Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Neuroprotection d’une modulation du métabolisme énergétique cérébral dans le contexte de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des pompes implantées sous la peau, remplacées chaque semaine pendant un mois pour une partie des animaux, délivrent en continu du lactate ou une hormone à 144 souris, dont des transgéniques porteuses d'un modèle d'Alzheimer. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, après trois IRM sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes et une perfusion finale d'une heure sans réveil. Le projet cherche à savoir si un apport énergétique alternatif ralentit le déclin cérébral du vieillissement et de la maladie d'Alzheimer, le cerveau étant prélevé pour l'analyse moléculaire. Le porteur annonce des tests comportementaux évaluant la cognition, la motricité, l'anxiété et les signes de dépression, dont un test de restriction alimentaire, sans préciser lesquels.
Objectifs
Le cerveau est l’organe le plus gourmand en énergie de notre corps. Avec l’âge, et plus encore dans la maladie d’Alzheimer, son métabolisme énergétique ralentit. On sait aujourd’hui que les personnes atteintes de cette maladie utilisent moins efficacement le glucose – la principale source d’énergie du cerveau – que les personnes en bonne santé. Les recherches montrent que ce problème survient très tôt, bien avant l’apparition des pertes de mémoire ou des troubles cognitifs. Ce déficit énergétique touche plusieurs types de cellules cérébrales et perturbe leurs échanges. Un mécanisme central est particulièrement affecté : la « navette lactate » entre les astrocytes et les neurones, qui permet normalement aux cellules de se transmettre et d’exploiter efficacement l’énergie. Avec le vieillissement et dans la maladie d’Alzheimer, certains transporteurs et enzymes indispensables à l’utilisation du glucose et du lactate deviennent moins performants. Résultat : le cerveau n’arrive plus à produire suffisamment d’énergie pour fonctionner correctement. Notre projet vise à stimuler cette navette lactate en administrant soit une substance énergétique alternative, soit une substance hormonale, afin de compenser ce manque d’énergie. L’objectif est de ralentir ou de retarder l’apparition des troubles liés au vieillissement et, plus encore, à la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le vieillissement et de manière plus exacerbée, la maladie d'Alzheimer sont caractérisés par un déficit énergétique cérébral induit par une diminution de la capacité cérébrale à métaboliser le glucose. Nous proposons dans ce projet une stratégie de substitution énergétique en administrant soit une substance énergétique alternative, soit une substance hormonale. Les bénéfices attendus sont un maintien de l'équilibre énergétique cérébral couplé à un maintien des fonctions cérébrales ou un retard dans leurs altérations.
Procédures
Une intervention chirurgicale est prévue afin d’implanter des pompes permettant l’administration continue de substances. À l’âge de 5 mois, deux modalités d’implantation sont prévues : - Implantation unique : la pompe est posée une seule fois et délivre le traitement pendant un mois. - Implantations répétées : la pompe est posée pour une semaine, puis remplacée chaque semaine, afin de maintenir le traitement sur une durée totale d’un mois. La durée de chaque intervention chirurgicale d’implantation n’excède pas 12 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour les examens IRM. Trois examens sont prévus, chacun durant environ 30 à 45 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les fonctions cognitivo-sensori-motrices, l’anxiété et les signes de dépression. Chaque test sera effectué une seule fois et dure environ 10 minutes. Enfin, à la fin de l’étude, les animaux recevront une perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour mesurer les échanges métaboliques dans le cerveau. Cette procédure est réalisée sous anesthésie pendant une heure, sans réveil.
Impact sur les animaux
- Une chirurgie d’implantation des pompes osmotiques est réalisée, sous anesthésie et antalgie. - L’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive, cependant, sous anesthésie : hypothermie et risque de troubles cardio-respiratoires. Cette nuisance entrainera l'arrêt de l'expérimentation. - Les tests de comportement, notamment le test de restriction alimentaire, pourraient induire une anxiété chez les animaux. - Notre étude s’est terminée avant l’apparition de phénotype dommageable (vers 19 mois) qui pourrait entraîner des problèmes de mémoire et d’apprentissage, des modifications cérébrales liées à la maladie, des changements dans le comportement et l’état général de l'animal, et dans de rares cas, un décès soudain.
Devenir
Le cerveau des animaux doit être prélevé pour décrypter les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à voir si le lactate peut aider à protéger le cerveau dans la maladie d’Alzheimer. Pour le savoir, il est indispensable d’étudier le cerveau dans son fonctionnement global. Aujourd’hui, il n’existe pas d’autre méthode que les modèles expérimentaux pour répondre à cette question et espérer des applications chez l’être humain.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l’IRM est une technique d’investigation non-invasive et permet donc un suivi longitudinal des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les effectifs ont été déterminés par des tests statistiques ainsi que par notre expérience acquise lors d’études précédentes. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Les nuisances potentielles sur le bien-être des animaux seront surveillées et limitées au maximum, en particulier lors des périodes pouvant entraîner un stress ou une gêne (anesthésies liées aux examens d’IRM notamment). Les animaux feront l’objet d’un suivi attentif visant à détecter rapidement toute altération de leur état général. Un système de points limites, d’arbre décisionnel de critères d’arrêt sera appliqué afin d’intervenir rapidement si la santé ou le confort des animaux se dégrade. Les conditions d’hébergement et de manipulation seront adaptées de manière à assurer leur confort et une récupération optimale tout au long du protocole.
