Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées :
- 235 projets autorisés en avril 2026 (01/05/2026)
- 296 projets autorisés en mai 2026 (01/06/2026)
- 340 projets autorisés en juin 2026 (01/07/2026)
Etude chez la souris du rôle d’anticorps associés à une maladie auto-immune dans le développement de fibrose pulmonaire, un durcissement anormal du tissu altérant la fonction respiratoire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Objectifs
Chez certaines personnes ayant des prédispositions génétiques et sous l’influence de facteurs environnementaux (exposition à la fumée de tabac), le système immunitaire produit des anticorps anormaux qui vont attaquer leur propre organisme, et provoquer une maladie auto-immune. On parle alors d’auto-anticorps. C’est le cas de la polyarthrite rhumatoïde, une maladie auto-immune se traduisant par une inflammation articulaire au premier plan. Le projet vise à déterminer si ces auto-anticorps favorisent la formation de cicatrices dans les poumons (fibrose). La fibrose rend les poumons moins souples, gêne la respiration et peut conduire à une insuffisance respiratoire possiblement mortelle. Les traitements disponibles aujourd’hui peuvent ralentir l’évolution de la maladie mais ne la guérissent pas. Pour répondre à cette question, nous utiliserons un modèle chez la souris qui reproduit la fibrose pulmonaire et nous étudierons si des auto-anticorps isolés à partir de patients atteints de cette maladie auto-immune aggravent cette fibrose. Les résultats pourraient améliorer la compréhension de la fibrose associée aux maladies auto-immunes et ouvrir des pistes pour de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Les mécanismes à l’origine de la fibrose pulmonaire au cours de maladies auto-immunes demeurent encore mal compris à l’heure actuelle. Nous pensons que certains auto- anticorps favorisent la fibrose pulmonaire dans une maladie auto-immune appelée polyarthrite rhumatoïde. Comprendre leur rôle pourrait ouvrir la voie à des prises en charge plus ciblées. La prise en charge des patients présentant cette atteinte potentiellement mortelle constitue un enjeu majeur compte-tenu de sa sévérité.
Procédures
Entre 5 et 10 jours de vie, un prélèvement de tissu sera effectué sur animaux vigiles de certaines lignées génétiquement modifiées, afin de réaliser le génotypage (APAFIS #51323). A J0 de la procédure aura lieu l’induction de la fibrose (ou contrôle) sous anesthésie générale, par injection unique intratrachéale d’un produit déclenchant une fibrose pulmonaire ou d’une solution saline (contrôle). L’injection se fait au niveau de la face antérieure de la trachée après une mini- incision cutanée puis suture. La durée prévisible de cette procédure de l’incision à la suture est de 5–7 min. Une analgésie pré- et post-opératoire sera effectuée. De J-1 à J10 seront administrés les auto-anticorps, sur des animaux sédatés par un gaz anesthésiant par voie endotrachéale toutes les 48 h (7–8 séances sur 11 jours). Cette procédure ne nécessite pas de dissection et consiste en l'injection du produit après introduction d'un cathéter, par la bouche, dans la trachée de l'animal. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. A J7, un prélèvement sanguin unique sera réalisé au niveau de la joue sur des sur animaux non sédatés. La durée de cette procédure est de 25 secondes. A J7, J10 et J13, environ la moitié des animaux recevront une injection intra-péritonéale (réalisée dans la cavité abdominale au niveau du quadrant inférieur droit ou gauche) d’une substance activant ou inhibant certaines cellules immunitaires. Ces injections dureront moins de 10 secondes. L’étude prendra fin à J7 ou à J14 : les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale et les tissus seront recueillis.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées au génotypage sont décrites dans le projet APAFIS # 51323. Au cours de la procédure, la manipulation répétée des souris pour les différentes administrations de substances peut être source de stress. Les nuisances attendues lors des différentes administrations de substances dépendront du type et de la voie d’administration employés. Les injections intra-péritonéales peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’injection de substances dans la trachée par voie chirurgicale comporte un risque de douleur et d'irritation au niveau de la cicatrice durant 48 heures suivant l’incision et constitue un point de surveillance en post-opératoire. Les injections dans la trachée par voie chirurgicale ou par voie buccale peuvent induire une baisse transitoire de l’oxygénation et nécessite une surveillance du rythme respiratoire et de la couleur des muqueuses. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après l’induction. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général inférieure à 20% des effectifs.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à J7 ou à J14 de l’injection de la substance induisant la fibrose sous anesthésie générale, selon une méthode réglementaire. Les prélèvements pulmonaires et sanguins seront réalisés pour quantifier la fibrose et analyser les cellules immunitaires.
Remplacement
Avant toute expérimentation animale, nous utilisons des méthodes alternatives : cultures de cellules pulmonaires humaines et modèles 3D de sphéroïdes (structures en forme de sphère constituées de cellules pulmonaires humaines cultivées en trois dimensions). Ces approches permettent de tester nos hypothèses et d’optimiser en amont le protocole expérimental appliqué aux souris, limitant ainsi le recours aux animaux. Toutefois, elles ne reproduisent pas : (1) la complexité du développement de la fibrose dans un organe entier, (2) l’intégration du système immunitaire dans sa globalité, (3) le recrutement progressif et la migration de cellules vers le poumon via la circulation sanguine. À ce jour, il n’existe pas d’alternative par expérimentation en laboratoire ou par modélisation virtuelle capable de modéliser fidèlement ces aspects ; l’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal qui permet de tester nos hypothèses en s’affranchissant de résultats biaisés par le hasard ou un échantillon de taille insuffisante. De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules et tissus d’intérêt maintenus viables en dehors de l’organisme.
Raffinement
Nous appliquons le raffinement afin de limiter au maximum les contraintes et les possibles douleurs générées. Les méthodes de raffinement liées à la procédure de génotypage sont prises en charge dans le projet APAFIS # 51323. Toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Les souris sont maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales ; aucun animal ne sera isolé. Les instillations intratrachéales de la molécule induisant la fibrose ou de solution saline sont effectuées sous anesthésie générale, avec antalgie pré- et post-opératoire. Un enrichissement est fourni (coton de nidification, petit tunnel) ainsi qu’une alimentation gélifiée facile à ingérer en cas de difficulté de prise alimentaire ; l’eau et la nourriture sont disponibles à volonté. En plus de la surveillance quotidienne par le personnel animalier, une surveillance clinique est assurée par l’expérimentateur après le réveil puis au moins trois fois par semaine jusqu’à l’euthanasie selon une grille de points limites évaluant l’apparence, le comportement, la perte de poids et l’état de la suture. La fréquence de suivi sera augmentée si nécessaire. Tout animal atteignant un point limite sera euthanasié sans délai.
