris constituent un modèle animal aisément manipulable et largement utilisé en recherche biomédicale. L’ensemble des procédures sera réalisé chez des animaux ayant atteint l’âge adulte, compris entre 2 et 15 mois. Ce choix vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’affecter la qualité des mesures, notamment en termes de répétabilité et de reproductibilité. Le développement méthodologique prévu dans ce projet nécessitera, dans une première phase, le recours à des animaux issus d’élevages commerciaux, avant une application ultérieure à des modèles pathologiques bien caractérisés. Les modèles lésionnels induits permettent d’étudier les mécanismes impliqués dans le développement de pathologies humaines. Dans le cadre de cette demande d’autorisation, qui concerne exclusivement un développement méthodologique, le choix a été fait de restreindre l’étude à des animaux de sexe mâle.
Effet de l’hypoxie intermittente sur la biologie du muscle squelettique et des cellules souches musculaires en homéostasie et lors de la régénération musculaire.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Le Syndrôme d’Apnées Obstructives du Sommeil (SAOS) est le trouble respiratoire du sommeil le plus courant, qui touche plus d’un milliard de personnes dans le monde. Cette maladie chronique se caractérise par des épisodes répétés de l'affaissement complet ou partiel des voies aériennes supérieures entraînant une diminution transitoire de la saturation en oxygène appelée hypoxie intermittente. Cette succession de phases hypoxiques et de réoxygénations crée un déséquilibre d’approvisionnement des organes en oxygène, responsable de nombreux effets délétères pour notre organisme tels que de l’inflammation, des anomalies vasculaires et de la mortalité cellulaire. Certains patients atteints de SAOS présentent des changements structurels et bioénergétiques dans les muscles squelettiques impliqués dans la respiration mais l’impact de l’hypoxie intermittente sur la biologie des muscles squelettiques périphériques et des cellules souches musculaires reste méconnu. Chez l’adulte, le muscle squelettique a une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites nommées ainsi du fait de leur localisation en périphérie des fibres musculaires. Elles sont présentes dans toutes les masses musculaires squelettiques, où elles résident dans un état de repos jusqu’à ce que des stimuli notamment environnementaux viennent les solliciter afin de participer à l’homéostasie et à la régénération musculaire. Notre hypothèse est que l’hypoxie intermittente joue un rôle délétère sur la fonction des cellules satellites en homéostasie ou au cours de la régénération musculaire. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’impact de l’hypoxie intermittente sur l’homéostasie du muscle squelettique et au cours de la régénération chez la souris saine, jeune ou âgée, mâle ou femelle.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’hypoxie intermittente liée au SAOS perturbe l’homéostasie du muscle sain ou en régénération, chez des sujets jeunes ou âgés, mâles ou femelles.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de trois : 1. Modèle de régénération musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 2. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 3. Prélèvement sanguin sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Exposition à une hypoxie intermittente (28 ou 56 jours) 2. Mesure de la perfusion sanguine sur animal anesthésié (2 fois / souris, durée : 15 min) 3. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition à l’hypoxie intermittente : à l'hypoxie au début de l'expérimentation et au bruit généré par la machine ainsi qu'une fatigue chez les souris due à une faible qualité de sommeil. Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire passées les 24 premières heures post-lésionnelles suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à l’hypoxie intermittente.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures afin de permettre les analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour répondre à nos questions biologiques.
Remplacement
Afin de tester l’impact direct de l’hypoxie intermittente sur la biologie des cellules satellites, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux, présentant des similitudes au niveau des systèmes de réparation du muscle squelettique humain, reste essentielle afin d’étudier les effets délétères de l'hypoxie intermittente sur le muscle squelettique. Par ailleurs, les souris âgées peuvent fournir des notions importantes sur l’impact de l’hypoxie intermittente sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés (*) et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=8-10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle dans notre modèle de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à l’hypoxie intermittente. (*)Un test de Student (également appelé test T) sera utilisé pour comparer deux groupes (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente versus contrôle). Pour les comparaisons multiples (effet de l’exposition à l’hypoxie intermittente en fonction du sexe et/ou de l’âge), nous utiliserons des tests ANOVA à un ou deux facteurs. Une valeur p < 0,05 sera considérée comme statistiquement significative.
Raffinement
Les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour le modèle de lésion musculaire, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon quotidienne pendant les 2-3 premiers jours suivant le début de l’exposition à l’hypoxie intermittente et l’induction de la lésion musculaire afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris Tg :Pax7-GFP et Tg :Pax7CT2mTmG permettent l’expression ciblée de protéines fluorescentes dans les cellules satellites afin de faciliter leur analyse spatiale en histologie et/ou leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. Le modèle de lésion musculaire utilisé n'entraine aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous utiliserons des outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 4 mois. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact de l’hypoxie intermittente.
Rôle des microtubules dans les cellules souches musculaires pour le maintien et la régénération du muscle squelettique chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Le muscle squelettique a une capacité remarquable de régénération grâce à la présence de cellules souches musculaires (CSM) en son sein. Les CSM du muscle sain sont dans un état de dormance. En revanche, suite à une lésion, les CSM s’activent, c’est-à-dire qu’elles se réveillent pour se multiplier, se différencier et fusionner pour réparer le muscle. C’est la régénération musculaire. En parallèle, quelques CSM s’auto-renouvellent et retournent en dormance pour maintenir leur stock tout au long de la vie. Lorsque les propriétés de dormance, multiplication, auto-renouvellement ou différenciation des CSM sont compromises, la régénération et la fonction musculaire sont altérées, ce qui conduit à des pathologies du muscle (myopathies). Toutes ces propriétés sont largement régulées par des facteurs extracellulaires, c’est-à-dire les autres types cellulaires du muscle (fibres musculaires, vaisseaux sanguins, nerfs et tissus conjonctifs). Elles dépendent également de la capacité de la CSM elle-même à adapter sa forme aux contraintes de l’environnement. Nos travaux visent à déterminer les rôles de protéines spécifiques de la cellule qui contrôlent la forme des CSM dans ces processus physiologiques. Nous proposons d’utiliser 3 lignées de souris qui permettent d’induire la perte d’expression, spécifiquement dans les CSM, de gènes codant ces protéines impliquées dans la stabilité cellulaire. La perte d’expression de ces gènes sera induite dans le muscle sain pour définir leurs rôles dans la dormance des CSM, et au cours de la réparation musculaire. A terme, nos travaux permettront d’identifier de nouveaux mécanismes qui contrôlent les activités des CSM et donc, la réparation du muscle squelettique.