Choix des espèces
Les souris (modèle de vieillissement sain) et les souris transgeniques (modèle d'Alzheimer) sont deux souches très étudiées dans la littérature, leur utilisation permttra de minimiser le nombre d'animaux contrôles. Les souris partagent de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec les humains, ce qui permet d'observer des mécanismes pathologiques similaires à ceux de la maladie d'Alzheimer chez l'homme. Les modèles de souris transgéniques peuvent être génétiquement modifiés pour développer des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet d'explorer des hypothèses sur la neuroprotection. Il est possible de suivre des souris sur des périodes prolongées pour observer l'évolution de la maladie et l'impact de l'intervention neuroprotectrice. Les modèles murins permettent d'évaluer les fonctions cognitives et comportementales, fournissant des données sur l'efficacité du traitement neuroprotecteur. Le projet porte sur la neuroprotection dans le cadre du vieillissement cérébral sain ou pathologique (maladie d'Alzheimer). Les animaux seront suivis de l’âge de 5 mois jusqu’à 18 mois. Des IRM seront effectuées à 6, 14 et 16 mois, et des tests comportementaux seront réalisés entre 10 et 18 mois.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès quatorze jours de vie, une moitié reçoit des électrodes implantées dans le crâne au cours d'une opération de quatre-vingts minutes, d'autres une mini-pompe sous la peau renouvelée chaque mois, et tous subissent trois ponctions lombaires, des injections et des tests moteurs, de réflexes et de mémoire. Un test dit de dépression leur impose quatre jours de restriction alimentaire. Le projet teste des esters de cétones et du lactate comme sources d'énergie de remplacement, chez des rats porteurs d'une mutation qui prive leur cerveau de glucose. Le porteur explique avoir écarté la souris parce qu'elle ne fait pas de crises d'épilepsie, et parce que l'IRM donne une meilleure image sur un animal plus gros.
Objectifs
Le glucose est la principale source d’énergie du cerveau. Pour qu’il puisse atteindre les cellules cérébrales, il doit traverser certaines barrières naturelles grâce à des protéines spécialisées, notamment une appelée transporteur de glucose de type 1. Lorsque ce transporteur ne fonctionne pas correctement, le cerveau ne reçoit pas assez d’énergie. Cela provoque une maladie rare appelée syndrome de déficit en transport de glucose de type 1. Cette maladie débute généralement dans l’enfance et entraîne des crises d’épilepsie difficiles à traiter avec les médicaments classiques, un développement cérébral ralenti, de possibles malformations du crâne, et des troubles du mouvement comme des raideurs, des troubles de l’équilibre ou des mouvements involontaires. Actuellement, le traitement repose sur un régime alimentaire très particulier, appelé régime cétogène, qui fournit une autre source d’énergie au cerveau : les corps cétoniques. Mais ce régime ne fonctionne pas pour tous les patients, et il ne corrige pas les effets du manque d’énergie pendant les premières étapes du développement cérébral. Ce projet de recherche a pour objectif de tester de nouvelles sources d’énergie plus efficaces et plus faciles à administrer. Il s’agit notamment : d’esters de cétones, ajoutés dans l’eau de boisson, qui permettent d’atteindre rapidement un état favorable au fonctionnement du cerveau, et du lactate, administré de façon continue par une petite pompe implantée sous la peau. Ces traitements seront testés sur des rats porteurs d’une mutation qui réduit fortement l’expression du transporteur de glucose, afin de mieux comprendre leur efficacité et leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de démontrer un effet protecteur sur le cerveau grâce à l’administration d’esters de cétones ou de lactate, en alternative au régime cétogène. Ce régime, bien que thérapeutique, est très contraignant et souvent mal toléré par les patients. Si ces nouvelles approches s’avèrent efficaces, elles pourraient représenter une solution plus simple et mieux acceptée. Cela ouvrirait la voie à l’élaboration de protocoles d’administration adaptés, avec pour objectif une amélioration significative de la qualité de vie des patients atteints du déficit en transport de glucose.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement électroencéphalogramme, sous anesthésie gazeuse: procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 80 min - implantation des mini-pompes permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse :procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 60 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes -ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours)
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue, réalisée pour le génotypage, provoque une douleur légère et de courte durée. L’implantation des mini-pompes ou des électrodes pour l’électroencéphalogramme, qui permet d’enregistrer l’activité électrique du cerveau, peut entraîner une douleur modérée. Les anesthésies nécessaires à ces enregistrements peuvent provoquer une variation du rythme cardiaque et, si elles sont prolongées, un risque de déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire du stress ou de l’anxiété. Enfin, lors du test évaluant des comportements de type dépressif, une restriction alimentaire est appliquée, pouvant entraîner une perte de poids et être une source d’inconfort pour l’animal (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Le recours à l’IRM, une technique d’imagerie non invasive, permet d’étudier les animaux sans avoir à les sacrifier, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Grâce à cette méthode, nous pouvons suivre l’évolution des mêmes animaux au fil du temps, tout en réalisant aussi des tests comportementaux sur eux. Le nombre d’animaux a été calculé à l’avance pour qu’il soit le plus faible possible, tout en assurant que les résultats soient fiables. Pour analyser les différences entre les groupes, nous utiliserons des méthodes statistiques reconnues.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement EEG, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'IRM est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 60 jours. Les dispositifs d'EEG (la moitié des aniamux) seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 60 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Neuroprotection des motoneurones de la moelle épinière dans des modèles SLA : mécanismes et biomarqueurs thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Constituer le dossier d'une demande d'essai clinique de phase I/II, voilà à quoi vont servir 1 732 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent trois lignées transgéniques de sclérose latérale amyotrophique, dont l'une où la souffrance s'installe à l'âge adulte et s'aggrave pendant trois à quatre mois. Chacune reçoit une injection dans le canal rachidien sous anesthésie, puis passe dix à quinze fois quatre tests moteurs, préhension, endurance musculaire, extension des membres et coordination. Le porteur indique que les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo, et renvoie au conditionnel le bénéfice pour des patients dont l'espérance de vie reste inférieure à cinq ans après le diagnostic.