Choix des espèces
D’une part, les modèles de fibrose pulmonaire chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit à de nombreuses découvertes dans le domaine des traitements modulant le système immunitaire et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les processus immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 24 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Étude des fonctions des neutrophiles chez la souris au cours du sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Objectifs
Le sepsis est une pathologie grave caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée consécutive à une infection non contrôlée, responsable de plus de 11 millions de décès par an dans le monde. Malgré la mise en œuvre de recommandations internationales, les progrès médicaux et les milliards investis chaque année, le traitement du sepsis reste essentiellement symptomatique, en raison d’une compréhension encore incomplète des mécanismes impliqués. Les neutrophiles, acteurs centraux du système immunitaire, constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils ont la capacité de se déplacer rapidement vers les sites infectieux, d’ingérer les agents pathogènes et de libérer des substances toxiques pour les détruire. Plus récemment, il a été montré que les neutrophiles peuvent également produire des pièges extracellulaires constitués de leur propre ADN associé à des composés microbicides, capables de capturer et de tuer les pathogènes. Ce mécanisme est essentiel pour contrôler la propagation des infections. Lors d’un sepsis, les fonctions des neutrophiles sont profondément perturbées, ce qui contribue à l’aggravation de l’état clinique. Ils ne se développent pas correctement, se déplacent moins efficacement et produisent en excès des substances toxiques et des pièges extracellulaires. Ces mécanismes, normalement protecteurs, deviennent alors délétères : ils aggravent les lésions des organes et augmentent le risque de mortalité. La complexité du sepsis, impliquant des interactions entre cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, coagulation et organes, ne peut être reproduite fidèlement in vitro. Les modèles animaux, notamment murins, permettent de reproduire les principales caractéristiques du sepsis humain et restent nécessaires pour évaluer l’effet de candidats traitements dans un organisme vivant. Notre laboratoire a démontré le bénéfice de certains candidats thérapeutiques sur la survie et l’état clinique d’animaux septiques, souvent associé à une modulation de l’activité des neutrophiles. Nous cherchons désormais à mieux comprendre les mécanismes responsables de la dérégulation des neutrophiles au cours du sepsis et l’impact de différents candidats traitements.
Bénéfices attendus
La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis est décrite comme un phénomène aggravant les symptômes et contribuant à la sévérité de la maladie chez les patients septiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer l’effet de différents candidats traitements sur différentes fonctions des neutrophiles dans le contexte du sepsis, afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de cette pathologie.
Procédures
Une partie des animaux inclus dans cette étude pourra subir une ou plusieurs injections de molécules thérapeutiques avant la mise à mort. Les nuisances associées à ces procédures sont considérées comme légères, car elles n’entraînent que le stress lié à la manipulation des animaux et une douleur limitée à celle induite par l’introduction d’une aiguille, sans douleur persistante. Certains de ces animaux pourront également faire l’objet de prélèvements sanguins, notamment par voie rétro-orbitale. Dans ce cas, une anesthésie locale sera systématiquement mise en place, en complément de l’anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur inutile lors du prélèvement. Par ailleurs, certains animaux recevront une injection permettant de mimer une infection bactérienne, induisant des symptômes proches de ceux observés lors du sepsis humain, sur une durée maximale de 48 heures avant l’euthanasie. Ces animaux recevront un analgésique systémique permettant d’éviter toute souffrance inutile. Au cours de cette études les animaux pourront recevoir jusqu’à 2 injections (l’injection d’une solution se fait en moins de 5 min) et pourront subir jusqu’à 3 prélèvements sanguins dont un terminal juste avant l’euthanasie (le temps de manipulation des animaux pour ces prélèvements et également estimé à 5 min). Ces prélèvements seront espacés d’au moins 6 heures.
Impact sur les animaux
Une partie importante du projet sera réalisée sur des animaux sains, afin d’obtenir des neutrophiles matures et pleinement fonctionnels. Ces animaux ne seront soumis qu’aux manipulations nécessaires à l’euthanasie et, éventuellement, à une injection sous-cutanée réalisée environ deux heures avant celle-ci, dans le but d’augmenter la concentration de neutrophiles circulants. Ces interventions sont considérées comme faiblement invasives et génèrent un stress limité et transitoire. L’autre partie du projet sera effectuée sur des animaux traités par une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une molécule permettant de mimer une infection bactérienne, administrée 24 heures avant les prélèvements, afin de reproduire un état physiopathologique proche du choc septique humain. Les animaux développent certains des signes cliniques se rapprochant du sepsis humain : modification du comportement (isolement), altération de l’état général (faiblesses locomotrices), perte de poids et hypothermie. Dans l’ensemble des protocoles, les manipulations nécessaires (capture, contention, injection de molécules, prélèvements sanguins, anesthésie à l’isoflurane) sont susceptibles d’engendrer un stress temporaire pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure
Remplacement
La dysfonction des neutrophiles au cours du sepsis résulte d’une dérégulation systémique du système immunitaire. Par exemple, la molécule, que nous utilisons pour induire un choc endotoxinique chez les animaux, provoque in vivo une augmentation significative de la production de pièges extracellulaires, alors que cette même molécule n’en induit aucun mesurable in vitro. Ces dysfonctions résultent de mécanismes complexes, dépendant de l’activation simultanée de multiples populations cellulaires immunitaires et non immunitaires, et demeure difficile à reproduire fidèlement in vitro. Le remplacement des neutrophiles primaires par des lignées cellulaires n’est pas envisageable dans ce contexte. Bien que certaines lignées myéloïdes différenciées présentent des similarités avec les neutrophiles, elles demeurent imparfaites, ne reproduisant pas de manière fiable le comportement de neutrophiles primaires dans l’organisme. L’utilisation de neutrophiles primaires isolés à partir d’animaux reste donc nécessaire pour évaluer l’effet des traitements dans un contexte physiopathologique pertinent.
Réduction
Pour les études in vitro, la collecte d’un nombre suffisant de neutrophiles nécessite l’utilisation de plusieurs animaux, car la proportion de neutrophiles circulants chez la souris est naturellement faible, ce qui limite la quantité de cellules obtenues pour les différentes conditions expérimentales. Afin de pallier cette contrainte, nous avons récemment mis en place, sur la base de données issues de la littérature, un prétraitement des animaux par une molécule mobilisant les neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang périphérique en quelques heures. Ce prétraitement, consistant en une unique injection par voie sous-cutanée, permet d’augmenter significativement le nombre de neutrophiles récupérés et ainsi de réduire de manière importante le nombre d’animaux nécessaires par expérience. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux utilisés a été défini à partir des résultats préliminaires déjà obtenus au sein du laboratoire, où la dérégulation des neutrophiles est de plus en plus étudiée. Cette approche permettra d’éviter les répétitions inutiles et de limiter le nombre d’animaux aux effectifs strictement nécessaires à la validation statistique des résultats . Parallèlement, les organes et tissus prélevés sur les animaux sains ou septiques seront mutualisés et utilisés pour d’autres projets en cours au sein du laboratoire, afin d’optimiser l’utilisation de chaque individu et éviter toute expérimentation redondante.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des animaux et ce afin de déceler tout excès de douleur, ce qui introduirait un biais dans nos recherches. Plus particulièrement chez les animaux septiques, le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres standardisés suivants, afin de déterminer un score global sur 20 (chaque paramètre étant noté de 0 à 4) : le suivi de l’état physique, du comportement et des sécrétions seront réalisées par un examen visuel. Cette surveillance commencera dès 6h suivant l’induction du modèle de sepsis et sera renouvelé à 16h puis toutes les 8h. Le suivi du poids de l’animal sera réalisé à l’aide d’une balance et le suivi de la température sera réalisée à l’aide d’un thermomètre rectal pour souris. Les animaux ne devront pas atteindre un score global≥17 pour les paramètres standardisés. Ce score est prédictif d’un risque de décès élevé sous 4 heures et de dysfonctions d’organes généralisées. Ces critères seront résumés sous forme d’un tableau et ont été définis à partir des données de la littérature. Les animaux seront placés dans une armoire ventilée dont la pression et la température sont contrôlables. Les animaux septiques étant hypothermiques, la température de l’armoire sera augmentée de 3 degrés par rapport à la température standard de l’animalerie, afin de facilité la régulation de la température de ces animaux (les animaux contrôles seront hébergés dans les mêmes conditions). Ils auront un accès constant à l’eau, à la nourriture, au matériel pour leur nid et à des activités de jeu. Aucun rongeur ne sera seul, sauf en cas d’agressivité ou de soins particuliers. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anésthésie générale à l’isoflurane pour la voie intracardique et sous anesthésie générale à l’isoflurane avec l’addition 2 minutes avant le prélèvement d’un collyre anésthésique en locale au niveau de l’œil.
