Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées :
- 235 projets autorisés en avril 2026 (01/05/2026)
- 296 projets autorisés en mai 2026 (01/06/2026)
Etude chez la souris du rôle d’anticorps associés à une maladie auto-immune dans le développement de fibrose pulmonaire, un durcissement anormal du tissu altérant la fonction respiratoire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Objectifs
Chez certaines personnes ayant des prédispositions génétiques et sous l’influence de facteurs environnementaux (exposition à la fumée de tabac), le système immunitaire produit des anticorps anormaux qui vont attaquer leur propre organisme, et provoquer une maladie auto-immune. On parle alors d’auto-anticorps. C’est le cas de la polyarthrite rhumatoïde, une maladie auto-immune se traduisant par une inflammation articulaire au premier plan. Le projet vise à déterminer si ces auto-anticorps favorisent la formation de cicatrices dans les poumons (fibrose). La fibrose rend les poumons moins souples, gêne la respiration et peut conduire à une insuffisance respiratoire possiblement mortelle. Les traitements disponibles aujourd’hui peuvent ralentir l’évolution de la maladie mais ne la guérissent pas. Pour répondre à cette question, nous utiliserons un modèle chez la souris qui reproduit la fibrose pulmonaire et nous étudierons si des auto-anticorps isolés à partir de patients atteints de cette maladie auto-immune aggravent cette fibrose. Les résultats pourraient améliorer la compréhension de la fibrose associée aux maladies auto-immunes et ouvrir des pistes pour de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Les mécanismes à l’origine de la fibrose pulmonaire au cours de maladies auto-immunes demeurent encore mal compris à l’heure actuelle. Nous pensons que certains auto- anticorps favorisent la fibrose pulmonaire dans une maladie auto-immune appelée polyarthrite rhumatoïde. Comprendre leur rôle pourrait ouvrir la voie à des prises en charge plus ciblées. La prise en charge des patients présentant cette atteinte potentiellement mortelle constitue un enjeu majeur compte-tenu de sa sévérité.
Procédures
Entre 5 et 10 jours de vie, un prélèvement de tissu sera effectué sur animaux vigiles de certaines lignées génétiquement modifiées, afin de réaliser le génotypage (APAFIS #51323). A J0 de la procédure aura lieu l’induction de la fibrose (ou contrôle) sous anesthésie générale, par injection unique intratrachéale d’un produit déclenchant une fibrose pulmonaire ou d’une solution saline (contrôle). L’injection se fait au niveau de la face antérieure de la trachée après une mini- incision cutanée puis suture. La durée prévisible de cette procédure de l’incision à la suture est de 5–7 min. Une analgésie pré- et post-opératoire sera effectuée. De J-1 à J10 seront administrés les auto-anticorps, sur des animaux sédatés par un gaz anesthésiant par voie endotrachéale toutes les 48 h (7–8 séances sur 11 jours). Cette procédure ne nécessite pas de dissection et consiste en l'injection du produit après introduction d'un cathéter, par la bouche, dans la trachée de l'animal. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. A J7, un prélèvement sanguin unique sera réalisé au niveau de la joue sur des sur animaux non sédatés. La durée de cette procédure est de 25 secondes. A J7, J10 et J13, environ la moitié des animaux recevront une injection intra-péritonéale (réalisée dans la cavité abdominale au niveau du quadrant inférieur droit ou gauche) d’une substance activant ou inhibant certaines cellules immunitaires. Ces injections dureront moins de 10 secondes. L’étude prendra fin à J7 ou à J14 : les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale et les tissus seront recueillis.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées au génotypage sont décrites dans le projet APAFIS # 51323. Au cours de la procédure, la manipulation répétée des souris pour les différentes administrations de substances peut être source de stress. Les nuisances attendues lors des différentes administrations de substances dépendront du type et de la voie d’administration employés. Les injections intra-péritonéales peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’injection de substances dans la trachée par voie chirurgicale comporte un risque de douleur et d'irritation au niveau de la cicatrice durant 48 heures suivant l’incision et constitue un point de surveillance en post-opératoire. Les injections dans la trachée par voie chirurgicale ou par voie buccale peuvent induire une baisse transitoire de l’oxygénation et nécessite une surveillance du rythme respiratoire et de la couleur des muqueuses. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après l’induction. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général inférieure à 20% des effectifs.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à J7 ou à J14 de l’injection de la substance induisant la fibrose sous anesthésie générale, selon une méthode réglementaire. Les prélèvements pulmonaires et sanguins seront réalisés pour quantifier la fibrose et analyser les cellules immunitaires.