Objectifs
Les motoneurones (MNs) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Nous avons identifié une protéine exprimée et sécrétée par les interneurones qui est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale de cette protéine synthétisée au laboratoire permet de bloquer la neurodégénérescence pendant 3 mois, et son injection répétée permet de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. En utilisant trois lignées transgéniques murines validées de la SLA présentant des impacts progressifs sur la survie des motoneurones nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine recombinante à court, moyen ou plus long terme, en analysant en parallèle le comportement ainsi que les données physiologiques et histologiques des animaux transgéniques et des groupes contrôles appropriés, soit un total de 1732 souris.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. Cette maladie est progressive et fatale. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. Une protéine recombinante humaine promeut la survie des MN. Ce projet évaluera l'activité de cette protéine dans plusieurs modèles animaux de la SLA. Il permettra notamment d'étudier les biomarqueurs putatifs et d'évaluer l'activité de la protéine par l'analyse d'échantillons de plasma. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission d’une demande d’essai clinique de Phase I/II.
Procédures
Une injection intrathécale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 15 minutes et sera effectuée une seule fois. Des évaluations de la capacité motrice par 4 tests moteurs seront réalisées 10-15 fois sur animaux vigiles. Les animaux seront soumis à un test de préhension qui durent 2 minutes, un test d’endurance musculaire qui durent 3 minutes, un test d’extension des membres qui durent
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voûtée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les modèles de souris SLA utilisés dans ces expériences perdent progressivement leur capacité motrice à des moments bien définis et prévisibles. Pour le premier modèle, les phénotypes durent plusieurs mois, sont modérés et se déclenchent uniquement après induction. Pour le deuxième modèle, la souffrance est légère et s’installe dans la durée à l’âge adulte. Pour le troisième modèle, la souffrance se déclenche à l’âge adulte et devient de plus en plus sévère pendant 3 à 4 mois.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau, moelle épinière et muscles seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques.
Remplacement
L’identification des biomarqueurs affectés par la PER pour utilisation dans des essais cliniques nécessite des modèles animaux de la SLA. Les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo de la SLA pour la validation de PER en tant que cible thérapeutique.
Réduction
Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à une injection intrathécale suivie de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses et/ou prélèvements sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.
Raffinement
Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie. Les animaux à mobilité réduite auront de la nourriture et de l’eau au sol pour leur faciliter l’accès.
Choix des espèces
La souris est majoritairement utilisée dans le domaine des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. La SLA est une maladie neurodégénérative mortelle qui affecte de nombreux systèmes chez l'homme. Il a été démontré que les modèles murins récapitulent un certain nombre de ces caractéristiques. Les souris présentent une atteinte multi-systémique, notamment du cerveau, de la moelle épinière, des jonctions neuromusculaires et des muscles, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation d'agents thérapeutiques potentiels pour la SLA. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de PER dans des modèles murins adulte de la maladie SLA étant donné que cette maladie neurodégénérative se déclare normalement chez l’adulte. La maladie sera déclenchée à 2 mois d’âge dans le modèle choisi. Nous prévoyons donc d’injecter la PER après ce stade afin d’évaluer sa capacité à bloquer le phénomène de dégénérescence progressive des motoneurones.
Rôle du microbiote intestinal dans la neuroprotection d’une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l’hypoxie-ischémie néonatale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavés une fois par jour de leur naissance au septième jour, les ratons subissent ensuite une ligature de l'artère carotide gauche suivie de deux heures d'hypoxie, qui provoque une lésion cérébrale. Séparés de leur mère à plusieurs reprises, ils passent deux examens d'IRM sous anesthésie, l'un de 30 à 45 minutes, l'autre de deux heures, puis des tests de réflexes précoces, de mémoire et d'anxiété à six âges différents. 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer si des polyphénols donnés à la mère protègent le cerveau du nouveau-né par l'intermédiaire du microbiote intestinal. Tous sont tués pour prélèvement d'organes, le porteur précisant que les lésions cérébrales induites interdisent de les utiliser dans un autre projet.
Objectifs
L'hypoxie-ischémie néonatale est une condition qui se produit lorsque le cerveau d'un nouveau-né ne reçoit pas suffisamment de sang, ce qui réduit les apports en oxygène et en nutriments essentiels. Cette situation est préoccupante, car elle est responsable de 20 % des décès chez les nouveau-nés et d'un quart des cas de problèmes moteurs et cognitifs. Actuellement, la seule option de traitement disponible est l'hypothermie, mais près de la moitié des nouveau-nés ne réagissent pas bien à cette thérapie. Cela souligne l'urgence de trouver de nouvelles stratégies pour protéger le cerveau des bébés. Nos récentes téudes ont montré, chez le rat, que donner des polyphénols, des substances bénéfiques que l'on trouve dans certains aliments, aux mères pendant la grossesse et l'allaitement pouvait avoir un effet protecteur sur leurs petits après un épisode d'hypoxie-ischémie néonatale. Les ratons dont les mères avaient reçu des polyphénols avaient moins de lésions cérébrales et de meilleures capacités motrices et sensorielles que ceux dont les mères n'avaient pas été supplémentées. Les polyphénols semblent influencer la composition des bactéries présentes dans l'intestin, et il y a un intérêt croissant pour le lien entre ces bactéries et le cerveau. Pour mieux comprendre comment la protection d'une supplémentation maternelle avec des polyphénols fonctionne, ce projet vise à étudierl'impact de ces bactéries intestinales. L'objectif de cette recherche est donc de déterminer comment la supplémentation en polyphénols chez les mères peut aider à protéger le cerveau des nouveau-nés contre les effets de l'hypoxie-ischémie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - Avancées scientifiques : Le projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes de neuroprotection associés à la modulation du microbiote intestinal par les polyphénols. Les résultats pourraient éclairer les interactions entre l'alimentation maternelle, le microbiote et le développement neurologique des nouveau-nés. - Innovation thérapeutique : L’étude explore une approche novatrice de neuroprotection basée sur la supplémentation en polyphénols et la transplantation fécale, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou atténuer les effets de l'hypoxie-ischémie chez les nouveau-nés. - Amélioration des soins néonataux : Les résultats de l'étude pourraient potentiellement mener à des recommandations cliniques pour la supplémentation en polyphénols chez les femmes enceintes, en particulier celles à risque de complications néonatales, contribuant ainsi à améliorer les soins néonataux.