Choix des espèces
L’étude du sepsis, à travers l’utilisation de souris comme modèle animal, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Utiliser la souris facilitera la mise en perspective de nos résultats. Un large éventail de techniques sont adaptées au modèle souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. Les souris auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation, soit l’âge de leur maturité sexuelle (naissance > 1 mois). Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi de travailler avec des souris mâles, afin de nous affranchir du cycle oestrien des femelles, qui peut induire de la variabilité dans nos résultats et modifier notre interprétation.
Approche préventive par nanoparticules pour réduire les infections pulmonaires dans un modèle de granulomatose chronique septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Objectifs
La granulomatose septique chronique est une maladie génétique rare qui affaiblit les défenses naturelles de l’organisme contre les infections. Les personnes atteintes souffrent d’infections graves et répétées, surtout au niveau des poumons, pouvant entraîner un décès plus précoce que la normale. Une bactérie particulièrement dangereuse dans ce contexte est Pseudomonas aeruginosa, responsable d’infections pulmonaires sévères. Les traitements actuels reposent surtout sur les antibiotiques et la prévention des infections. Ils ne sont pas toujours efficaces, notamment en raison de la faiblesse du système immunitaire et de l’apparition de bactéries résistantes. Certaines options plus lourdes, comme la greffe de moelle osseuse, ne peuvent pas être proposées à tous les patients, et les nouveaux traitements sont encore en cours de développement. Dans ce contexte, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal reproduisant une forte sensibilité aux infections pulmonaires, afin de pouvoir étudier de manière pertinente l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet consiste à tester une approche basée sur des nanoparticules destinées à renforcer les défenses naturelles des poumons contre les infections dans ce modèle. L’objectif est de vérifier si cette stratégie permet de réduire la gravité des infections pulmonaires et de fournir des informations utiles pour le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
À court terme, l’objectif est de démontrer, dans un modèle animal pertinent, qu’il est possible de limiter efficacement une infection pulmonaire aiguë par Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste. Cette approche repose sur des liposomes transportant des protéines capables de rétablir l’activité microbicide des macrophages alvéolaires, restaurer la production d’espèces réactives de l’oxygène et renforcer la réponse immunitaire locale. À long terme, cette stratégie pourrait devenir une nouvelle thérapie innovante pour l’Homme, améliorant la qualité de vie et l’espérance de vie des patients immunodéficients, tout en réduisant la dépendance aux antibiotiques et en limitant le risque de résistances.
Procédures
Les souris seront soumises à un nombre limité d’interventions réalisées sous anesthésie. Selon le schéma expérimental, chaque animal subira une à deux administrations (l’une pour le produit testé, l’autre pour les bactéries) et jusqu’à six séances d’imagerie, chacune durant environ 5 minutes. Ces imageries permettront soit de suivre la distribution du produit (6 séances), soit de suivre l’évolution de l’infection (3 séances). Chaque anesthésie durera au maximum une dizaine de minutes pour les administrations, et environ 5 minutes pour les imageries. Entre deux séances d’imagerie, les délais seront de 3, 18 ou 24 heures, selon les besoins du suivi longitudinal. Une tonte du pelage, localisée au niveau ventral, sera nécessaire pour les prises de clichés et sera réalisée pendant l’anesthésie. Toutes les interventions sont brèves, espacées dans le temps et réalisées sous anesthésie pour limiter au maximum la contrainte pour les animaux.
Impact sur les animaux
Les interventions sur les souris peuvent provoquer des gênes de courte ou moyenne durée et d’intensité variable. La contention nécessaire pour l’anesthésie provoque un stress très bref, inférieur à une minute, suivi d’une anesthésie courte (5 à 10 minutes). Le réveil peut entraîner une légère perturbation de la respiration ou des mouvements pendant quelques minutes, mais les animaux récupèrent rapidement. En revanche, l’infection bactérienne peut entraîner des effets sévères, apparaissant généralement dans les 24 à 48 heures et durant plusieurs jours : perte de poids importante, baisse marquée de l’activité et de l’appétit, posture voûtée, poils hérissés et respiration rapide ou difficile. Ces effets peuvent évoluer rapidement et entraîner la mort de certains animaux. La surveillance est constante pour suivre l’évolution de chaque animal et limiter au maximum sa détresse. La sévérité globale des interventions dépend surtout de la puissance de l’infection et de la répétition des anesthésies. Toutes les mesures possibles sont prises pour réduire la gêne liée aux manipulations, mais la souffrance liée à l’infection elle-même reste un aspect inévitable du modèle.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront soit réutilisés pour des activités d’enseignement lorsque cela est possible, soit euthanasiés lorsque l’expérience l’exige. En particulier, certains pourront, si l’occasion se présente, participer à des séances de formation technique (tutorat) destinées à former le personnel à des gestes maîtrisés sous la supervision d’un tuteur agréé. Les animaux ayant survécu à une infection par Pseudomonas aeruginosa à une dose induisant 25 % de mortalité ne pourront pas être réutilisés. Enfin, certains seront euthanasiés en fin de protocole pour des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, la production de nanoparticules lipidiques actives et non toxiques, ainsi que leur efficacité, ont d’abord été évaluée in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant, aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet actuellement de reproduire la complexité physiopathologique d’un organisme vivant, ni d’évaluer la tolérance systémique et les réponses immunitaires globales. Le recours à un modèle murin ici est donc nécessaire pour évaluer l’efficacité et la sécurité d’une stratégie préventive avant toute transposition clinique.
Réduction
Les procédures ont été conçues pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Le suivi des mêmes animaux à différents moments permet d’obtenir de nombreuses données, tout en réduisant leur nombre total nécessaire. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de données déjà connues dans la littérature ainsi que de résultats issus du laboratoire, évitant ainsi de multiplier les essais préliminaires. L’organisation progressive du projet, où chaque étape repose sur les résultats de la précédente, maximise également les informations obtenues pour chaque animal et contribue à réduire leur utilisation.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours. L’enrichissement sera adapté tout au long de l’étude pour garantir leur confort, leur thermorégulation et le maintien de relations sociales normales. Elles seront logées par petits groupes homogènes afin de préserver les interactions entre congénères tout en respectant les normes sanitaires. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié et, lorsqu’une anesthésie adaptée est nécessaire, elle sera toujours appliquée au préalable pour réduire le stress et la douleur. Après infection, des croquettes et de l’eau gélifiée seront placées au fond de la cage, en plus des sources habituelles, afin de limiter les efforts des animaux et prévenir toute déshydratation. Un suivi clinique quotidien permettra de détecter tout signe de souffrance, et en cas de détection, des actions visant à la supprimer seront réalisées sans délai. Ces mesures garantissent le respect du principe de raffinement, réduisant au maximum le stress et la douleur des animaux et limitant la durée ainsi que l’intensité des interventions, tout en permettant la collecte des données scientifiques nécessaires.
Choix des espèces
Pour étudier la granulomatose septique chronique ou l’infection pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa, nous utiliserons des souris spécialement modifiées pour reproduire fidèlement les signes observés chez l’humain, tels que l’inflammation, la perte de poids et, dans certains cas, la mortalité. Les animaux choisis sont jeunes adultes, afin que leur système immunitaire soit mature et représentatif pour l’étude.