Remplacement
Avant toute expérimentation animale, nous utilisons des méthodes alternatives : cultures de cellules pulmonaires humaines et modèles 3D de sphéroïdes (structures en forme de sphère constituées de cellules pulmonaires humaines cultivées en trois dimensions). Ces approches permettent de tester nos hypothèses et d’optimiser en amont le protocole expérimental appliqué aux souris, limitant ainsi le recours aux animaux. Toutefois, elles ne reproduisent pas : (1) la complexité du développement de la fibrose dans un organe entier, (2) l’intégration du système immunitaire dans sa globalité, (3) le recrutement progressif et la migration de cellules vers le poumon via la circulation sanguine. À ce jour, il n’existe pas d’alternative par expérimentation en laboratoire ou par modélisation virtuelle capable de modéliser fidèlement ces aspects ; l’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal qui permet de tester nos hypothèses en s’affranchissant de résultats biaisés par le hasard ou un échantillon de taille insuffisante. De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules et tissus d’intérêt maintenus viables en dehors de l’organisme.
Raffinement
Nous appliquons le raffinement afin de limiter au maximum les contraintes et les possibles douleurs générées. Les méthodes de raffinement liées à la procédure de génotypage sont prises en charge dans le projet APAFIS # 51323. Toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Les souris sont maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales ; aucun animal ne sera isolé. Les instillations intratrachéales de la molécule induisant la fibrose ou de solution saline sont effectuées sous anesthésie générale, avec antalgie pré- et post-opératoire. Un enrichissement est fourni (coton de nidification, petit tunnel) ainsi qu’une alimentation gélifiée facile à ingérer en cas de difficulté de prise alimentaire ; l’eau et la nourriture sont disponibles à volonté. En plus de la surveillance quotidienne par le personnel animalier, une surveillance clinique est assurée par l’expérimentateur après le réveil puis au moins trois fois par semaine jusqu’à l’euthanasie selon une grille de points limites évaluant l’apparence, le comportement, la perte de poids et l’état de la suture. La fréquence de suivi sera augmentée si nécessaire. Tout animal atteignant un point limite sera euthanasié sans délai.
Choix des espèces
D’une part, les modèles de fibrose pulmonaire chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit à de nombreuses découvertes dans le domaine des traitements modulant le système immunitaire et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les processus immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 24 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Stratégies pour reproduire chez la souris la disparité interindividuelle constatée chez l’humain quant à la capacité du microbiote intestinal à métaboliser certains phytoœstrogènes
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle préclinique reproduisant la disparité interindividuelle qui existe chez les humains quant à la capacité de leur microbiote intestinal à convertir certains composés végétaux – les isoflavones (IFs) qui constituent un sous-groupe des phytooestrogènes- en métabolites capables de mimer l’activité des oestrogènes. Chez l’être humain, cette disparité interindividuelle est supposée être à l’origine des susceptibilités variables vis-à-vis des pathologies hormono-sensibles (ex cancers du sein, de la prostate…). Or chez les rongeurs, par ailleurs cruciaux pour l’étude de ces telles pathologies, cette disparité n’est pas observée entre les individus appartenant à une même souche génétique mais elle a été constatée entre individus de souches différentes ou issus d’élevages différents. Les expérimentations menées dans ce projet auront donc 3 objectifs, chacun donnant lieu à une procédure. Il s’agit de : 1) sélectionner des souris de souches différentes ou issues d’élevages différents dont les microbiotes intestinaux présentent effectivement des capacités différentes à convertir les IFs (procédure 1); puis 2) en tirant parti de l'influence prouvée de la souris allaitante sur l'assemblage du microbiote intestinal de sa progéniture, vérifier que ces différences sont transmises durablement par adoption dès la naissance (procédure 2) ; et enfin, dans le scenario où les adoptions se révèleraient inefficaces, 3) tester si les différences peuvent être induites par l’administration orale précoce de souches bactériennes capables ou non de dégrader les IFs (procédure 3).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d’un modèle de souris plus représentatif de la physiopathologie humaine qui reproduira la disparité des capacités des microbiotes intestinaux individuels à convertir les IFs en molécules dotées d’activités biologiques mimant celles des œstrogènes. Un tel modèle constituera une avancée notable pour étudier le rôle de l’alimentation, en particulier végétale, dans les situations de perturbation endocrinienne et de cancers hormonodépendants et améliorer les stratégies de leur prévention primaire et secondaire.