Procédures
Gavages en vigile : durant 7 jours, 1 fois par jour, durée : 2 minutes Procédure chirurgicale sous anesthésie : une fois d'une durée inférieure à 10 minutes Examens d'imagerie résonance magnétique (IRM) sous anesthésie : 1 fois durée : 30 - 45 min et 1 fois 2 h Tests de comportement en vigile : réflexes précoces (durée : 5 min), mémoire (durée 10 min), anxiété (1 fois ; durée : : 10 min).
Impact sur les animaux
Les diverses séparation des ratons et de leur mère, induites pas la procédure expérimentale pourraient être source de stress pour la mère et les petits. Le gavage, réalisé de P0 à P7 pourrait entraîner un stress pour les ratons. Les transplants fécaux pourraient provoquer une gêne digestive (quelques heures) ou un inconfort physique (quelques minutes). Les anesthésies (examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération (HI), la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser, ce risque est faible. La ligature de l'artère carotide commune gauche, couplée à l'hypoxie de 2 h, entraînera la formation d'une lésion cérébrale. Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem. L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de déterminer le rôle du microbiote dans la neuroprotection contre l'HI induite par une supplémentation maternelle polyphénolique et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés (7 jours) à leur arrivée et seront élevés en cage collective. Les chirurgies (HI) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardio-respiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. De même nos précédents travaux nous permettent d'avoir déjà des données sur des groupes non-gavés, ce qui réduit le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement : par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h après l'hypoxie ischémie), à 30 jours de vie afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme et à 50 jours de vie, par IRM fonctionnelle, pour évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle. En parallèle, des tests comportementaux seront réalisés à 8, 10, 12, 24, 28 et 45 jours de vie afin d'évaluer les effets du microbiote dans la récupération fonctionnelle, dans un contexte d'hypoxie-ischémie néonatale.
Evaluation de la neuroprotection après illumination extra-crânienne chez le primate non-humain Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Des injections répétées de streptozotocine provoquent chez treize macaques à longue queue des symptômes de maladie d'Alzheimer, après une ou deux chirurgies d'implantation sous anesthésie générale. Ces treize primates vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, pour que soient analysés biochimiquement et anatomiquement les effets d'une illumination du crâne par casque infrarouge. Le porteur liste parmi les nuisances attendues douleurs postopératoires, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection et hallucination temporaire, puis écrit n'attendre "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Il annonce neuf prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien ainsi que "des tests comportementaux", sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 13 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - une voir 2 procédures chirurgicales et des injections sous anesthésie générale- de la photobiomodulation extracranienne - 9 prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien - des tests comportementaux
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par l’animal sont liées : -à la chirurgie d’implantation et aux suites post opératoire avec des risques de douleurs post opératoire, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection. Une attention particulière sera apportée dans les premiers jours suivant l’intervention chirurgicale et sera maintenu durant quelques semaines. - aux injections répétées de streptozotocine avec des risques d’infection, œdème, inflammation, hallucination temporaire. Ces injections sont réalisées sous anesthésie générale et leur effet sur le comportement de l’animal sera suivi dans les heures et jours suivants. Afin de réduire le stress lié aux différents actes pratiqués, il y aura une phase de conditionnement positifs sur les actes post-opératoires afin d’assurer leur coopération sur notamment le retrait des points ou les soins de la plaie en vigile. En cas de détection de signe de douleur, de perte de poids ou de signes d’infection, une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres de la SBEA sera mise en œuvre de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.
Remplacement
Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.
Raffinement
Afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien- être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.
Choix des espèces
Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain pour la pathologie étudiée. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.
Complément à l’évaluation des mécanismes de neuroprotection de la barrière sang-cerveau dans un modèle de pathologie périnatale avec inflammation chez le rat en développement (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des rates gestantes et leurs ratons nouveau-nés composent les 244 rats de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et tous mis à mort. Dix femelles sont mises à la reproduction pour une nuit, contrôlées par frottis vaginal sans anesthésie, puis soumises pendant les vingt-deux jours de gestation à un régime pauvre en protéines qui peut les rendre inactives et leur faire perdre du poids. Leurs petits reçoivent après la naissance une injection intrapéritonéale de lipopeptide sous anesthésie gazeuse et passent deux heures en atmosphère appauvrie en oxygène, ce qui divise par deux leur prise de poids dans les vingt-quatre heures suivantes, et dix-huit d'entre eux subissent en plus une IRM dans un second établissement. Les ratons sont tués à différents âges pour prélèvement des tissus, les mères après le sevrage.
Objectifs
Le cerveau est un organe privilégié au sein de l’organisme, notamment du fait de l’existence de barrières sang-cerveau qui protègent l cerveau et contribuent aux besoins de celui-ci. Ces barrières sont de deux types : la barrière hématoencéphalique (entre le sang et le tissu cérébral) et la barrière sang-liquide céphalorachidien (entre le sang et le liquide qui entoure le cerveau). Au cours de la période périnatale, le cerveau par l’intermédiaire de ces barrières sang-cerveau peut être soumis à des traumatismes multiples : inflammation, hypoxie (manque d’oxygène) ou autres facteurs de risque tel que le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Ces traumatismes, surtout lorsqu’ils sont associés, peuvent être responsables de déficiences sévères à long terme. En France, on estime que la moitié des déficiences sévères constatées chez l’enfant de 7 à 8 ans est d’origine périnatale. L’objectif de notre projet qui sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs EU1 et EU2 , est d’évaluer les lésions induites par l’inflammation sur le cerveau en développement à l’aide de différents modèles. Nous souhaitons comprendre le lien entre les lésions cérébrales et l’altération des barrières sang-cerveau. Notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi surviennent des lésions cérébrales sévères en période périnatale. Nous avons également pour objectif de mieux prendre en charge ces lésions sévères en testant l’efficacité d’une molécule neuroprotectrice pour prévenir ou diminuer ces déficiences.