Restauration d’une ovogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Objectifs
La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.
Procédures
Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.
Raffinement
Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.
Combinaison d’une molécule ciblant l’axe de maintien du fonctionnement mitochondrial avec des immunothérapies comme nouvelle stratégie contre l’ostéosarcome
- Recherche appliquée
- Cancers
Objectifs
Les ostéosarcomes sont des cancers osseux rares qui surviennent principalement chez les enfants, adolescents et jeunes adultes, avec environ 100 à 200 nouveaux cas diagnostiqués chaque année en France. Ils représentent la forme la plus fréquente de tumeur osseuse maligne chez cette population et touchent majoritairement des patients âgés de 10 à 25 ans, avec une incidence particulièrement élevée chez les adolescents. Malgré des protocoles combinant chimiothérapie et chirurgie, 30 % à 50 % des patients rechutent, et ces récidives concernent principalement des patients présentant des maladies métastatiques ou réfractaires aux traitements standard. Pour ces patients, le pronostic reste très sombre et il n’existe actuellement aucun traitement standard clairement efficace, ce qui constitue un enjeu clinique majeur. Dans ce contexte, des données préliminaires de notre laboratoire ont identifié un composé comme une piste thérapeutique potentielle pour les tumeurs d’ostéosarcome pédiatriques de mauvais pronostic, justifiant une évaluation préclinique approfondie de son efficacité, de ses mécanismes d’action et de ses combinaisons thérapeutiques dans des modèles expérimentaux appropriés. En effet, ce composé a montré une activité antitumorale prometteuse in vitro et in vivo dans des modèles de tumeurs de patients implantées chez des souris immunodéficientes, issus de patients atteints d’ostéosarcomes pédiatriques récurrents ou réfractaire. De plus, nous avons synthétisé une douzaine de variants chimiques d'un composé à visée d’optimisation. Le premier objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance et l’efficacité du composé, de ses analogues et de leurs différentes formulations dans des modèles murins d’ostéosarcome immunocompétents, afin de sélectionner le meilleur candidat. Le deuxième objectif est de caractériser le microenvironnement tumoral et les réponses immunitaires associées après traitement par ce candidat optimal, dans le but d’identifier et de prioriser des stratégies d’immunothérapie pertinentes. Enfin, le troisième objectif consiste à évaluer l’efficacité de la combinaison entre le meilleur candidat sélectionné, la meilleure formulation et les immunothérapies retenues. À terme, ce projet devrait permettre d’identifier une association thérapeutique prometteuse pouvant faire l’objet de développements précliniques et translationnels ultérieurs pour le traitement des ostéosarcomes pédiatriques récurrents ou réfractaires.
Bénéfices attendus
Le protocole évaluera l’efficacité antitumorale et les effets immunologiques du meilleur analogue et de sa formulation optimisée du composé testé, sélectionnés après des études préliminaires de tolérance et d’efficacité. Les expériences seront conduites chez des souris porteuses de tumeurs , dans des modèles d'ostéosarcome. Cette approche permettra de caractériser de manière intégrée la progression tumorale, les réponses immunitaires associées et le profil de biodistribution du composé, fournissant une base solide pour le choix des immunothérapies à tester en combinaisons ultérieures. Le bénéfice potentiel global attendu est le développement de nouvelles thérapies plus efficaces contre l'ostéosarcome.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules tumorales afin d’établir les modèles tumoraux. Pour un modèle , une unique injection de cellules tumorales dans l'organe sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 5-10 minutes par souris, sous analgésie. Pour un autre modèle métastatique, une injection de cellules tumorales sera réalisée chez l’animal vigile sous anesthésie locale, pour une durée maximale de 5 minutes par souris. Les traitements seront administrés par gavage oral ou par injection selon les groupes expérimentaux. Les administrations par gavage auront une durée maximale d’environ 1 minute par souris et seront réalisées jusqu’à 5 fois par semaine pendant une durée de 3 à 5 semaines (maximim 25 gavages). Les injections de composés seront réalisées sous anesthésie locale avec une durée maximale d’environ 1 minute par souris, avec une fréquence pouvant atteindre 5 fois par semaine pendant 3 à 5 semaines selon les procédures expérimentales (25 injections au maximum). Dans certaines expériences, des immunothérapies candidates seront également administrées selon leur voie d’administration spécifique, avec une durée similaire (moins d'1 minute par injection), vigile, anesthésie locale. À la fin de l’étude, un prélèvement terminal de sang sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie par ponction intracardiaque transcutanée (durée approximative: 5 minutes), suivi immédiatement de l’euthanasie et de la collecte des organes pour analyses.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la croissance tumorale, pouvant entraîner une altération progressive modérée de l’état général, une gêne fonctionnelle au niveau des membres ou des difficultés respiratoires modérées selon la localisation tumorale. Les effets indésirables dûs aux interventions (injections, gavages) seront transitoires et légers.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux sur tissus et organes la réponse antitumorale mise en place après traitement par nos molécules.
Remplacement
Les modèles alternatifs in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité du comportement tumoral in vivo, en particulier les interactions dynamiques entre la tumeur, son microenvironnement et le système immunitaire, ni la réponse intégrée à des traitements systémiques. L’utilisation de modèles murins immunocompétents est donc indispensable pour évaluer l’activité antitumorale du composé M30-E05 et de ses formulations optimisées dans un contexte physiologique pertinent, ainsi que pour étudier leurs effets en association avec des approches d’immunothérapie. Ces modèles permettront de caractériser les mécanismes d’action du traitement, d’explorer des stratégies combinées et de générer des données précliniques essentielles en vue d’une application thérapeutique chez des patients atteints d’ostéosarcomes pédiatriques de mauvais pronostic.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les doses du composé à tester, de ses analogues et de leurs formulations optimisées seront définies à partir des données précliniques obtenues dans notre laboratoire précédemment. Ces nombres tiennent compte du taux de prise tumorale attendu (~80 %), des différents modèles tumoraux, des voies d’administration et des analyses supplémentaires, et représentent le maximum nécessaire, pouvant être réduits selon les résultats obtenus au cours des différentes étapes.
Raffinement
Les souris seront greffées et suivies sous anesthésie générale pour l’ensemble des procédures de greffe. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement toute altération de l’état général, du comportement, de la mobilité ou de la prise alimentaire, ainsi que l’évolution du développement tumoral aux sites d’implantation. Des points limites précoces, adaptés aux modèles, seront strictement appliqués. En cas de signes cliniques pertinents, un traitement antalgique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupes, avec un accès ad libitum à l’eau et à l’alimentation, et bénéficieront systématiquement d’un enrichissement environnemental adapté à l’espèce, pouvant être renforcé si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en oncologie préclinique, permettant l’étude de la croissance tumorale et des interactions avec le système immunitaire. L’utilisation de souris immunocompétentes est essentielle pour évaluer l’activité du M30-E05 et de ses analogues/formulations dans un contexte immunitaire fonctionnel et pour explorer des stratégies de combinaison avec l’immunothérapie. Les cancers étudiés touchant principalement les enfants et adolescents, nous utiliserons donc des jeunes souris de 4 à 6 semaines pour refléter ce stade de développement.