Bénéfices attendus
Le muscle squelettique adulte est l’un des tissus les plus remarquables : il peut se régénérer en cas de lésion. À l’origine de cette capacité se trouve un réservoir de cellules souches musculaires (CSM). Les CSM ont une activité qui dépend largement de leurs interactions avec les autres types cellulaires présents dans le tissu et nécessaires à leur bon fonctionnement. Cependant, la possibilité que la CSM puisse auto-réguler ses activités, indépendamment de ses voisins cellulaires, commence juste à être exploré, révélant l’importance de protéines de l’architecture des cellules. Ces protéines d’architecture régulent la mobilité ou la forme des cellules. Dans ce projet, nous allons investiguer le(s) rôle(s) des protéines d’architecture indispensables au bon fonctionnement des CSM dans le muscle sain et en régénération. En utilisant 3 modèles de souris dont les gènes invalidés dans les cellules souches musculaires définissent l’architecture cellulaire, c’est-à-dire la forme des cellules, notre projet permettra d’établir leurs rôles i) pour le maintien en dormance des CSM et ii) pour la régénération du muscle squelettique adulte. D’un point de vue scientifique, ceci permettra d’accroitre les données fondamentales sur les mécanismes qui régulent la fonction des CSM. En santé humaine, nos résultats pourraient révéler de nouvelles voies thérapeutiques dans des contextes de maladies où ces mécanismes sont altérés. Par exemple, identifier des molécules qui maintiennent les cellules souches en dormance permettrait de préserver leur efficacité tout au long de la vie.
Procédures
Tous les animaux (720) recevront une injection quotidienne pendant 4 jours consécutifs d’une durée inférieure à 2 minutes pour chaque injection. Une partie des animaux (420) recevra une injection d’analgésique (durée = 1 minute) et deux injections dans la même patte (durée = 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections nécessitent la contention des souris qui peut induire un stress léger chez l’animal. Les injections qui induisent une lésion des groupes musculaires injectés peuvent engendrer une gêne légère et transitoire lors de la reprise de locomotion au réveil (patte blessée légèrement rétractée).
Devenir
Les analyses moléculaires et histologiques nécessitent le prélèvement complet des tissus musculaires (ceci est incompatible avec un suivi longitudinal du même individu tout au long de sa vie). Il est donc indispensable de mettre à mort les animaux à chaque point identifié au cours des procédures.
Remplacement
Ce projet porte sur l’analyse des cellules souches musculaires dont le comportement dépend largement de l’environnement tissulaire et des voisins cellulaires des cellules souches. Sans cet environnement, les cellules souches perdent leurs fonctions. De plus, le tissu musculaire est un tissu complexe dans lequel résident de nombreux types cellulaires comme les vaisseaux sanguins, les cellules du tissu conjonctifs ou les nerfs. Tous communiquent avec la cellule souche musculaire pour contrôler ses fonctions. A ce jour, il n’est pas possible de reproduire l’environnement tissulaire des cellules souches musculaires in vitro. Il n’est donc pas possible de se passer du modèle animal.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses, histologiques, cellulaires et moléculaires. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car les cellules souches musculaires ont un comportement similaire entre les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les personnes impliquées dans ce projet prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les injections seront réalisées par un seul expérimentateur pour que les animaux soient habitués à l’expérimentateur, afin de minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. L’injection permettant d’induire le processus de réparation musculaire est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux sont placés sur des tapis chauffants jusqu’au réveil complet de l’animal. Comme la locomotion des animaux peut être limitée dans les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutés au sein des cages pour leur permettre une alimentation et une hydratation constante. Des points limites adaptés à nos procédures ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Les animaux seront hébergés en groupe (2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social. Ils auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture et en conditions de température et hygrométrie contrôlées. Les cages seront enrichies avec des abris en carton et des lanières de papier Kraft.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les modèles de souris présentés dans notre projet vont permettre de déterminer quels sont les rôles du squelette cellulaire pour réguler les fonctions de la cellule souche musculaire dans le muscle non blessé ou en régénération. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale du devenir et de la progression des cellules souches musculaires dans le muscle sain de souris jeune adulte, adulte et âgée ou dans le muscle lésé.
Evaluation non-invasive par Résonance Magnétique Nucléaire des altérations histopathologiques des muscles squelettiques dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Ce projet répond à un besoin critique en médecine : disposer de mesures objectives pour suivre la progression des maladies neuromusculaires (NMDs) et fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques. Bien que les biopsies musculaires soient largement utilisées pour la caractérisation des NMDs, elles sont invasives, non répétables en clinique et limitées par l’hétérogénéité de l’atteinte musculaire dans ces maladies. Dans ce contexte, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) offre un moyen non invasif d’évaluer régulièrement l’état des muscles dans leur ensemble. Plus spécifiquement, pour les études cliniques, l’IRM de la fraction de graisse est devenue un biomarqueur incontournable pour caractériser l’évolution de la dégénérescence musculaire et son remplacement par du tissu graisseux. Cependant, il existe un besoin urgent de développer une mesure plus anticipative, capable d’évaluer les modifications tissulaires précoces précédant le remplacement graisseux.
Bénéfices attendus
Les maladies neuromusculaires (NMDs) et la sarcopénie sont des affections gravement débilitantes qui impactent profondément la qualité de vie des patients et de leurs proches, tout en imposant un lourd fardeau au système de santé publique. L'absence de mesures objectives permettant de suivre la progression naturelle de ces maladies et de fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques freine le développement thérapeutique. Le développement d'une méthode alternative à la biopsie musculaire, capable de caractériser les altérations microstructurales des muscles dans leur intégralité et de manière répétée, représenterait une avancée significative. Une telle approche améliorerait considérablement la compréhension de la progression des maladies et renforcerait notre capacité à évaluer l'efficacité des traitements. Cette innovation mènerait à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au développement des maladies, à des stratégies thérapeutiques optimisées et, in fine, à une amélioration notable des soins et de la qualité de vie des patients.
Procédures
Trois lots de souris subiront plusieurs examens identiques d’IRM des membres postérieurs. Chaque examen a une durée maximale d’environ 2 heures. Au terme de leur dernier examen, chaque animal sera euthanasié afin de permettre des prélèvements histologiques musculaires sur les membres postérieurs. Le premier lot servira à établir les valeurs de référence et la précision des différentes métriques d’IRM et d’histologie. Les souris de ce lot subiront trois examens d’IRM espacés d’au moins une semaine. Pendant chaque examen, les souris seront anesthésiées avec un gaz afin d’éviter tout stress ou mouvement, et de garantir leur confort. Leur respiration sera surveillée en continu, et des soins seront apportés pour éviter tout dessèchement oculaire lié à l’anesthésie. Les animaux seront installés confortablement sur le dos, les pattes maintenues délicatement pour assurer des images de bonne qualité. L’examen est totalement indolore et non invasif. Il permet de collecter des données précises sur les muscles des pattes arrière, sans aucune chirurgie. Le deuxième lot de souris, réparties en six groupes, subira deux examens d’IRM. Après le premier examen, qui servira de valeur de référence (Baseline), une lésion musculaire localisée sera induite, sous anesthésie, sur l’un des membres postérieurs. Cette intervention dure moins de 15 minutes. Un analgésique prophylactique sera administré avant la lésion afin de minimiser la douleur et l’inconfort des animaux après l’intervention. Ensuite, chacun des six groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle différent après lésion (24 heures, 48 heures, 4 jours, 7 jours, 12 jours et 1 mois). Le troisième lot de souris, réparties en cinq groupes, subira également deux examens d’IRM. Après le premier examen de référence, un des membres postérieurs de chaque souris sera immobilisé à l’aide d’un plâtre, sous anesthésie. Cette intervention dure moins de 20 minutes. Ensuite, chacun des cinq groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle post-immobilisation différent (4 jours, 7 jours, 10 jours, 14 jours et 21 jours). Le plâtre sera retiré avant l’examen. De manière générale, pour les groupes soumis à une immobilisation prolongée, le plâtre sera retiré périodiquement, sous anesthésie, pour inspection, hygiène et, si nécessaire, soins du membre immobilisé, puis remis immédiatement. En cas de signes de douleur, un analgésique sera administré une fois par jour.