Bénéfices attendus
Nous estimons que ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodévelopement. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables que dans le cadre d’un stress inflammatoire seul. Par exemple des différences de signal pourraient être visualisés en micro-IRM chez les animaux ayant subis une inflammation et une hypoxie. Par ailleurs nos premiers résultats montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions multiples à court terme. Les consequences à long terme doivent donc être caractérisées. Enfin ce projet ouvrira une perspective therapeutique interesante qui sera etayées par des données mécanistiques.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagnée ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse, et à un environement hypoxique modèré pendant 2 heures. Les analyses sont ensuite effectuées entre 1 et 28 jours (216 animaux) . Certains animaux sont soumis à une IRM au plus tard 21 jours après la naissance, qui s'effectue également sous anesthése gazeuse (18 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l' établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Les ratrons soumis à l'hypoxie à l'exposition au lipopetide se nourissent moins pendant les premières 24h (augmentation de poid réduite d'environ 50 % par rapport aux controles), difference qui disparait ensuite.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à differents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) protectrices existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des differentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance fetal. Par ailleurs, le role reconnu de la circulation du liquide cérébrospinal dans les processus neuroinflammatoire , en particulier comme vecteur de cellules immune et de cytokines, ne peut être reproduit in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
- Les rates gestantes ne bénéficiant pas d’un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle). - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin d’assurer la fiabilité statistique des données générées. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée. Enfin les données obtenues dans le cadre d’une étude précédente seront incorporées, ce qui limite fortement le nombre d'animaux inclus dans cette présente demande.
Raffinement
- Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - La methode du régime pauvre en protéine est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). Le poids des rates gestantes bénéficiant d’un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction - Les ratons issus du modèle RCIU seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral régulier. - Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport qui présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront transportés avec leurs mères dans des conditions de température controlée. La proximité des deux lieux géographiques (500 mètres) permet de minimiser le temps de transport. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans les études précédentes. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les dnnées déjà acquisent l'ont été avec ce modèle. LLes prélèvements et mesure de perméabilité seront effectué chez le raton après la naissance, puis chez l’animal agé de 30 jours. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU et de l'hypoxie associés ou non à l'inflammation sur l'integrité des interfaces sang-cerveau au cours du déveopement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermée (Impact sur la programmation foetale, P30).
Complément à l’évaluation des mécanismes de neuroprotection de la barrière sang-cerveau dans un modèle de pathologie périnatale avec inflammation chez le rat en développement (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les ratons utilisés naissent avec un retard de croissance provoqué, leurs mères ayant été nourries pendant les 22 jours de gestation avec un régime pauvre en protéines. 244 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 216 ratons analysés entre le premier et le vingt-huitième jour de vie. Après la naissance, ils reçoivent sous anesthésie gazeuse une injection intrapéritonéale de lipopeptide puis passent deux heures en atmosphère appauvrie en oxygène, ce qui réduit de moitié leur prise de poids sur les 24 premières heures. Les ratons sont tués à différents âges pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, celles qui ont échappé au régime carencé pouvant servir jusqu'à cinq reproductions.
Objectifs
Le cerveau est un organe privilégié au sein de l’organisme, notamment du fait de l’existence de barrières sang-cerveau qui protègent l cerveau et contribuent aux besoins de celui-ci. Ces barrières sont de deux types : la barrière hématoencéphalique (entre le sang et le tissu cérébral) et la barrière sang-liquide céphalorachidien (entre le sang et le liquide qui entoure le cerveau). Au cours de la période périnatale, le cerveau par l’intermédiaire de ces barrières sang-cerveau peut être soumis à des traumatismes multiples : inflammation, hypoxie (manque d’oxygène) ou autres facteurs de risque tel que le retard de croissance intra-utérin (RCIU). Ces traumatismes, surtout lorsqu’ils sont associés, peuvent être responsables de déficiences sévères à long terme. En France, on estime que la moitié des déficiences sévères constatées chez l’enfant de 7 à 8 ans est d’origine périnatale. L’objectif de notre projet qui sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs EU1 et EU2 , est d’évaluer les lésions induites par l’inflammation sur le cerveau en développement à l’aide de différents modèles. Nous souhaitons comprendre le lien entre les lésions cérébrales et l’altération des barrières sang-cerveau. Notre projet permettra de mieux comprendre comment et pourquoi surviennent des lésions cérébrales sévères en période périnatale. Nous avons également pour objectif de mieux prendre en charge ces lésions sévères en testant l’efficacité d’une molécule neuroprotectrice pour prévenir ou diminuer ces déficiences.
Bénéfices attendus
Nous estimons que ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodévelopement. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables que dans le cadre d’un stress inflammatoire seul. Par exemple des différences de signal pourraient être visualisés en micro-IRM chez les animaux ayant subis une inflammation et une hypoxie. Par ailleurs nos premiers résultats montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions multiples à court terme. Les consequences à long terme doivent donc être caractérisées. Enfin ce projet ouvrira une perspective therapeutique interesante qui sera etayées par des données mécanistiques.
Procédures
Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagnée ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse, et à un environement hypoxique modèré pendant 2 heures. Les analyses sont ensuite effectuées entre 1 et 28 jours (216 animaux) . Certains animaux sont soumis à une IRM au plus tard 21 jours après la naissance, qui s'effectue également sous anesthése gazeuse (18 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l' établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Les ratrons soumis à l'hypoxie à l'exposition au lipopetide se nourissent moins pendant les premières 24h (augmentation de poid réduite d'environ 50 % par rapport aux controles), difference qui disparait ensuite.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à differents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) protectrices existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des differentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance fetal. Par ailleurs, le role reconnu de la circulation du liquide cérébrospinal dans les processus neuroinflammatoire , en particulier comme vecteur de cellules immune et de cytokines, ne peut être reproduit in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
- Les rates gestantes ne bénéficiant pas d’un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle). - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin d’assurer la fiabilité statistique des données générées. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée. Enfin les données obtenues dans le cadre d’une étude précédente seront incorporées, ce qui limite fortement le nombre d'animaux inclus dans cette présente demande.