Diagnostic du botulisme, titrage des toxines botuliques et anticorps neutralisants ces toxines
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Objectifs
Ce projet vise à réaliser le diagnostic du botulisme qui est une maladie grave causée par une toxine puissante, pouvant entraîner des paralysies sévères chez l'homme et l'animal et potentiellement mortelle. Actuellement, la méthode la plus fiable pour confirmer cette maladie repose sur des tests utilisant des souris, car aucune alternative aussi sensible n'existe pour détecter d'infimes quantités de toxine. Les objectifs principaux sont dans un premier temps, de détecter la présence de toxine : des échantillons (sérum, selles, aliments) de patients ou animaux suspects sont injectés à des souris. Leur observation permet de confirmer la présence de toxine si des signes de paralysie apparaissent. Dans un second temps, de mesurer la puissance de la toxine : des souris reçoivent différentes doses de toxine pour déterminer la quantité provoquant la mort de 50 pourcents d'entre elles. Cette mesure permet d'évaluer la dangerosité des préparations de toxine. Enfin, d’identifier le type de toxine : des sérums spécifiques (obtenus à partir de lapins immunisés) sont utilisés pour neutraliser et identifier le type de toxine présent dans les échantillons.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : diagnostic fiable du botulisme, qui est une affection neurologique sévère, le plus souvent d’origine alimentaire. Importance de ce diagnostic : bénéfice individuel pour le patient permettant la mise en place d’un traitement adapté de manière rapide. Bénéfice collectif : effectuer des retraits de lots de manière rapide en cas de transmission par des aliments identifiés grâce à ce diagnostic. Bénéfices à long terme : mise en œuvre de méthodes diagnostiques alternatives et réduction de l’utilisation des souris.
Procédures
Les souris recevront une injection d’échantillon à tester qui peut provoquer une douleur légère, réversible et de courte durée (une seule injection par souris, durée de l’acte inférieure à 30 s). Les souris seront mises à mort par une méthode réglementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir une douleur légère de courte durée ponctuelle et réversible lors de l’injection (une injection par souris, durée de l’acte inférieure à 30 s). L’injection de toxine via l’échantillon biologique à tester (potentiellement contaminé) peut induire une paralysie de l’animal et des difficultés respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils seront injectés avec des échantillons biologiques contenant potentiellement des toxines. Les effets des toxines étant irréversibles, les animaux ne peuvent donc ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Plusieurs techniques de laboratoire sans recours aux animaux ont été développées pour détecter les toxines responsables de cette maladie grave. Ces méthodes présentent cependant des limitations majeures qui les rendent actuellement inadaptées pour répondre aux besoins spécifiques de ce projet. Les tests immunologiques, bien que rapides, standardisés et sans utilisation d’animaux, ont une sensibilité insuffisante pour détecter les très faibles concentrations de toxine présentes dans les prélèvements cliniques. De plus, certains sous-types de toxine échappent à la détection, et ils ne permettent pas de différencier la toxine active de résidus de toxine. Une technique déjà identifiée est rapide et n’utilise pas d’animaux mais la sensibilité est insuffisante pour détecter les très faibles concentrations de toxine présentes dans les prélèvements cliniques. Les méthodes de biologie moléculaire sont très spécifiques et sensibles pour certains types de toxine, mais ne détectent que la présence du matériel génétique, pas l'activité biologique de la toxine. De plus, certains variants ne sont pas identifiables et ils nécessitent la présence de la bactérie (inadaptée sur échantillons de sérum). Malgré ces avancées technologiques, aucune méthode alternative ne permet actuellement de détecter l'ensemble des variants de toxine avec une sensibilité suffisante ni d’évaluer l'activité biologique réelle de la toxine. De ce fait, aucune méthode alternative permet de garantir la sécurité des diagnostics pour les patients Dans l'état actuel des connaissances scientifiques, le recours aux animaux reste donc indispensable pour garantir la fiabilité des diagnostics, assurer la sécurité des patients, développer des traitements efficaces et maintenir la surveillance épidémiologique.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus pour ce projet est lié au nombre d’échantillons reçus pour suspicion d’intoxination annuellement. Pour chaque demande, une fiche de renseignements cliniques est fournie par le prescripteur. Une revue de la pertinence de la prescription est réalisée et les demandes non justifiées sont annulées par le biologiste. Le laboratoire travaille en collaboration avec d’autres équipes à la fois au niveau national et international pour utiliser une méthode alternative à l’expérimentation animale pour faire ce diagnostic, sans compromettre la prise en charge des patients et la prévention en cas d’identification d’un nouveau foyer.
Raffinement
Avant de débuter le projet, les souris seront acclimatées pendant une semaine en conditions standard d’animalerie. Des critères d’arrêt ou points limites spécifiques et précoces ont été déterminés pour chaque procédure expérimentale, avec gel nutritif et renforcement de l’enrichissement dès l’apparition d’un signe clinique afin d’éviter la souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
La méthode de référence pour le diagnostic du botulisme est le test d’inoculation à la souris, espèce qui est sensible à tous les sous-types connus de toxines botuliques. Des animaux adultes de 4 à 8 semaines seront utilisés dans ce projet : la sensibilité des souris aux toxines dépend de leur âge et de leur poids ; nous avons acquis une longue expérience et de nombreuses données avec les animaux de cet âge pour lequel les résultats sont reproductibles.
Caractérisation du phénotype cortical d’une lignée de souris reproduisant une mutation sur le gène cdc25b identifiée chez des patients microcéphales.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Objectifs
Chez les vertébrés, le développement d’un système nerveux central fonctionnel nécessite une coordination étroite entre production d’un stock de cellules souches neurales et leur différentiation en neurones. Des défauts dans cette coordination peuvent entraîner des anomalies de développement graves telles que la microcéphalie (développement d’un cerveau plus petit que la moyenne). Il est désormais bien établi que les gènes qui contrôlent le cycle cellulaire, mécanisme permettant la division des cellules, sont important pour cette balance division/differentiation. L’analyse du développement du cortex cérébral dans un modèle de souris dans lequel le gène CDC25B, acteur du cycle cellulaire, est inactivé, nous a permis de montrer que CDC25B joue un rôle important pour produire les cellules nerveuses du cortex au cours du développement. Récemment, une nouvelle mutation dans ce gène a été identifiée chez l’homme, associée à de la microcéphalie. Cette découverte établie un lien direct entre une dérégulation de CDC25B et le développement d’une microcéphalie chez l’homme. L'objectif de ce projet est d’élucider ce lien entre CDC25B et microcéphalie pour mieux comprendre le développement de ce défaut de développement. Pour cela, nous analyserons deux lignées de souris porteuses de cette nouvelle mutation. L’analyse des premières portées issus de l’élevage montrent que cette mutation entraine bien, comme chez l’homme, une microcéphalie. L’objectif du projet est de caractériser cette microcéphalie et de déterminer quelles étapes du développement sont affectées par cette mutation en analysant les étapes clés du développement du cerveau chez des souris mâles et femelles afin de voir si cette mutation affecte différemment les deux sexes.
Bénéfices attendus
Des collaborateurs viennent d’identifier chez l’homme une nouvelle mutation dans le gène CDC25B qui conduit à de la microcéphalie et à des défauts neurodeveloppementaux. C'est une anomalie du développement qui se traduit par une moindre espérance de vie et un déficit cognitif. La reproduction de cette mutation dans deux lignées de souris nous permettra d’étendre notre compréhension des mécanismes développementaux déficients lors de la survenu de la microcéphalie et de comprendre comment un défaut de régulation des paramètres du cycle cellulaire peut entrainer une microcéphalie.