Impact sur les animaux
Un examen d’imagerie par resonance magnétique (IRM) in vivo nécessite l’immobilisation du sujet pendant la durée de l’examen. Dans ce projet, cela est accompli en réalisant les examens sous anesthésie générale. Cet examen est non-invasif, atraumatique et sans douleurs. La seule nuisance associée à cette procédure une légère diminution du rythme respiratoire, accompagnée d’une légère baisse de la température corporelle pendant la durée de l’examen (moins de 2 heures), attribuable à l’anesthésie. Dans un lot de souris, une lésion musculaire unilatérale sera induite sous anesthésie dans un des membres postérieurs des animaux. Cette lésion peut provoquer de la douleur et une légère réduction de la mobilité pendant les 4-7 jours suivant la lésion, avec un pic inflammatoire observé autour du 4ᵉ jour. Une régénération complète du muscle est prévue un mois après la lésion. Dans un autre lot de souris, l’immobilisation d’un des membres postérieurs à l’aide d’un plâtre entraînera une diminution modérée de la mobilité. Cette immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et induira un processus d’atrophie musculaire dans le membre concerné. Les souris pourraient également ressentir du stress en raison de l’inconfort causé par le plâtre et par la restriction de leurs mouvements naturels. De plus, une irritation cutanée sous le plâtre pourrait survenir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale afin de permettre des prélèvements musculaires sur les membres postérieurs pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les techniques développées dans ce projet ont pour objectif final l’imagerie quantitative in vivo. Des processus physiologiques tels que les échanges compartimentaux (intracellulaire, interstitiel, vasculaire) et la perfusion tissulaire influencent significativement le signal de RMN et, par conséquent, le modèle biophysique à établir. À ce jour, aucun substitut synthétique ne permet de reproduire fidèlement les caractéristiques du tissu musculaire vivant, ce qui nous contraint à recourir à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.
Réduction
L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir de nombreuses informations différentes sur les muscles, à partir d’un seul examen. Comme cet examen est non invasif et sans douleur, il peut être répété plusieurs fois sur le même animal sans effet nocif. Cela permet de suivre l’évolution des tissus dans le temps tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Pour cette étude, un total de 120 animaux sera utilisé, répartis en 12 groupes de 10 souris. Ce nombre a été déterminé grâce à un calcul préalable (calcul de puissance) afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables et statistiquement significatifs. En effet, il est important d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour pouvoir identifier clairement les effets étudiés, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Elles permettront notamment d’évaluer la fiabilité des mesures IRM, de déterminer si les changements observés dans les muscles sont significatifs, et de comparer les résultats obtenus par IRM avec ceux observés au microscope après prélèvement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, de fond plat avec de la litière de contact et bénéficiant d’un environnement enrichi avec du papier absorbant et des tubes en carton pour la construction de nids. Les animaux bénéficiéront également d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours. Les examens IRM se dérouleront sous anesthésie générale afin de garantir l’immobilité des animaux pendant les acquisitions et de minimiser leur stress. Afin de prévenir le dessèchement de la cornée et d’assurer le bien-être des animaux pendant les examens prolongés sous anesthésie, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris dès l’induction de l’anesthésie. La température corporelle sera maintenue à environ 38 degrés Celsius à l’aide d’un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire surveillée en continu. Pour le lot de souris subissant une lésion musculaire localisé, un analgésique prophylactique sera administré pour minimiser la douleur et l’inconfort post-lésion. Les animaux dont un membre postérieur est immobilisé par un plâtre seront surveillés quotidiennement. Le plâtre sera conçu de manière à laisser les orteils de la patte immobilisée visibles, permettant ainsi de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Une attention particulière sera portée aux signes tels qu’un grattage excessif du membre immobilisé, des irritations cutanées, des blessures dans la partie proximale du membre, ou une coloration anormale des orteils. Le plâtre sera retiré au moins une fois à chaque 7 jours, sous anesthésie, afin de garantir l’hygiène de la patte et d’évaluer son état. En cas de blessure superficielle, la zone sera désinfectée et un pansement appliqué. Si des signes de douleur sont observés, un analgésique sera administré. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Toute modification significative et persistante du comportement, qui puisse suggérer un signe de douleur excessive constituera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’euthanasie de l’animal sera réalisée conformément aux protocoles éthiques en vigueur.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et de la facilité avec laquelle elles peuvent être hébergées, les souris constituent un modèle animal pratique à manipuler. Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche biomédicale et a été développé pour étudier un large éventail de pathologies humaines, en particulier les maladies Neuromusculaires. Par ailleurs, notre laboratoire a développé de nombreux outils dédiés à l’imagerie et à la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, spécifiquement adaptés à l’étude du muscle squelettique chez les souris. Du point de vue technique, la petite taille des souris est aussi compatible à l’étude par RMN dans des machines d’IRM considérablement plus petites et moins couteuses, même si à haut champ magnétique. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes jeunes (12 à 16 semaines). Ce choix permet de s’affranchir des variations liées au développement/maturation tissulaire qui peuvent avoir un impact significatif sur les mesures. Cet intervalle d’âges inclut les différents points temporels décrits dans les procédures expérimentales.