Procédures
Les 72 souris femelles utilisées à l’âge adulte dans le cadre de la procédure 1 seront soumises à un suivi de poids vif, un test nutritionnel et, en une unique occasion, à un prélèvement sanguin sur animal vigile (
Impact sur les animaux
Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par les procédures consisteront en : - du stress induit par les adoptions (procédure 2), l’ajustement des portées et les suivis de croissance (procédures 2 & 3) ; - des contentions (> 2min) appliquées lors des prélèvements sanguins qui seront effectués sur les femelles adultes vigiles (procédure 1) et lors des biberonnages (procédure 3).
Devenir
La mise à mort des femelles incluses dans la procédure 1 et des descendants inclus dans les procédures 2 & 3 est rendue nécessaire par le besoin d’accéder aux contenus intestinaux (grêle et caeco-côlon). Les mères génitrices ou allaitantes utilisées dans les procédures 2 et 3 et non acceptées pour recyclage par les autres personnels seront également mises à mort puisque l’étude porte uniquement sur les descendants.
Remplacement
La nature des métabolites produits par le microbiote intestinal à partir des isoflavones (IFs) est la résultante entre le devenir digestif de ces IFs, déterminé en partie par la physiologie intestinale de l’animal étudié et les potentialités métaboliques du microbiote, déterminé par la nature des espèces bactériennes qui le composent, leurs interactions et les conditions physicochimiques intestinales qui régulent son activité. En conséquence, seule l’étude in vivo, qui rend pleinement compte des processus digestifs et absorptifs d’une part et de la physiologie des écosystèmes microbiens d’autre part, permet de mesurer la capacité du microbiote à métaboliser les IFs de façon pertinente.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en tenant compte du principe de réduction ainsi que des nombres d’individus nécessaires à l’obtention d’une conclusion significative, des risques de gestation non confirmée ou de taille de portée insuffisante. Les nombres d’individus nécessaires ont été déterminés par calcul statistique d’effectif à partir de concentrations plasmatiques en métabolites bactériens produits à partir des IFs, mesurées chez des souris placées en conditions favorisant ou non ce métabolisme. La procédure 1 repose sur le traitement de souris adultes, chacune constituant un individu statistique indépendant. De ce fait, 9 souris de chacun des 5 types (souche X élevage) seront commandées afin de permettre la comparaison entre chaque type. La procédure 2 repose sur le transfert de microbiotes depuis des mères allaitantes vers des souriceaux adoptés, l’individu statistique indépendant correspond donc à la portée. Ainsi, 20 souris saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 18 mères allaitantes à chacune desquelles seront confiés des portées issues de 18 femelles de fond génétique approprié. Ce nombre sera réduit de 10 dans le cas où les souris de fond génétique approprié constitueraient l’un des 2 types de souris sélectionnés à l'issue de la procédure 1. Les 108 (54 mâles + 54 femelles) souriceaux conservés à la mise-bas permettront d’inclure 2 stades de développement dans notre étude pour établir la durabilité des modifications du microbiote tout en limitant les biais éventuels (effets « portée » et « cage ») et en évitant l’isolement des animaux. La procédure 3 est basée sur l’administration à des souriceaux de suspensions bactériennes destinées à modifier durablement l’assemblage néonatal de leur microbiote intestinal.. Du fait de la période d’intervention, l’individu statistique indépendant correspond à la portée. Ainsi, 20 souris de fond génétique approprié, saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 18 mères allaitantes dont les portées auront été ajustées à 6 souriceaux. Les 108 souriceaux seront utilisés de la même façon que lors de la procédure 2. Avant leur mise à mort, les animaux devenus inutiles seront proposés pour d’éventuels projets ancillaires et un appel à mutualisation sera effectué en amont des dissections post-mortem, afin de valoriser les organes non utilisés dans ce projet.