Procédures
Des souris femelles gestantes recevront une injection pour marquer leur ADN (2 à 3 secondes)
Impact sur les animaux
Un stress léger lié à la contention et à l'injection pendant moins de 5 secondes pourra être engendré sur les femelles. Cette nuisance est de classe légère.
Devenir
Les femelles gestantes seront mises à mort pour prélever les embryons.
Remplacement
Notre projet vise à caractériser la fonction d’un acteur du cycle cellulaire, CDC25B dans la survenue de la microcéphalie. Cette anomalie développementale est caractérisée par des mesures crâniennes, périmètre et diamètre de la tête, inférieurs à la normale. Ces mesures supposent l’intégrité de l’embryon durant toute la durée de l’expérimentation. Nous voulons également analyser différentes étapes de la neurogenèse de façon quantitative. Les techniques de développement des premières étapes du développement du cerveau en culture (organoïdes) sont utiles pour identifier de gros défauts de développement mais il y a trop d’hétérogénéité entre les différents organoïdes sauvages pour pouvoir quantifier de façon fine le nombre de progéniteurs et de neurones. Il est donc difficilement envisageable de réaliser des quantifications précises de ces cellules dans ce modèle à l’heure actuelle.
Réduction
Afin de limiter les nombre d’animaux utilisés, nous concentrerons nos analyses sur quelques stades clés du développement du cerveau. Pour réduire significativement le nombre d’échantillons nécessaires à une bonne analyse de nos résultats, nous utiliserons un test statistique spécifiquement développés pour notre projet et qui permet d’obtenir une bonne puissance statistique sur un petit nombre d’échantillons. Enfin, chaque embryon prélevé sera utilisé pour un maximum de mesures et d'analyses.
Raffinement
Aprés l'injection , les femelles seront surveillées durant toute la durée de l’expérience (2H à 72h). Si un abcès se développe au point d’injection elles seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car c’est un modèle mammifère chez qui on peut introduire des mutations génétiques ciblées et que l’on peut élever facilement. Ce modèle génétique se caractérise par un développement du cerveau largement comparable à celui de l'homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront servir la compréhension de la survenue de défauts neurodéveloppementaux chez l’homme. Nous utiliserons des males de 8 à 32 semaines comme reproducteurs pour générer les embryons. Nous utiliserons des souris femelles de 8 à 20 semaines comme mères porteuses. Nous collecterons également des embryons de 3 stades de développement differents pour analyser le comportement des cellules souches neurales et la mise en place des differentes populations de cellules nerveuses dans notre modéle.
Étude du rôle du gène H13 au cours du développement chez la souris pour évaluer son implication dans une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Objectifs
L'empreinte parentale est un mécanisme biologique qui influence l'activation (ou l'expression) de certains gènes en fonction de leur origine maternelle ou paternelle. En générale, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Cependant, environ 150 gènes ne s'expriment qu'à partir de l'une des copies (soit celle de notre mère, soit celle de notre père). Ces gènes sont importants pour la croissance et le développement. Lorsqu'un problème survient dans ce processus, cela peut entrainer des maladies rares, comme le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin. Cette pathologie se caractérise par un retard de croissance, des difficultés d'alimentation et parfois d'autres troubles du développement. Chez les personnes atteintes de ce syndrome, la cause génétique est la présence de deux chromosomes 20 provenant de la mère, mais aucun provenant de leur père. Cela perturbe l'expression normale de certains gènes présents sur ce chromosome. Parmi ces gènes, nous avons identifié deux gènes d'intérêt qui pourraient jouer un rôle clé. Le premier gène d'intérêt est actif uniquement lorsqu'il vient du père, tandis que le second s'exprime différemment selon qu'il vient du père ou de la mère. Les versions maternelles de ce second gène d'intérêt produisent une enzyme particulière, alors que la fonction des versions paternelles reste inconnue. Ce projet a pour but d'étudier en détail la région de ces deux gènes d'intérêt chez la souris pour comprendre comment elle pourrait être impliquée dans le MBCS. Pour mieux comprendre l'impact de ces gènes sur le développement, nous allons utiliser des modèles cellulaires et un modèle de souris. En particulier, nous allons étudier des souris qui ont une modification génétique dans ce second gène et déterminer les conséquences de la transmission de cette modification à partir du père ou de la mère notamment sur la croissance et le métabolisme. L'objectif final est d'étudier comment l'absence de ces différentes versions du gène (selon qu'elles viennent de la mère ou du père) influence le développement de l'organisme, afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin.
Bénéfices attendus
Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité de ces maladies (80 %) sont d'origine génétique. Identifier les causes génétiques est essentiel, non seulement pour mieux comprendre les mécanismes qui provoquent ces maladies, mais aussi pour améliorer leur diagnostic et permettre des traitements plus précoces. Ce projet vise à étudier le rôle d’une région du génome afin de mieux comprendre les mécanismes conduisant à une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin (MCBS). Cette maladie, découverte en 2016 se manifeste par des troubles de la croissance et du développement. Ce projet évaluera si le gène ciblé est impliqué dans cette maladie, et si c’est le cas, cela suggérera qu'il existe des causes génétiques du MBCS, non encore identifiées, affectant uniquement cette région. Il serait alors intéressant d'examiner les patients présentant des symptômes similaires à ceux du MCBS pour voir s'ils ont des anomalies génétiques dans cette région. Ce travail permettra de mieux comprendre les effets de ces anomalies et d'aider à développer des tests pour diagnostiquer les patients atteints de maladies génétiques affectant la croissance et le développement, mais qui n'ont pas encore de causes connues.
Procédures
Dans le but d'étudier le rôle de la région du génome ciblé et d'évaluer son lien avec une maladie humaine appelée le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, une lignée de souris déficientes pour les différentes formes de ce gène sera étudiée. L'objectif est de voir si la perte de ce gène entraîne des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Une première partie de l’étude se focalisera sur le développement embryonnaire de cette lignée. Lors de cette étude, les animaux (mères) seront soumis à deux échographies sous anesthésie générale gazeuse pour contrôler le développement des embryons. La durée de ces échographies est d’environ 15 minutes. Ensuite, l’étude de la croissance des souris sera surveillée en mesurant le poids de 72 souris chaque semaine de 2 à 15 semaines d’âge. Ces souris seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété (6 tests dont la durée est de quelques minutes, toujours inférieur à une heure). L’hypotonie néonatale sera testée entre 8 et 10 jours après la naissance sur une durée de quelques minutes. Les données préliminaires montrent un retard de croissance, c'est pourquoi deux prélèvements sanguins à l’âge de 4 et 15 semaines seront effectués sur les souris pour mesurer les hormones de croissance (la durée de la prise de sang est d’environ 1 minute). Perfusion intracardiaque, sous anesthésie générale : Réalisée une seule fois sur 30 animaux en fin de protocole. Durée totale de la procédure de l'injection d'anesthésique au prélèvement des tissus : environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude pourront développer des symptômes similaires à ceux observés lors d'une étude préliminaire et chez les patients atteints de MBCS. Chez la souris, ces symptômes incluent un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, ainsi qu'une baisse du taux de sucre dans le sang après les repas chez les mâles. De plus, certaines souris pourraient avoir des difficultés à se nourrir et une hypotonie (faiblesse musculaire). Concernant les procédures expérimentales, les étapes consistant à l’identification et au suivi de la croissance sont simples et ne causent presque pas de gêne. Elles sont classées comme des procédures légères. Pour la partie étude embryonnaire, deux anesthésies gazeuses sont prévues pouvant induire un stress léger. Les prélèvements sanguins seront limités au nombre de deux par animal et espacés dans le temps, ce qui en font aussi des procédures de classe légère. Les tests physiques et neurodéveloppementaux, utilisés pour vérifier la force musculaire, la coordination, la mémoire ou le niveau d’anxiété, sont de classe légère. Certains tests pourraient provoquer une légère anxiété, mais celle-ci sera de courte durée, avec un maximum de 6 tests espacés de minimum 48h. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil (perfusion) peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux. Ainsi, le maximum est fait pour obtenir le plus grand nombre de données à partir du nombre le plus restreint d'animaux.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'étudier la fonction d'une région du génome cible, afin de comprendre son rôle dans une maladie rare affectant le développement, appelée syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin (MBCS). L'étude se fera en utilisant un modèle de souris, car il est impossible de remplacer cet animal pour cette partie du projet. En effet, pour comprendre comment ce gène agit au cours du développement, il est nécessaire d'observer les effets de la perte de ses différentes formes au fil du temps, depuis l'embryon jusqu'à l'âge adulte. Les signes attendus, comme un retard de croissance, des retards de développement et des troubles musculo-squelettiques (concernant les muscles et les os), ne peuvent être étudiés que dans un organisme entier en développement, comme la souris, modèle utilisé dans ce projet. Par exemple, le retard de croissance peut être dû à des problèmes de placenta (qui nourrit le fœtus), et cela ne peut être observé que pendant le développement de l'embryon dans l'utérus. En revanche, pour étudier les fonctions de ce gène au niveau moléculaire, il n'est pas nécessaire d'utiliser un organisme entier. Ces études seront réalisées in vitro, en utilisant des lignées de cellules souches neurales de souris, déjà disponibles, et d'autres lignées qui seront dérivées des animaux pour poursuivre les analyses moléculaires.