Étude du métabolisme du muscle squelettique après une insuffisance circulatoire aigue chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes. In fine, il s’agit de positionner le muscle squelettique comme une possible cible thérapeutique afin d’améliorer le devenir des patients en réanimation et en péri-opératoire.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet présente un intérêt important pour le laboratoire de recherche puisqu’il permettra la mise en place d’un modèle d’insuffisance circulatoire aigue chez la souris dont l’objet principal sera l’étude du métabolisme musculaire. Ce modèle est conçu pour être au plus proche de la présentation et la prise en charge de l’ICA chez l’humain. Par ailleurs, ce modèle s’intègre dans une démarche translationnelle puisqu’il viendra compléter un essai clinique sur l’ICA en chirurgie cardiaque. Ce projet scientifique pourrait constituer une avancée importante dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques en anesthésie et réanimation, centrées sur le muscle squelettique. Grâce à la meilleure compréhension physiopathologique du rôle du muscle dans la récupération après une agression, nous souhaitons mettre en évidence des cibles métaboliques pour identifier les patients à risque de présenter des complications post-opératoires ou une hospitalisation prolongée en réanimation. Cela permettra d’améliorer la qualité des soins et la sélection des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à un grip test (3 répétitions du test d'une durée de quelques secondes chacune, entrecoupées de 2 à 3 minutes de repos) ainsi qu'à une procédure chirurgicale (ICA) de 3 h maximum, sans réveil.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues se résument au stress lors du grip test (maximum 10 minutes au total) et de l'anesthésie générale (quelques secondes avant endormissement).
Devenir
A la fin de chacune des procédure, l'ensemble des animaux est mis à mort, par des personnes formées et compétentes, dans le but de collecter et d'analyser les tissus d'intérêt (sang, muscle squelettique, rein, foie, cerveau). Ces analyses (biochimie, expression genique, histologie) permettront d'explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes.
Remplacement
L’étude de l’insuffisance circulatoire aigue et de la communication inter-organes qui lui succède nécessite un modèle intégratif permettant la prise en compte de l’action à distance de tous les organes après une ICA. De ce fait l’analyse ne peut être réalisé qu’in vivo pour garde un niveau d’information suffisant. L’intérêt de cette recherche réside aussi dans son potentiel applicatif et l’utilisation de critères de jugement fonctionnels. Il n’existe à ce jour pas d’autre méthode fiable d’analyse systémique de la communication inter-organe.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur les données bibliographiques actuelles. Compte tenu de la variabilité des réponses individuelles et du risque de décès durant l'ICA tant que les conditions expérimentales ne sont pas arrêtées, des groupes de 15 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. De plus, une veille bibliographique a été effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche et pour utiliser les travaux susceptibles de nous aider dans notre démarche (définir les niveaux d'hypotension à tester, les durées d'ICA notamment). Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement pour repérer les blessures éventuelles, comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur sont réalisées sous anesthésie chirurgicale et un analgésique est utilisé en parallèle de ces procédures. Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé. Lors de l'ICA, si la pression artérielle moyenne chute en deçà de la valeur définie dans le protocole, une perfusion du sang de l'animal (prélevé pour l'ICA et hépariné) sera réalisée pour maintenir la pression à la valeur choisie.
Choix des espèces
Les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et la souche choisie pour ce projet a déjà été utilisée pour la réalisation d’un modèle d’ICA permettant l'étude de la fonction renale dans la littérature. Notre modèle s'intéresse à l'altération musculaire. Nous prenons donc exemple sur ce premier modèle publié et l'adaptons pour l'étude du muscle squelettique. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, pour ne pas interférer avec les mécanismes mis en jeu au cours du développement.
Stratégies de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions du muscle squelettique.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Le muscle squelettique adulte contient des cellules souches appelées Cellules Satellites (CS), qui lui permettent de se réparer après une blessure. Cependant, dans certaines conditions pathologiques (maladies musculaires) ou post-traumatiques (accidents, chirurgie), cette capacité de réparation est altérée, et le muscle ne peut plus fonctionner normalement. Nous utilisons les CS pour développer des traitements pour aider le muscle à se réparer après une lésion traumatique. Nos travaux s’articulent selon 3 projets de recherche : 1) L’optimisation des méthodes de purification des CS : nous améliorons les méthodes de purification des CS humaines pour augmenter la quantité de cellules obtenues et leur qualité pour la clinique, mais également des CS de souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche (Réduction). 2) Le développement de méthodes permettant de produire un nombre élevé de CS humaines in vitro tout en préservant leur pouvoir réparateur (capacité à réparer un muscle endommagé et à reconstituer un pool de CS appelé auto-renouvellement). 3) Le développement de stratégies de médecine régénérative pour réparer les lésions musculaires massives post-opératoires ou post-traumatiques, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Nous étudions le potentiel thérapeutique de nouveaux matériaux associés à différentes sources de cellules ayant un pouvoir de réparation du muscle (les CS et les cellules souches pluripotentes induites [iPSC] humaines).
Bénéfices attendus
Projet 1 : Court terme : Améliorer le rendement de purification des CS de rongeurs permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés la recherche pré-clinique sur les CS. Long terme : Améliorer le rendement de purification des CS humaines permettra de franchir une étape vers leur utilisation clinique en thérapie cellulaire. Projet 2 : Court terme : Nos expériences permettront de mieux comprendre la façon dont les CS humaines fonctionnent et ainsi d’élaborer une méthode pour préserver leurs pouvoir réparateur in vitro. Long terme : Préserver le pouvoir réparateur des CS humaines permettra d’élaborer des traitements pour les lésions musculaires localisées (ex : l’insuffisance urinaire et certaines pathologies musculaires). Projet 3 : Court terme : Notre projet permettra de mieux comprendre les évènements intervenant lors d’une lésion massive des muscles (ou VML), et de développer des approches de médecine régénérative pour remplacer le muscle lésé. Long terme : Nos approches de médecine régénérative conduiront vers le développement clinique de stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions musculaires massives.
Procédures
4 injections intrapéritonéales (IP) sur animal vigile : 2 min (1 fois/jour) ; 1 injection intramusculaire (IM) sous anesthésie générale : 10 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesure force musculaire : 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie et électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesures extension du genou sous électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min (3 fois/souris).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent générer un inconfort passager pendant l’injection. Aucune perte de mobilité n’a été constatée. L’injection intramusculaire d’une toxine induisant une destruction des fibres musculaires est source de douleur. Les animaux retrouvent leur mobilité 10 à 15 min maximum après l’injection. L’ablation partielle du quadriceps est source de douleur pour l’animal. Les animaux retrouvent leur mobilité totale 2h après la chirurgie. La mesure de force musculaire in situ est source de douleur. Les électro-stimulations réalisées sur les muscles d’animaux anesthésiés sont de faible intensité mais peuvent être source d’inconfort. Aucune perte de mobilité n’est constatée. Pour toutes les procédures, des points limites adaptés ont été déterminés et seront appliqués.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures.
Remplacement
Pour l’ensemble de nos projets, les expériences seront réalisées en priorité sur des CS humaines quand cela sera possible. L’expérimentation sur les animaux ne sera utilisée que pour valider nos données in vitro et in silico (Evaluation du potentiel de greffes des hCS préamplifiées in vitro), ou lorsque les processus biologiques doivent être étudiés au niveau de l'organisme entier (Approches d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions VML). Ces projets pré-cliniques ont un fort potentiel translationnel pour le traitement des lésions musculaires focales et des lésions musculaires massives (VML), et doivent donc être validés in vivo sur l’animal avant d'envisager un transfert vers la clinique.