Raffinement
Le stress généré par chacune des procédures sera limité du fait de leur mise en œuvre par un personnel compétent et entraîné, dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale. En outre, l’enrichissement des cages à l’aide de frisottis pour le nid et de tunnels et le co-hébergement pendant les périodes hors reproduction contribueront à minimiser le stress des mères et des souriceaux. Pour faciliter les adoptions programmées dans le cadre de la procédure 2, les souriceaux seront délicatement frottés avec la litière souillée des mères adoptives lors de la constitution des portées. Pour atténuer le stress lié aux « biberonnages », les portées seront maintenues sur tapis chauffants pendant leur réalisation. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris le week-end. L’évaluation de l’état des animaux sera alors effectuée en référence à une liste d’indicateurs adaptés à chaque stade de développement. Elle conditionnera les éventuelles décisions d’actions palliatives ou suppressives (administration d’analgésique, arrêt des supplémentations, voire décision d’euthanasie).
Choix des espèces
Le choix de la souris trouve son origine à la fois dans l’utilisation validée de ce modèle animal dans les études portant sur les pathologies hormonodépendantes (en particulier les cancers) et dans le fait que les disparités inter-souches quant à l’activité du microbiote intestinal aient été décrites pour cet animal. Ce modèle présente en outre l’intérêt d’héberger un microbiote intestinal qui s’établit au cours des premières semaines de vie. L’utilisation de souriceaux allaités dans 2 des 3 procédures permet donc de maximiser nos chances de moduler le microbiote intestinal qui s'assemble à cet âge. Enfin, nos travaux antérieurs ont permis aux personnels impliqués dans ce projet d’acquérir une bonne maitrise de ce modèle.
Etude de la réponse immunitaire aux espèces bactériennes associées aux formes sévère de l’hidradénite supppurative
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
Objectifs
La maladie de Verneuil, ou hidradénite suppurée (HS), est une dermatose inflammatoire chronique caractérisée par des lésions douloureuses dans les zones de plis. Sa physiopathologie, largement méconnue, implique une interaction complexe entre dérégulation des réponses immunes et déséquilibre du microbiote cutané, marqué par l’expansion de certaines bactéries. Aucun traitement curatif n’existe actuellement ; les prises en charge associent antibiothérapie prolongée, traitements immunomodulateurs et chirurgie, sans prévenir les rechutes. Nos travaux récents ont identifié une forte association entre les formes sévères de la maladie et la présence de la bactérie Porphyromonas uenonis (P. uenonis). Absente du microbiote cutané sain, cette bactérie est détectée dans les couches profondes de la peau lésionnelle et péri-lésionnelle des patients. Sa présence corrèle avec une accumulation épidermique marquée de cellules productrices d’anticorps, un phénomène inhabituel susceptible de contribuer à l’inflammation chronique. Des modèles ex vivo, combinant organoïdes et explants de peau humaine ont montré que P. uenonis est intrinsèquement invasive et capable de pénétrer et se multiplier dans des cellules cutanées humaines saines. Une étude pilote chez la souris a confirmé que le simple dépôt de la bactérie sur une peau intacte suffit à reproduire l’accumulation épidermique de plasmocytes, en l’absence de lésion, reproduisant ainsi un marqueur clé de la maladie humaine. Ces données suggèrent que P. uenonis est normalement contrôlée en conditions saines, mais possède des propriétés invasives et immunomodulatrices uniques favorisant le recrutement anormal de cellules sécrétrices d’anticorps dans la peau. P. uenonis apparaît comme un pathobionte cutané opportuniste susceptible d’initier et d’entretenir l’inflammation chronique de HS. Son isolement dans d’autres infections profondes renforce l’hypothèse d’un potentiel pathogène multi-tissulaire encore méconnu. Ce projet vise à exploiter un modèle murin afin de caractériser les mécanismes de pathogénicité cutanée de P. uenonis, la réponse immunitaire induite et l’impact de l’accumulation de plasmocytes sur la barrière cutanée. À terme, ce modèle permettra de mieux comprendre la contribution de cette bactérie à la pathogénèse de la maladie de Verneuil et de fournir à la communauté scientifique un outil préclinique pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin d’association bactérienne permettra de mieux comprendre le rôle pathogénique des bactéries associées à la maladie de Verneuil ainsi que le rôle pathogénique des réponses immunitaires mise en place. A moyen terme nous espérons que ce projet aboutira à l’établissement d’un modèle murin pour étudier la maladie de Verneuil pour laquelle il n’existe actuellement pas de modèle A long terme nous espérons que ce modèle permettra l’ouverture à de nouvelles pistes de traitement.