Réduction
La stratégie expérimentale sera planifiée afin d’utiliser le nombre d’animaux le plus petit possible pour l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables. Ainsi, l’élevage est minimisé (en prenant en compte que le gène cible est soumis à empreinte parentale) et les schémas de croisements permettent de générer les animaux contrôles et tests dans la même portée. Pour les données testées (courbe de poids par exemple) dans l’étude pilote, un calcul de taille de l’échantillon a été réalisé. L’utilisation des animaux pour les différentes analyses sera optimisée afin que les animaux utilisés pour l’étude de croissance servent également à l’analyse des phénotypes neurodéveloppementaux et aux prélèvements sanguins. Enfin pour l’ensemble des animaux, à la fin de l’étude, la plupart des organes seront disséqués et collectés (congélation, inclusion en paraffine) afin de pouvoir réaliser a posteriori des analyses moléculaires et anatomo-pathologiques.
Raffinement
Une surveillance quotidienne sera effectuée par l'expérimentateur et/ou le personnel de l'animalerie afin d'identifier tout signe de souffrance ou de stress chez les animaux, ce qui permettra une intervention rapide si nécessaire. Si un animal présente une douleur excessive, une apparence anormale, des comportements répétitifs ou inhabituels, des mesures seront prises par le personnel avec la supervision d’un vétérinaire pour soulager l’animal jusqu’à un retour à la normale. Si un retour à la normale n’est pas possible, l’animal sera euthanasié par le personnel de l'animalerie. D'après les résultats préliminaires obtenus chez la souris et les caractéristiques observées chez les patients, les animaux pourraient montrer des défauts de croissance et des difficultés à s'alimenter. Si ces problèmes deviennent trop sévères, des mesures seront prises pour compléter leur nourriture, et l'étude de la croissance se concentrera principalement sur le développement embryonnaire. Les animaux seront logés par groupes de quatre au maximum par cage, conformément à la réglementation en vigueur. Les cages comprendront des éléments d'enrichissement, tels que des tubes et du matériel de nidification, pour améliorer le bien-être des animaux. En nous basant sur les résultats d’une analyse préliminaire, nous avons optimisé les croisements prévus dans cette étude afin d’une part d’éviter la mort embryonnaire associée à certains animaux mutants (qui ne seront pas produits dans nos croisements) et d’autre part de générer les animaux utiles, contrôles et mutants, à partir des mêmes portées.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est motivé par la conservation des mécanismes d’empreinte parentale entre la souris et l’homme. Ainsi il sera possible d’évaluer la contribution de la région d’empreinte ciblée à une pathologie humaine rare liée à l’empreinte parentale, le MBCS. De plus, le modèle de souris génétiquement modifiées, présentant une inactivation du gène d'intérêt, est disponible (puisque générée par l’IMPC) et des données pilotes de tests phenotypiques sont disponibles. Enfin, il existe de nombreux outils chez cette espèce rendant les analyses plus faciles. Pour la caractérisation du phénotype après la naissance, les animaux seront étudiés à partir de 2 semaines (jeune non sevré) jusqu’à l’âge adulte (15 semaines pour la croissance et entre 4 et 15 semaines pour les tests comportementaux). Pour les études embryonnaires, les animaux seront étudiés à 18.5 jours après la fécondation.
Prélèvement invasif de tissu pour la caractérisation de lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des pathologies osseuses
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création et le maintien de lignées de souris génétiquement modifiées permettant l’étude des mécanismes impliqués dans la formation de l'os dans un contexte physiologique mais aussi pathologique. Cette demande de projet concerne strictement l’élevage, le marquage et l’analyse des gènes de ces animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de générer et de maintenir des modèles de souris permettant l’étude des mécanismes impliqués dans les maladies osseuses afin d'envisager des approches thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes permettra d’améliorer les traitements à destination des patients atteints de ces maladies.
Procédures
Prélèvement de tissu à l'oreille sur animal vigile (1 fois, 5 secondes); tatouage sur les coussinets (1 fois, 5 secondes); coupe de dents pour les animaux présentant une mâchoire inférieure trop avancée (maximum 2 fois par semaine, 15 secondes); application d'une solution de désinfection et de pommade anti-septique si une infection est constatée à l'endroit de la biopsie (1 fois par jour, maximum 3 jours de suite).
Impact sur les animaux
La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress léger chez l’animal. La coupe des dents due au phénotype dommageable (mâchoire inférieure trop avancée) provoque une douleur et un stress de courte durée.
Devenir
A l’issue de la procédure d’élevage, les animaux trop âgés pour se reproduire ou stériles sont mis à mort, ou si leur génotype n’est pas celui attendu.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant, car le squelette entier à différents âges est étudié. Il s’agit ici d’études sur la formation et la croissance osseuse, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle hors du vivant, ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien les projets de recherche. Les modèles souris miment de nombreuses pathologies et sont impliqués dans de différents projets.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi adapté. Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Des points limites spécifiques ont été établis. Tout animal en souffrance recevra un soin adapté (compression, application de pommade anti-septique). Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du squelette, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux de son développement du squelette entre les rongeurs et l’Homme. De plus, de nombreux outils d'analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Afin de permettre l’identification des souris et l’analyse de leurs gènes avant leur sevrage, le tatouage des coussinets et le prélèvement d'oreille sont effectués entre 7 et 10 jours de vie.
Restauration d’une ovogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Objectifs
La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.
Procédures
Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.
Raffinement
Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.