Réduction
Afin de respecter le principe de Réduction dans nos projets, nous avons calculé le nombre d’animaux minimum (strictement nécessaire) par des analyses statistiques (test de puissance). Pour les différents axes, le nombre d’animaux a été calculé indépendamment, en tenant compte des résultats déjà obtenus, de la variabilité inhérente aux différentes procédures expérimentales, et des résultats déjà disponibles dans la littérature scientifique. De plus, toutes les expériences seront conçues et programmées de manière à recueillir le maximum de données par animal. Par exemple, un même muscle sera utilisé pour la mesure de force et plusieurs autres analyses.
Raffinement
Le concepteur et l’applicateur du protocole prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les expérimentations seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Le milieu sera enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, carré de coton compacté et billes de bois. Les protocoles d’analgésie pré- et post-opératoires seront adaptés en fonction de la procédure expérimentale. Ils pourront également être adaptés pendant la réalisation des procédures de façon à limiter au maximum la douleur pouvant être ressentie par l’animal. Les procédures nécessitant l’anesthésie des animaux sont étudiées pour assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie et pour limiter les difficultés de récupération pendant la phase de réveil des animaux. Pour prévenir tout risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur une plate-forme chauffante pendant l’intervention et la phase de réveil , et ne sont remis en stabulation qu’une fois actifs. Les animaux seront à nouveau contrôlés 2 heures après le réveil et de la nourriture humidifiée et de l’hydrogel seront placés dans la cage pour en faciliter l’accès, pendant les premières 24h suivant l’intervention, les potentiels signes de souffrance seront surveillés. Si l’un des point limites énumérés dans le projet était atteint, l’animal concerné serait immédiatement mis à mort (directive européenne 63/UE/2010).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour 2 principales raisons : (1) La disponibilité des modèles transgéniques reporteurs et immunodéprimés nécessaires à nos expériences de greffe, (2) La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Les expériences de greffe et de réparation post-lésionnelle ne peuvent être réalisées que sur des souris adultes en raison de la taille des souris. De plus, le processus d’auto-renouvellement des cellules souches (retour à l’état quiescent) ne peut être étudié que sur le muscle adulte.
Mise au point de virus adéno-associés ciblant les cellules souches du muscle squelettique à des fins de thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les cellules souches du muscle squelettique (aussi appelées cellules satellites) sont essentielles dans le processus de la régénération musculaire, et pourraient être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies. Par contre, ces cellules sont entourées par plusieurs autres types de cellules. Les thérapies géniques pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en utilisant des vecteurs de gènes ciblant spécifiquement ces cellules souches, et en évitant ainsi l’expression des gènes apportés (transgènes) dans d’autres populations cellulaires, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Nous allons utiliser des virus adéno-associé (AAV) pour tester des séquences régulatrices de gènes seulement exprimés dans les cellules satellites, afin de créer des vecteurs qui peuvent cibler les cellules souches du muscle squelettique. Des rats sauvages ou avec une dystrophie musculaire provoquée par mutation du gène Dmd, responsable de la production de la dystrophine, seront injectés par voie intramusculaire avec les AAVs. Le ciblage des cellules souches sera examiné par analyse en immunofluorescence sur coupe histologique et cytométrie en flux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des séquences d’ADN qui permettent une expression spécifique des transgènes dans les cellules souches du muscle squelettique. De telles séquences ne sont pas connues à ce jour, donc cette identification représentera une avancée importante dans notre connaissance du ciblage et de la régulation génique dans les cellules souches. Du point de vue clinique, ces séquences seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets non-ciblés et des réponses immunitaires.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront une injection intramusculaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nous attendons une douleur légère liée avec l’injection intramusculaire, qui sera traitée avec des analgésiques pendant deux jours suivant l’injection. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seraient mises à mort à l’âge de 1,5-2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous réalisons des cultures de myoblastes en première intention pour tester nos séquences d’intérêt. Malheureusement, ces cultures restent loin de la situation in vivo puisque les vraies cellules souches du muscle sont quiescentes chez l’adulte, se divisant rarement, ce qui rend impossible la mise au point d'un système d'étude représentatif in vitro. De plus, nos expériences antérieures ont montré que certaines séquences prometteuses en culture n’avaient pas toujours une activité spécifique in vivo. Compte tenu de ces contraintes, il reste nécessaire de valider les séquences selectionnées dans un modèle animal.
Réduction
Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par AAV et point de temps. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure de façon significative.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à l’âge d’un mois. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. D’abord, nous utilisons un modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne dans le rat, qui récapitule le phénotype humain. Le rat est aussi un mammifère, et beaucoup des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les AAVs sont conservées chez l’humain. Donc si une séquence a une activité forte dans des cellules de rat, il est probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les rats utilisés en procédure 1, les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules souches du muscle sont plus accessibles au virus à ce stade.
Analyse du potentiel de biomatériaux innovants pour la régénération du muscle squelettique dans un modèle souris de perte volumétrique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
La perte musculaire volumétrique (VML) peut résulter de traumatismes ou de chirurgies (tumeurs, infections), affectant aussi bien les civils que les militaires. Elle entraîne des déficits fonctionnels et esthétiques permanents. Lorsque la fibre musculaire est endommagée ou lorsque la VML dépasse 20% de la masse musculaire, le tissu perd sa capacité à se régénérer, et une fibrose se développe, réduisant la fonctionnalité musculaire. La régénération musculaire repose sur l’action des cellules souches musculaires activées par l’inflammation pour reconstruire les fibres musculaires endommagées. Cependant, chez les diabétiques, la cicatrisation musculaire est ralentie par des mécanismes comme l’hyperglycémie, qui altère la microcirculation et diminue l’apport en oxygène. Il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. Pour traiter ces lésions, l’ingénierie tissulaire utilise des biomatériaux qui imitent la matrice extracellulaire naturelle pour soutenir les cellules et favoriser la formation de nouveaux tissus, tout en limitant la fibrose. Ce projet se concentre sur la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en utilisant des biomatériaux innovants.
Bénéfices attendus
Actuellement les lésions musculaires dues à des traumatismes, infections ou tumeurs sont mal tolérées par le muscle et entrainent des douleurs et une perte de fonctionnalité. Cette étude nous permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales afin de réparer ces lésions musculaires chez le patinent non diabétique et diabétique.