Procédures
-Application d’ une suspension bactérienne sur la peau du dos et de l’oreille sur souris vigiles : 1 fois par jour pendant 4 à 7 jours. -Desquamation des couches superficielles de l’épiderme sur la peau du dos ou de l’oreille sur animaux rasé, anesthésiés et analgésiés : 1 fois au cours de la procédure, avec 1 répétition possible après 14 jours. -Inflammation cutanée locale sur la peau du dos ou de l’oreille par application d’un produit 1 fois par jour pendant 3 à 7 jours sur animaux rasés et anesthésiés. -Pose d’un cathéter dans la veine caudale sur animaux anesthésiés, 1 fois au cours de la procédure.
Impact sur les animaux
Ce projet sera attentif aux cinq libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines des procédures pourraient avoir un effet indésirable sur l’animal. o Une inflammation cutanée chimique ou générée par desquamation mécanique sur une partie de la peau du dos et/ou sur la peau des oreilles entrainera un inconfort ou une douleur modérée pendant quelques jours. o Une infection locale liée à l’expansion de la bactérie pourra éventuellement induire une ulcération/ nécrose localement générant une douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous aurons besoin de collecter les organes pour étudier la réponse immunitaire et l’invasion bactérienne dans les tissus.
Remplacement
La bactérie étant associée à une pathologie cutanée humaine, la majorité de nos travaux repose sur des modèles de peau humaine, incluant des organoïdes d’épiderme établis au laboratoire, des explants de peau saine et des prélèvements issus de patients. Il reste toutefois impossible de reconstituer in vitro la complexité du système cutané avec sa vascularisation et ses interactions avec le système immunitaire. Notre modèle murin d’association constitue donc, à ce jour, le seul système capable de reproduire un tel niveau d’intégration, en faisant un modèle de choix pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos collaborateurs sur la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (4) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs (ANOVA). On choisit le cas d’une comparaison de 2 moyennes avec les conditions d’association avec une bactérie pathogène versus une bactérie commensale contrôle, en l’absence d’effet sexe. On décide d’utiliser 32 individus par groupe, répartis en 4x2 cages par groupe (4 individus par cage, 1 cage par sexe, 4 répétitions). En supposant un effet cage de 50.00%, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d’effets forts à très forts. Un calcul de puissance a été réalisé pour chaque procédure de la même façon. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Nous proposons aussi de réduire le nombre d’animaux utilisé si les différences à différent temps ou entre les sexes n’est pas importante. D’autre part, les techniques expérimentales nous permettent d’analyser plusieurs paramètres sur un même individu, pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Notamment l’imagerie intravitale nous permettra de collecter un grand nombre d’information sur une fenêtre de temps de quelques heures, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Optimisation du protocole d’association avec la bactérie : Le protocole d’association avec la bactérie est sans douleur, cependant nous utiliserons des conditions expérimentales pour optimiser l’invasion de la bactérie. Parmi ces conditions, l’induction d’une inflammation sur la peau des animaux par application d’une crème sur la peau, la desquamation des couches superficielles de la peau par application d’un scotch ou un régime alimentaire spécifique. Les animaux recevront un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de la dequamation. Les animaux seront surveillés quotidiennement dès l’apparition des premiers signes d’inflammation (rougeurs, squames) et pour l’apparition de lésions cutanées. En cas de signes de mal-être (prostration, poil ébouriffé), la surveillance sera intensifiée et un enrichissement de la cage avec du gel nutritif sera réalisé. La litière sera remplacée par une litière douce en cellulose dès l’apparition de lésions cutanées et la douleur pourra être prise en charge par administration d’analgésique. Imagerie intravitale : Lors des expériences d’exploration par microscopie, les animaux seront maintenus au chaud et hydratés par une injection tout au long de la procédure.