Etude chez la souris du rôle pubertaire des neurones glutamatergiques et gabaergiques exprimant l’estradiol dans l’organisation et la plasticité des régions hypothalamiques contrôlant la fonction de reproduction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Objectifs
L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Une partie des souris mâles et femelles subira une chirurgie au niveau du cerveau sous anesthésie générale et avec une analgésie pré et post-opératoire. La chirurgie durera entre 30 et 45 minutes maximum. Un lot de souris femelles subira un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal. La chirurgie durera maximum 10 minutes sur animaux anesthésiés et recevant une analgésie pré et post-opératoire. Ces femelles subiront également 2 injections d’hormones avant les tests de comportement sexuels. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes maximum. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les chirurgies au niveau du cerveau des souris se feront sous anesthésie. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont une hypothermie, un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux ainsi qu’une perte de poids rapide. Les injections d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’hébergement individuel des mâles avant les tests de comportements. L’anesthésie effectuée pour les ovariectomies est également associée à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiées afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses histologiques et fonctionnelles. Une faible partie des animaux seront euthanasiés sans prélèvement à la fin des expériences de comportement car ces souris femelles ne peuvent être réutilisées au-delà de la période de validité des implants délivrant des hormones pour étudier le comportement sexuel des mâles.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisé est de 2916, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, nous déterminerons avec une première cohorte d’animaux les meilleures conditions d’injection des vecteurs viraux. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste grâce à un calcul de puissance. Des analyses statistiques seront effectuées afin de réaliser une interprétation fiable des résultats. Afin de réduire le nombre d'animaux, les organes non utilisés dans ce projet (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement. Par ailleurs, les résultats obtenus au fil de la réalisation de ce projet nous permettront d’affiner nos besoins et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En effet, nous envisageons de sélectionner les conditions induisant une perturbation du comportement sexuel à l’âge adulte, lors des premières expérimentations, afin de conserver uniquement celles-ci dans les expérimentations suivantes. Le nombre d’animaux indiqué dans cette demande correspond donc au nombre maximal d’animaux pouvant être utilisés dans cette étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement en post-opératoire, puis hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. La douleur post-opératoire sera prise en charge par injection d’un analgésique durant les 3 jours suivant les chirurgies. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisées. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées à différents âges prépubertaires et pubertaires. Ce projet vise à étudier la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes d’action de l’estradiol lors du développement pubertaire.
Étude de l’inflammation dans la cardiomyopathie dilatée MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Objectifs
Plusieurs études visant à augmenter ou diminuer l’inflammation cardiaque in vivo par des approches génétiques et pharmacologiques ont établi une relation entre l’inflammation et la fonction cardiaque. Cependant, aucune étude à partir de modèles animaux directement visant l’importance l’inflammation dans le développement de la pathologie d’intérêt. Nous proposons d’évaluer directement d’un certain processus inflammatoire dans le développement de la pathologie.
Bénéfices attendus
À terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de l’inflammation pour la fonction cardiaque. Ils pourraient permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant l’inflammation, ce qui permettrait de prévenir ou de freiner le développement des maladies chez les patients.
Procédures
Cette procédure sera réalisée à 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, et 42 semaines de vie selon des 300 souris : La souris sera échographiée (10-20 minutes) sous anesthésie générale gazeuse. La souris sera épilée sur la zone d’échographie avec une crème dépilatoire appliquée pendant 2 minutes. Une sonde rectale sera insérée pour mesurer la température corporelle. A chaque séance d’échographie, un prélèvement sanguin de 100 μl sera effectué (quelques secondes).
Impact sur les animaux
L’échographie cardiaque nécessite une anesthésie gazeuse, durant laquelle un prélèvement sanguin de petit volume ne requiert aucune contention supplémentaire pour l’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux ne sont pas susceptibles d’éprouver de douleur. L’invalidation du gène d’intérêt entraine une pathologie, qui peut être suivi par échographie cardiaque. L'étude de la lignée murine réalisée précédemment permet d'observer que ces animaux présentaient une espérance de vie ne dépassant pas 12 mois. De plus, une prise de poids diminuée par rapport aux souris contrôles est observée une ou deux semaines avant la mort. Les signes cliniques apparaissent au stade final, ce qui commence avec une perte de poids entre 5% à 10% et peut impliquer une perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation de la procédure (la mise à mort précède les prélèvements d’organes et cellules, et dans les autres cas les animaux génétiquement modifiés ne peuvent pas être réutilisés ou replacés).
Remplacement
La formation et la fonction du cœur impliquent une multitude de réponses et d’interactions cellulaires entre certaines cellules et leur environnement, au sein d’une structure complexe. L’environnement, ou niche, est composé de multiples facteurs. Les cultures in vitro ne peuvent pas reproduire toute la complexité de ces interactions. Néanmoins, l’approche in vitro pour les analyses moléculaires sera privilégiée chaque fois que cela sera possible, afin de limiter le recours à l’animal, en utilisant des lignées cellulaires ou des cellules primaires amplifiées in vitro.
Réduction
Des calculs statistiques de l'effectif nécessaire pour un test de comparaison de deux échantillons indépendants ont été réalisés avec l’aide de biostatisticiens. Nous prévoyons pour ce projet un total de 300 souris. Les animaux seront ensuite utilisés pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes mitochondriale et cardiologique. Les études pilotes ont déjà été menées, permettant de réduire le nombre d’animaux en ciblant 3 phases distinctes détaillées ci-dessous. 2 types de tests statistiques sont envisagés pour comparer les résultats. L’effet des âge, sexe, date de la mise à mort, cage et nombre de souris dans la cage sera mesuré à l’aide de modèles statistiques pour vérifier qu’elles n’ont pas influé sur les résultats des expériences.
Raffinement
Dans un but de raffinement, l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée (en lien avec le phénotype attendu) permettant un suivi optimal des animaux sera mise en place. Les animaux seront évalués hebdomadairement, ce qui permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Pour ce qui est la gestion de la douleur, nous effectuons un suivi rigoureux et régulier et utilisation d’analgésique le cas échéant. De plus, toutes les procédures potentiellement invasives ou générant un inconfort significatif, telles que les échographies cardiaques, seront réalisées sous anesthésie appropriée afin de minimiser le stress et la douleur des animaux. Puisque les souris porteuses de la mutation d’intérêt manifestent la pathologie étudiée, nous suivrons la fonction cardiaque par échographie durant la durée de vie de l’adulte, ce qui permet d’anticiper l’apparences des nuisances sur le bien-être des animaux. La pathologie étant associée à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue sera effectuée, de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Si, lors de cette surveillance quotidienne, un stress est observé, un enrichissement de la cage sera réalisé et une surveillance accrue sera effectuée.
Choix des espèces
La conservation élevée des mécanismes physiopathologiques entre l'humain et la souris a été largement documentée par de nombreuses études. En particulier, le modèle murin s’est révélé essentiel pour l’étude des pathologies cardiaques. Dans la continuité de cette approche, nous poursuivons notre étude sur une souris transgénique qui a permis de mettre en évidence l'impact d’une altération d’un certain mécanisme sur la fonction cardiaque. L’utilisation de la souris reste donc le choix le plus pertinent pour approfondir l’étude de ce processus in vivo. De plus, ce modèle permet une transposition rigoureuse des connaissances issues de la littérature à nos propres investigations expérimentales. Enfin, nous disposons de nombreux outils génétiques et analytiques spécifiquement adaptés à l’étude de la souris, facilitant ainsi l’exploration mécanistique et fonctionnelle. Pour les études cardiaques, les souris seront suivies par analyse de la fonction cardiaque à partir de 14 semaines (jusqu'à 42 semaines) car la délétion du gène d’intérêt est complète dès la naissance. Les suivis longitudinaux par échocardiographies représentent les fréquences idéales pour observer une défaillance de fonction cardiaque dans ce modèle de pathologie chez la souris.