Procédures
Les souris subiront au maximum un prélèvement de sang à la queue pour une glycémie, une chirurgie musculaire sous anesthésie générale de 30 minutes, un test de performance de course sur tapis après cicatrisation de 20 minutes maximum, un test de mesure de force musculaire sous anesthésie générale + analgésie de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Ci-dessous sont listés les étapes induisant des nuisances sur les souris lors des procédures. Douleur : chirurgie musculaire et implantation du biomatériau. Faim/soif : Mise à jeun de 4h, perte de mobilité après la chirurgie, difficulté à atteindre la nourriture et le biberon. Stress physique : Anesthésies médicamenteuse et gazeuse, plaies (présence de points de sutures sur la peau), réalisation des tests de fonctionnalité musculaire (test de performance de course sur tapis), diabète.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des muscles opérés (pour l'histologie) ne permet pas de garder les souris en vie.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre de caractériser la cicatrisation histologique et la récupération de la fonctionnalité musculaire.
Réduction
Dans un premier temps la réalisation du geste chirurgical sera validée sur un groupe restreint de souris. Ensuite le projet a été conçu de manière à ne pas répéter les groupes témoins. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques. En nous appuyant à chaque fois sur les résultats précédents, nous pourrons identifier les conditions optimales de manipulation, ce qui permettra de limiter le nombre de groupes et de variations expérimentales. Cela contribuera à réduire le nombre de souris utilisées tout en garantissant la pertinence des résultats.
Raffinement
Afin de gérer la douleur des souris, elles recevront une dose d’analgésique avant la chirurgie musculaire et l’implantation du biomatériau, puis une deuxième injection après l’acte chirurgical et une fois par jour pendant 2 jours. La chirurgie musculaire sera réalisée sous anesthésie générale et une anesthésie locale sera appliquée sur la plaie. Les souris seront suivies et pesées tous les jours après la chirurgie avec ajout de nourriture humide et d’hydrogel dans la cage.
Choix des espèces
Au cours de ce protocole, nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes à proportion égale âgées d’au moins 8 semaines, connues pour développer un diabète de type 2 à la suite d’un régime riche en glucides et en lipides. La cicatrisation musculaire chez la souris présente des similitudes notables avec celle chez l'humain ce qui fait de cette espèce un modèle pertinent pour ce projet.
Etudes d’Imagerie et de Spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire des muscles squelettiques et cardiaque dans les modèles canins de maladies neuromusculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les objectifs principaux de ce projet sont l'évaluation des méthodes non invasives pour caractériser structure et fonction des muscles dans des modèles pertinents de pathologies musculaires et établir des mesures fiables, voire des biomarqueurs qui décrivent le stade d'avancement de la maladie et son évolutivité. D'autre part, ces modalités seront utilisées pour evaluer un traitement innovant visant à rduire la fibrose musculaire
Bénéfices attendus
L’imagerie et la spectroscopie par résonnance magnétique représentent des techniques d’évaluation intrinsèquement non invasives et atraumatiques. L’utilisation d’un scanner à tunnel large et haute résolution permettent une évaluation corps entier ce qui permet donc d’avoir une bonne appréhension de la répartition des lésions musculaires. Le recours à diverses séquences permet d’obtenir divers contrastes ce qui traduit diverses propriétés des muscles. L'IRM devrait à terme aboutir à la définition de nouveaux biomarqueurs et d'établir des données de références permettant un diagnostic précoce par une méthode non invasive. Le développement de séquences entrelacées permet un raffinement supplémentaire de ces approches en raccourcsissant les durée d'examen. Le développement de nouveaux biomarqueurs devrait aider à l'évaluation de traitements innovants qui font encore défaut dans le contexte des maladies neuromusculaires.
Procédures
Une cohorte de chiens sera utilisée pour evaluer et valider de nouvelles méthodes d'imagerie médicale. Elle se décompose en chiens sains (M et F), de chiennes porteuses de la mutation et de chiens mâles atteints de la maladie. L’examen IRM (imagerie par résonnance magnétique), du fait de sa nature non invasive n’induit pas de douleur, mais une sédation est requise pour éviter les mouvements durant les acquisitions de données et améliorer le confort de l’animal. Les chiens seront donc endormis par médicament injectable, intubés et l'anesthésie entretenue par inhalation d’un anesthésique sous forme gazeuse. La durée de prépartion d'un chien est d'environ un quart d'heure. Un monitorage cardio-respiratoire continue ainsi que la surveillance de la température corporelle sont mis en place durant tout l'examen. Certaines séquences d'imagerie font appel à l'injection d'un produit de contraste. La durée d'un examen complet est limitée à 3 heures.
Impact sur les animaux
L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est certes non invasive et non douloureux, mais nécessite l’immobilité, d’où le besoin d’une anesthésie. L’induction de l’anesthésie par injection pourrait être source de stress et d’une douleur de courte durée au point de ponction de la voie intraveineuse. De même, la nécessité d’intuber pourrait causer une légère irritation. L’anesthésie nécessaire pour l’imagerie pourrait entrainer une hypothermie liée à l’immobilité et dans de rares cas de complications. Certaines séquences d’imagerie pourront nécessiter l’injection de produit de contraste pour l’IRM, ce qui ne devrait pas impacter l’animal (produit utilisé en pratique vétérinaire clinique).
Devenir
Tous les animaux retourneront à leur établissement d'origine qui gère la surveillance des chiens. La gestion des animaux en dehors de l'imagerie reste sous la responsabilité de l'équipe vétérinaire et n'implique pas le laboratoire de RMN. L'imagerie in vivo par une méthode non invasive comme l'IRM s'incrit dans ce contexte.
Remplacement
L’imagerie/spectroscopie par RMN répond au critère ‘remplacement’ de la règle des 3R en permettant de s’affranchir des prélèvements pour un grand nombre d’évaluations du tissu musculaire ; l’histologie tout comme la biochimie restent des méthodes invasives pouvant nécessiter l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles canins gardent ainsi une place irremplaçable aussi bien pour la recherche fondamentale que pour les études précliniques en thérapeutique. car ils présentent des similitudes phénotypiques avec les pathologies humaines (fibrose, cycles de dégénérescence / régénérescence des fibres musculaires, atteinte cardiaque et respiratoire, …).
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiparamétriques chez l’animal vivant, et représente une des caractéristiques singulières de la méthode RMN. Il est ainsi possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie, d’extraire plusieurs caractéristiques du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de répéter un examen sur un même animal sans effets nocifs pour celui-ci rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces trois spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de ‘réduire’ le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R. Les nouvelles modalités d’imagerie/spectroscopie par RMN nécessiteront une validation chez des animaux sains (mâles et femelles (20 + 20), des femelles porteuses de la mutation (40) et des animaux malades mâles (49), soit un total de 129 chiens. De ce sous-groupe de chiens ayant la maladie génétique, une cohorte (9) sera incluse dans un essai thérapeutique basée sur une approche de thérapie cellulaire. Le nombre total d’individu est estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques.