Raffinement
- Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - La methode du régime pauvre en protéine est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). Le poids des rates gestantes bénéficiant d’un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction - Les ratons issus du modèle RCIU seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral régulier. - Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport qui présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront transportés avec leurs mères dans des conditions de température controlée. La proximité des deux lieux géographiques (500 mètres) permet de minimiser le temps de transport. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans les études précédentes. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les dnnées déjà acquisent l'ont été avec ce modèle. LLes prélèvements et mesure de perméabilité seront effectué chez le raton après la naissance, puis chez l’animal agé de 30 jours. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU et de l'hypoxie associés ou non à l'inflammation sur l'integrité des interfaces sang-cerveau au cours du déveopement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermée (Impact sur la programmation foetale, P30).
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.
Objectifs
La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Neuroprotection d’une modulation du métabolisme énergétique cérébral dans le contexte de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une pompe implantée sous la peau, puis rechargée quatorze fois : 96 souris vont être utilisées, toutes tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent du lactate en continu, passent deux séances d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie gazeuse, subissent une perfusion d'une heure de substrats marqués au carbone 13, et passent des tests d'anxiété et de dépression ainsi qu'un test de restriction alimentaire dont le porteur admet qu'il peut induire une anxiété. L'objectif déclaré est de compenser le déficit énergétique du cerveau vieillissant ou atteint de la maladie d'Alzheimer. Les deux souches transgéniques retenues sont suivies de 4 à 18 mois, choisies parce qu'elles sont déjà "très étudiées dans la littérature", ce qui permet selon le porteur de limiter le nombre d'animaux témoins.
Objectifs
Le cerveau est l'organe le plus énergivore du corps. Le vieillissement et de manière exacerbée, la maladie d'Alzheimer se caractérisent par une diminution du métabolisme énergétique cérébral. Une moindre utilisation cérébrale du glucose a été démontrée chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux sujets sains. De plus en plus de preuves indiquent qu'un métabolisme anormal du glucose dans le cerveau est un événement précoce détectable bien avant les défaillances cognitives caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Ce déficit énergétique implique de multiples cellules cérébrales : neurones, astrocytes et microglie et impacte leurs interactions, en particulier la navette lactate astrocyte-neurone (Astrocyte-neuron lactate shuttle). Une diminution du transporteur de glucose endothélial et astrocytaire a été rapportée ainsi qu'une diminution de l'expression des enzymes permettant la conversion entre lactate et pyruvate. Ce dysfonctionnement de l'ANLS a été montré, au moins en partie, responsable du déficit énergétique propre à la maladie d'Alzheimer. De plus, il a été mis en évidence que le vieillissement réduit l'expression du transporteur neuronal spécifique du glucose, diminuant l'entrée du glucose dans les neurones. La diminution des acteurs clefs de l'ANLS, carrefour métabolique du cerveau, semble être une caractéristique précoce et majeure de la maladie d'Alzheimer ; le glucose, substrat cérébral principal, ne pouvant plus être métabolisé. L'objectif de ce projet est de stimuler l’ANLS, par administration de lactate dans le but de contrecarrer le déficit énergétique cérébral et limiter ou retarder ainsi les déficits fonctionnels associés au vieillissement et a fortiori à la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le vieillissement et de manière plus exacerbée, la maladie d'Alzheimer sont caractérisés par un déficit énergétique cérébral induit par une diminution de la capacité cérébrale à métaboliser le glucose. Nous proposons dans ce projet une stratégie de substitution énergétique en administrant du lactate. Les bénéfices attendus sont un maintien de l'équilibre énergétique cérébral couplé à un maintien des fonctions cérébrales ou un retard dans leurs altérations.
Procédures
- Procédure chirurgicale (implantation de pompes osmotiques + recharges). 1 fois + 14 fois / 15 min. -Examens par résonance magnétique nucléaire sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 2 fois ; 30 - 45 min). -Tests de comportements cognitivo-sensori-moteurs, test de l'anxiété et test de dépression (1 fois chaque test, 10 min par test) - Perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour permettre la mesure des échanges métaboliques. 1 fois / 1 heure. - Prélèvement du cerveau sur animaux préalablement mis à mort.
Impact sur les animaux
- L'implantation des pompes osmotiques nécessaires à l'administration de lactate nécessite une chirurgie. Chez l'animal anesthésié, des modifications du rythme respiratoire, mises en évidence grâce au monitoring pourraient survenir. Cette nuisance entraînera l'arrêt de l'expérimentation. - L’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive, cependant, durant l’examen d'IRM, un changement important du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l'animal et le lit IRM, peut subvenir, du fait de la variabilité entre les animaux de sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entrainera l'arrêt de l'expérimentation. - Les tests de comportement, notamment le test de restriction alimentaire, pourraient induire une anxiété chez les animaux.
Devenir
Le cerveau des animaux doit être prélevé pour décrypter les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur d'une modulation du métabolisme énergétique cérébral par administration de lactate et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à nos modèles expérimentaux (maladie d'Alzheimer).
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique d’investigation non-invasive et permet donc un suivi longitudinal des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les effectifs ont été déterminés grâce à un calculateur de taille d'échantillons ainsi que par notre expérience acquise lors d’études précédentes. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
L'Imagerie par résonance magnétique est une technique non invasive, cependant, l’utilisation d’anesthésique peut entraîner des nuisances et des effets indésirables pour les animaux. Afin de limiter les nuisances éventuelles au bien-être des animaux, durant les expérimentations d’imagerie, du gel oculaire sera appliqué afin d'éviter toute sècheresse oculaire et la température corporelle de l'animal sera maintenue grâce à un lit chauffant. Une variation importante du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés par un capteur positionné entre le rat et le lit de l'imageur, au cours de l'expérience sera retenu comme point limite. La récupération post-imagerie sera réalisée sous lampe chauffante jusqu’au réveil complet des animaux. Une réhydratation systématique avec sérum physiologique en sous-cutané sera aussi réalisée. Après leur retour en cage collective, les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, le comportement et sa vivacité et l’état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée. Enfin, afin de garantir le bien-être animal, les animaux seront hébergés en cage collective comprenant une litière, des frisures en papier craft ou lanière de peuplier des bâtonnets de bois à ronger, un tube cartonné pour pouvoir se cacher. Le nombre réduit de manipulateurs (1 seul zootechnicien et 1 unique expérimentateur) participera à réduire le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet sont deux souches très étudiées dans la littérature, leur utilisation permettra de minimiser le nombre d'animaux contrôles. Les souris partagent de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec les humains, ce qui permet d'observer des mécanismes pathologiques similaires à ceux de la maladie d'Alzheimer chez l'homme. Les modèles de souris transgéniques peuvent être génétiquement modifiés pour développer des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet d'explorer des hypothèses sur la neuroprotection. Il est possible de suivre des souris sur des périodes prolongées pour observer l'évolution de la maladie et l'impact de l'intervention neuroprotectrice. Les modèles murins permettent d'évaluer les fonctions cognitives et comportementales, fournissant des données sur l'efficacité du traitement neuroprotecteur. Le projet porte sur la neuroprotection dans le cadre du vieillissement cérébral sain ou pathologique (maladie d'Alzheimer). Les animaux seront donc utilisés de 4 mois à 18 mois.
Neuroprotection des photorécepteurs à cône chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Chaque rat reçoit une seule molécule par une seule voie, soit dix injections sous la conjonctive en un mois, soit six injections dans le vitré étalées sur six mois, soit une injection unique sous la rétine. 3 000 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'électrorétinogramme final dure quarante minutes, avec des électrodes plantées sous la peau des joues et du bas du dos et des lentilles posées sur l'œil, après une nuit passée dans le noir. Le porteur estime que dix rats traités et dix témoins suffisent par molécule, et retient le rat parce que la taille de son cristallin rend l'abord chirurgical de l'œil plus commode.
Objectifs
La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie neurodégénérative de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine, des couleurs et du contraste. S’ils dégénèrent, le sujet perd l’information visuelle centrale. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays développés. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif efficace pour la forme sèche, qui représente 80 pourcents des cas de DMLA. De nouveaux traitements sont actuellement en essai clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ne cible spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs. Ainsi, le but de ce projet est de trouver des molécules protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissu rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets neuroprotecteurs potentiels de certaines molécules. Les molécules qui ont démontré un sauvetage des photorécepteurs à cônes ont été sélectionnées. Ces molécules seront testées in vivo sur différents modèles de rat présentant une dégénérescence de la rétine, et seront administrées selon différents modes d’injections oculaires déjà pratiqués en clinique. En fin de traitement, un examen électrorétinographique sera réalisé afin de mesurer l’activité des photorécepteurs à cônes après un stimulus lumineux. La réponse obtenue à cet examen permet une première évaluation de l’éventuel effet neuroprotecteur sur les cônes in vivo. Suite à cet examen, les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés afin de corréler les résultats du premier examen avec une analyse histologique des photorécepteurs à cône ex vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou plusieurs molécule(s) sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), de rétinopathie pigmentaire autres dystrophies rétiniennes.
Procédures
Etape 1 : administration des molécules Nous allons administrer des molécules aux rats, par différentes voies oculaires selon leur pharmacologie. Chaque animal se verra administrer 1 seule molécule par 1 seule voie d’administration au cours de la procédure. -Collyres (sans anesthésie, animal vigile) : 1 goutte 1 à 3 fois par jour en fonction des molécules, pendant 3 mois -Injection sous-rétinienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 15 minutes) -Injection supra-choroïdienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections intravitréennes : sous anesthésie générale, 1 injection mensuelle pendant 6 mois (soit 6 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections sous-conjonctivales : sous anesthésie générale, 1 injection tous les 3 jours pendant 1 mois (soit 10 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 5 minutes). Suite aux administrations, un examen électrorétinographique (fonctionnement de la rétine sur animal vivant) sera réalisé, sous anesthésie générale, après mise en chambre noire pendant 1 nuit. Etape 2 : électrorétinogramme Des électrodes seront placées lors de l’électrorétinogramme en sous-cutané dans les joues et dans le bas du dos du rat comme prise de terre. Des lentilles cornéennes placées sur l’œil de l’animal enregistreront les réponses rétiniennes. Les électrodes sous cutanées se retirent comme une aiguille. La durée d’un examen électrorétinographique est de 40 minutes par animal. Suite à cet examen, l’animal sera directement euthanasié par une méthode règlementaire, puis des prélèvements oculaires seront réalisés.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir de la peur/détresse au moment des injections intra-péritonéales d’anesthésiants. Les animaux subiront un stress physique/thermique au moment des interventions chirurgicales. Dans les suites post-opératoires, une douleur oculaire du côté de l’intervention pourra survenir et la vision pourra être altérée, pendant quelques jours au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, puis les yeux seront prélevés pour permettre des analyses histologiques complémentaires.
Remplacement
Les molécules qui seront administrées in vivo ont préalablement été sélectionnées in vitro sur cultures cellulaires et explants de rétines de porc. Ces modèles présentent une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles, nous avons sélectionné des molécules ayant une double action : 1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant permettant un abord thérapeutique local facilement accessible et contrôlable (œil de rat). Dans le cas présent, les tests seront effectués sur un modèle de rat présentant des signes de dégénérescence similaires à celui de l’homme, induite ou congénitale.