Raffinement
L’inclusion des animaux se fera selon des critères d’inclusion qui sont clairement établis en amont des examen RMN par l’équipe promotrice. En résumé, le statut génétique est établi et un examen clinique doit permettre d’établir un phénotype clairement décrit. Les animaux prévus ici devraient ainsi présentés un phénotype modéré. Toutefois en cas de dégradation de l’état clinique lié à la pathologie ou de survenue d’une pathologie intercurrente, les animaux seront exclus de notre protocole. En soi l’imagerie/spectroscopie par RMN est un examen non invasif et atraumatique. La RMN répond donc au critère de ‘Raffinement’, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques. Toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie par inhalation afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress lié à l’examen. L’anesthésie bénéficie d’un monitorage cardio-respiratoire continue jusqu’au réveil de l’animal. Certains examens peuvent nécessiter l’injection d’un produit de contraste. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant. Fréquence respiratoire et saturation périphérique en oxygène sont contrôlés en permanence pendant toute la durée de l’examen. La surveillance clinique est assurée jusqu’au réveil complet de l’animal et les animaux pourront retourner à leur lieu d’hébergement habituel. Les chiens restent donc sous la surveillance constante du vétérinaire qui aura toute liberté d’interrompre un examen s’il le juge nécessaire.
Choix des espèces
Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et de tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. La règlementation sur le développement médicamenteux prescrit le recours à une expérimentation in vivo pertinente pour la pathologie humaine ciblée. Les modèles canins des maladies neuromusculaires, tels que le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), sont très utilisés dans la recherche sur les pathologies neuromusculaires. En effet, le phénotype sévère lié à l’absence de dystrophine, observé chez ces animaux, présente des similitudes importantes avec l’expression de la maladie chez l’homme. Afin de diagnostiquer le plus tôt possible la pathologie neuromusculaire, les examens qui vont être évaluer ont recours à des chiens peu symptomatiques, d'un âge adultes jeunes.
Impact du réchauffement climatique sur le muscle squelettique sain, dystrophique ou en régénération
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Objectifs
Les vagues de chaleur liées au réchauffement climatique affectent de plus en plus notre santé et notre bien-être, notamment des personnes les plus vulnérables. Une vague de chaleur est une période où des températures anormalement élevées s’accumulent localement au cours d’une série de jours et de nuits inhabituellement chauds. La chaleur a un effet immédiat sur l’organisme, dès les premières augmentations de température. Lorsqu’il est exposé à la chaleur, le corps humain active des mécanismes de thermorégulation qui lui permettent de compenser l’augmentation de la température (transpiration, augmentation du débit sanguin au niveau de la peau par dilatation des vaisseaux cutanés, etc.). Il peut cependant arriver que ces mécanismes de thermorégulation soient débordés et provoquent un stress thermique conduisant à des maux de tête, des nausées, des crampes musculaires, de la déshydratation, et pour les formes les plus graves le décès. Des températures élevées entraînent d’autres effets sanitaires indirects, tels que l’aggravation des maladies chroniques sous-jacentes (maladies cardiovasculaires, diabète, asthme et troubles mentaux). Alors que le muscle squelettique joue un rôle majeur dans la thermorégulation par transfert de la chaleur vers la peau, l’impact des vagues de chaleur sur l’homéostasie et la régénération du muscle n’est pas connu.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les vagues de chaleur perturbent l’homéostasie du muscle sain ou dystrophique chez des sujets jeunes ou âgés et la régénération du muscle lésé ou ischémié.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de cinq : 1. Implantation d’une sonde de température en sous-cutané sur animal anesthésié (1 fois, durée : 5 min) 2. Modèle de régénération musculaire par injection de cardiotoxine sur animal anesthésié (1 fois, durée : 10 min) 3. Modèle d’ischémie des membres inférieurs sur animal anesthésié (1 fois, durée : 20 min) 4. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (Aurora) (1 fois, durée : 30min) et 5. Prélèvement de sang par la veine cave sur animal anesthésié (1 fois, durée : 2 min). Les procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de cinq : 1. Exposition à une vague de chaleur isolée ou répétée (1 fois 5 jours, ou 3 fois 5 jours) 2. Échographie cardiaque ou rénale sur animal anesthésié (durée : 20 minutes) 3. Vélocimétrie laser-doppler (évaluation perfusion sanguine) sur animal anesthésié (4 fois, durée : 15 min) 4. Test d’agrippement sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min) et 5. Récolte d'urine après miction spontanée sur animal vigile (1 fois, durée : 2 min)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (test d’agrippement). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à l’exposition aux fortes chaleurs et à la récupération post-chirurgie (modèle de régénération musculaire) ; pouvant conduire à une déshydratation, et une atteinte cardiaque et rénale avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints. Les effets indésirables seront la perte de poids (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une lésion musculaire (que ce soit par un agent chimique ou à la suite de la ligature de l’artère fémorale) passer les 24h premières heures post-lésionnelles, suggérant que la période critique sera principalement celle de l’exposition des animaux à la vague de chaleur.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l’impact direct des températures élevées sur la biologie de la cellules satellites, des expériences de culture cellulaire à température standard (37°C) ou forte température (40°C) seront menées indépendamment. Pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n'est pas envisageable. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un organisme ou d’un tissu entier. L'utilisation de modèles animaux reste essentielle afin d’étudier les effets délétères du réchauffement climatique sur le muscle squelettique. La souris est le modèle de choix en raison des similitudes des systèmes de réparation du muscle squelettique humain. Par ailleurs, les souris âgées ou dystrophiques peuvent fournir des notions importantes sur l’impact des vagues de chaleur sur le muscle squelettique dans les populations vulnérables, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échographies cardiaque et rénale, vélocimétrie laser-doppler, test d’agrippement) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés et au fait d’utilisation de la patte controlatérale comme contrôle sans lésion. De précédentes expériences ont démontré que : - des groupes de n=10 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité biologique de la réponse au stress thermique. - des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les évaluations fonctionnelles compte tenu de la variabilité inter-individuelle dans nos deux modèles chirurgicaux de régénération musculaire et de la mortalité potentielle des animaux exposés à la canicule.
Raffinement
Les animaux importés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies, la vélocimétrie laser-doppler et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 5 premières jours suivant la chirurgie et l’exposition aux fortes chaleurs afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Elle a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris présentant une délétion du gène de la dystrophine permettent de mimer la myopathie humaine de Duchenne. Des souris transgéniques permettant l’expression d'une protéine fluorescente verte dans les cellules satellites seront utilisées et faciliteront ainsi leur analyse spatiale en histologie et leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel myogénique en culture ou de leur expression génique différentielle. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de facilite l’exposition d’un plus grand nombre d’animaux dans la couveuse thermostatée. Nous maitrisons les modèles chirurgicaux de lésion musculaire pour lesquels nous n’avons aucune mortalité post-opératoire. Enfin, nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles du muscle squelettique et des cellules satellites in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Nous utiliserons également des souris âgées de 16 mois pour évaluer l’influence de l’âge un facteur de vulnérabilité majeure dans l’impact du réchauffement climatique sur la santé humaine.