Réduction
Dans un souci de réduction, nous avons établi préalablement à l’étude la taille des effectifs utilisés grâce à un calcul de puissance. Nous estimons ainsi que 10 rats traités et 10 rats contrôles seront suffisants. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet. Toujours dans un esprit de réduction, nous regrouperons les témoins pour les molécules ayant le même véhicule si les expérimentations ne sont pas trop asynchrones. Au total, 3000 animaux seront nécessaires à notre étude sur 5 ans.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, rouleaux en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des injections oculaires et des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale appliquée directement sur le site opératoire (œil). Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les rats seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’intervention et en chambre thermostatée de 32 degrés Celsius jusqu’à leur réveil complet. Une nouvelle aiguille stérile sera utilisée pour chaque animal afin de limiter la douleur induite lors des injections. Les animaux seront réveillés de l’anesthésie par administration d’un antidote en fin d’intervention. Nous appliquerons une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne suite aux injections intra et péri-oculaires et à l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les rats resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, rouleaux en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière pour les animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.
Choix des espèces
L’anatomie oculaire chez le rat (notamment taille et volume du cristallin) est beaucoup plus favorable à un abord chirurgical pour délivrance intra- et péri-oculaire des molécules testées, permettant de réduire le nombre d’animaux et d’expérimentations étant donné une diminution du nombre d’échecs. Nous utiliserons des rats chez qui nous induirons une dégénérescence rétinienne et d’autres présentant une dégénérescence congénitale. Les administrations oculaires seront réalisées entre le 6ème et la 8ème semaine de vie pour les rats chez qui nous induisons la dégénérescence. Les administrations oculaires chez les rats avec dégénérescence congénitale auront lieu entre P21 et P45 ou entre 1 et 8 mois de vie en fonction de la lignée (âges respectifs correspondant à la dégénérescence des cônes dans ces modèles).
Neuroprotection par surexpression d’un facteur de transcription CRX sur différents modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Les souris utilisées appartiennent à des lignées dont la rétine dégénère rapidement, l'une perdant sa réponse électrophysiologique dès quatre mois. 540 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous la rétine, qui peut provoquer un décollement rétinien, une opacification de la cornée ou des saignements dans l'œil, puis passe des séances d'électrorétinographie et de tomographie sous anesthésie à six âges différents, une partie subissant en plus un test de réflexe optomoteur de trois fois vingt minutes à cinq âges et un test clair-obscur. La mise à mort sert à prélever les rétines pour des marquages histologiques et des analyses transcriptomiques, l'ensemble visant à documenter une thérapie génique avant un éventuel essai clinique.
Objectifs
Plus de 200 gènes sont actuellement associés à la cécité congénitale. Bien que la thérapie génique ait été proposée pour un grand nombre de ces gènes, cette approche présente des limites. Nous avons la preuve que l'introduction d'une copie saine d'un gène spécifique impliqué dans le développement des photorécepteurs (cellules de détection de la lumière dans l'œil) peut retarder la perte de vision. Pour explorer plus avant cet effet thérapeutique, nous utiliserons deux modèles murins différents de cécité congénitale causée par des mutations dans différents gènes. Notre objectif est d'établir l'effet thérapeutique et d'élucider les mécanismes à l'origine de cet effet.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies. La plupart permettent uniquement de ralentir la dégénérescence. Certaines, plus efficaces, sont uniquement proposées en fonction de votre mutation. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace pour de rétinopathies. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles animaux, qui serviront de preuves de concept, ou d’études précliniques, nécessaires à réaliser en amont d’essais chez les patients. Le but est de poursuivre vers un essai clinique.
Procédures
Toutes les souris recevront une injection sous rétinienneous. Par la suite, les animaux seront soumise a ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes) à 6 âges diffeérents. Une autre partie des souris passeront un test de reflexe optomoteur (3 x 20 minutes espacés d’1 heure minimum) à 5 âges diffeérents. Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée.
Impact sur les animaux
Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum. L’injection sous rétinienne peuvent provoquer un décollement rétinien qui se résorbe en 48h. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.
Remplacement
Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
L'étude préclinique s'étendra sur une période de deux ans et a pour but d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie ophtalmique. Cette thérapie sera expérimentée sur deux lignées de modèles animaux. L'objectif est de confirmer l'efficacité du traitement sur un vaste panel de patients et de comprendre son mode d'action. La première phase de l'étude consistera à identifier la dose optimale à administrer à chaque modèle animal. Par la suite, une comparaison de l'efficacité du traitement sera effectuée. Seuls les animaux ayant reçu la dose la plus efficace seront soumis aux étapes ultérieures. L'objectif de cette étude est d'obtenir entre 7 et 10 yeux par traitement, afin de garantir des résultats statistiquement pertinents. Ce chiffre a été établi sur la base de données scientifiques. Seuls les animaux ayant été correctement injectés dans au moins un œil seront pris en compte dans l'analyse. Il est également possible que le nombre de modèles animaux soit réduit en fonction des résultats obtenus. Si, après un certain temps, le traitement s'avère inefficace, l'étude sera interrompue.
Raffinement
Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille de score adaptée est utilisée pour apprécier l’état des animaux, ce système comprend des points limites précoces qui permettent de détecter les premiers symptômes de douleur ou d’inconforme et d'intervenir rapidement.
Choix des espèces
La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Comme nous connaissons les modèles animaux que nous allons utiliser, nous pouvons définir le temps auquel il est plus pertinent d’injecter nos AAV, ainsi que les temps auxquels il faudra réaliser les expériences. Les rétines des souris utilisées dégénèrent très rapidement. Nous injectons donc à 14 jours aprés naissance et regarderont 21 jours plus tard les effets de l'injection. Les souris d'une autre lignée présentent une faible réponse électrophysiologique (ERG) dès l'âge de 4 mois, c'est pourquoi nous réaliserons les injections 30 jours après la naissance et examinerons l'efficacité de ces injections 30 jours plus tard. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.
Neuroprotection des photorécepteurs à cone chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".
Objectifs
La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.
Procédures
Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Remplacement
Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.
Réduction
Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.