Etude du métabolisme et de l’homéostasie du muscle squelettique : régulation par l’horloge biologique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Objectifs
Notre mode de vie actuel se caractérise par une sédentarité accrue alors que paradoxalement notre alimentation est de plus en plus riche en graisses et en sucres. Ce paradoxe favorise le développement de l’obésité et des maladies associées telle que le diabète. L’obésité, qui touchait déjà 13% de la population mondiale en 2016 selon l’OMS, ne fait qu’augmenter et représente aujourd'hui un défi majeur de santé publique. L’horloge biologique est présente dans toutes les cellules de l’organisme et permet aux individus de s’adapter aux changements environnementaux récurrents comme l’alternance jour/nuit. De nombreuses fonctions de l’organisme sont soumises à des variations entre période d’activité (le jour) et période de sommeil (la nuit). L’altération de ce cycle liée au mode de vie d’un individu entraine donc en retour des dysfonctionnements de son organisme. Par exemple, de multiples études mettent en évidence un risque significativement augmenté de développer une obésité, du diabète ou une maladie inflammatoire chez les personnes travaillant en horaires décalés. Le muscle, en plus d’être indispensable à la locomotion, est aussi un organe qui a la particularité d’avoir la capacité à se régénérer suite à des dommages causés par un exercice intensif ou une blessure. Il est également connu comme étant un acteur majeur de la gestion du glucose dans notre organisme. L’obésité et le diabète sont associées à des défauts de régénération de ce muscle. Ces pathologies entrainent une perte de masse musculaire conduisant à une augmentation des troubles métaboliques ainsi qu’à une perte de mobilité. Le maintien du processus de réparation musculaire chez ces patients est donc essentiel. Ce projet nous permettra de comprendre les processus de réparation musculaire au cours du développement de l’obésité et ses complications, et de préciser la contribution de l’horloge biologique dans ce contexte. A cette fin, les souris seront soumises à des régimes enrichis en graisse et/ou en sucre et subiront une variation dans les temps d’éclairage afin de mimer ce que vivent les individus travaillant en horaires décalés. Suite à cela, nous étudierons différents paramètres métaboliques et musculaires comme la capacité de régénération, d'exercice ainsi que les phénomènes d’atrophie musculaire.
Bénéfices attendus
Le muscle reste peu étudié alors qu’il est impliqué dans de plusieurs pathologies telles que les myopathies, la perte de masse musculaire liée à l'âge ou le diabète de type 2, dont plus de 350 millions de personnes sont atteintes à travers le monde. Notre projet va permettre d’identifier les mécanismes régulés par l’horloge biologique impliqués dans les processus de réparation musculaire lors de pathologies comme l’obésité et les maladies métaboliques. A plus long terme, ce projet permettra le développement de stratégies thérapeutiques visant à moduler l’horloge biologique afin de préserver la fonction musculaire lors de pathologies métaboliques.
Procédures
Un groupe de souris sauvages sera soumis à une restriction d’accès à l’alimentation de 12 semaines nécessitant 1 prélèvement sanguin (durée
Impact sur les animaux
Certaines procédures peuvent engendrer du stress : douleurs liées à la biopsie à l’oreille pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague (courte durée et léger), injections intramusculaire d’un composé chimique (modérée) ; Stress métabolique suite à une alimentation enrichie en graisses et en sucres (léger) ; stress lié à une mise à jeûn des animaux pendant 4 à 12h (léger); stress lié à une altération environnementale de l'horloge réalisée par des avances ou retards de phase dans l'éclairage de la cage ou de la pièce d'hébergement pour mimer un décalage horaire (léger) ; stress lié à un exercice physique des souris sur un tapis roulant ou dans un système de roues (léger).
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés afin de récuperer des tissus en vue de réaliser des analyses histologiques et moléculaires supplémentaires, lesquelles nous fourniront des informations cruciales sur le role de l'horloge biologique sur la fonction et l'homéostasie du muscle squelettique au cours des pathologies métaboliques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de l'horloge biologique sur la physiopathologie du muscle squelettique dans un contexte de désordres métaboliques qui mettent en jeu une communication inter-organes. Pour répondre à cette problématique, il sera utilisé des modèles de souris génétiquement modifiés pour des gènes clefs de l'horloge, mais également des procédures d'altération environnementale de l’horloge via des modifications des rythmes d'alimentations et des cycles lumière/obscurité. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible. Ainsi pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux, nous utiliserons différents modèles cellulaires tels que les C2C12 (myoblastes murins) ainsi que lignées de macrophages afin d'étudier les interactions intercellulaires se produisant lors de la régénération musculaire.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 14128. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d'animaux utilisés peut être obtenue par trois moyens principaux : 1. Optimisation des élevages : Éviter la production d'animaux inutiles. 2. Optimisation des groupes expérimentaux : Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe sera réalisée pour respecter le principe des 3R à l’aide du site : https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group. 3. Formation adéquate : Assurer une bonne formation des personnes manipulant les animaux pour maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-animale et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique.
Raffinement
La stabulation se fait dans un environnement non anxiogène regroupant des conditions favorables à leur bien-être qui incluent une température régulée à 22°C +/- 2°C, 2 à 6 souris par cage, une alternance lumière/obscurité de 12h/12h (sauf procédure spécifique), de la nourriture et de l'eau ad libitum (sauf procédure spécifique comprenant le régime alimentaire), ainsi qu'un enrichissement de la cage avec des abris et des matériaux pour la confection de nids. Les animaux sont vérifiés quotidiennement et un registre de bien-être animal est tenu afin d'effectuer un suivi des conditions d'hébergement. Lors de la mise sous régime des souris, la fréquence de change de la litière et de la cage est de deux fois par semaine. L’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress des animaux durant l’expérimentation. La définition précise des points limites précoces associés à chaque procédure, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permettront de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de l’animal. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris offre de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et, selon la souche, peuvent développer des pathologies telles que l'obésité, l'insulino-résistance et la stéatose hépatique, avec des caractéristiques similaires à celles observées chez l'homme. De plus, cette espèce permet de réaliser des manipulations spécifiques, comme des gains ou pertes de fonction des gènes de l'horloge dans différents types cellulaires intervenant dans la régénération musculaire, afin de mieux comprendre leur action. Il existe également des données de la littérature identifiant les gènes régulés par l'horloge dans les muscles squelettiques chez la souris. Cela nous permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés en comparant nos données avec ces dernières. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 2 mois à 12 mois. Etant donné que l'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il est nécessaire d'utiliser des souris adultes (càd 2 mois minimum et en dehors de la courbe de croissance). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes (de 2 à 12 mois) et ce, en accord avec les 3R.