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système cutané, vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système cutané, vasculaire et immunitaire humain. De plus, la souris est un animal pour lequel nous avons une très bonne expertise pour détecter et réduire au mieux les conditions de stress, d’inconfort et de douleur. En conséquence la souris représente l’espèce de choix pour cette étude où les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. Plusieurs types de souris seront utilisées dans cette étude. Des souris de type sauvage (C57Bl/6Jrj) et des souris génétiquement modifiées ‘modifications permettant d’explorer plusieurs composants du système immunitaire). Les associations avec les bactéries sont réalisées chez des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines, afin d’étudier un système immunitaire mature et proche de la réponse immunitaire humaine. Les expérimentations sont ensuite réalisées 1 à 12 semaines après l’association, période nécessaire au développement et au maintien de la réponse immunitaire.
Étude de la numération formule sanguine et des paramètres biochimiques plasmatiques chez la souris dans le cadre de travaux pratiques de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la formation universitaire d’étudiants en biologie et en sciences de la santé. Son objectif est d’aider les étudiants à mieux comprendre le fonctionnement du sang à l’aide d’un modèle animal couramment utilisé en recherche scientifique : la souris. Lors de ces travaux pratiques, les étudiants apprennent à observer et analyser les différents composants du sang. Ils réalisent notamment des frottis sanguins afin d’identifier les différentes cellules sanguines, étudient la résistance des globules rouges dans différentes conditions, et effectuent des comptages de cellules sanguines telles que les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. Les étudiants analysent également certains paramètres biochimiques du plasma sanguin, comme le taux de sucre et de lipides (cholestérol et triglycérides), afin de mieux comprendre l’équilibre physiologique de l’organisme. Ces activités permettent d’acquérir des compétences pratiques essentielles en hématologie et en biochimie, tout en développant une meilleure compréhension du fonctionnement du sang. Elles sont réalisées dans le respect strict des règles éthiques, du bien-être animal et des bonnes pratiques de laboratoire.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un intérêt essentiellement pédagogique et scientifique. Il permettra aux étudiants de niveaux L2 et L3 d’acquérir des compétences pratiques indispensables en physiologie, hématologie et biochimie, à travers la manipulation d’un modèle animal murin largement utilisé en recherche biomédicale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure unique, terminale et non chirurgicale. Chaque souris sera placée sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, puis un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé. Ce prélèvement sera effectué une seule fois par animal, avant la mise à mort, afin de permettre l’analyse des paramètres hématologiques et biochimiques. Après le prélèvement, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie, puis les organes d’intérêt (foie, pancréas, tissus adipeux, rate, cerveau) seront prélevés. La durée totale de la procédure par animal est estimée à 5 à 10 minutes, incluant l’induction anesthésique, le prélèvement sanguin et l’euthanasie. Aucune intervention sur animal vigile ni procédure chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Ces procédures sont classées comme légèrement à modérément invasives, mais entièrement justifiées par les objectifs pédagogiques et menées dans le respect strict des principes des 3R
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus chez les animaux sont limités et de faible intensité, compte tenu de la nature strictement terminale des procédures. Les principales contraintes pour les animaux sont : • Mise à jeun de 6 heures, pouvant entraîner un inconfort transitoire (sensation de faim), sans impact significatif sur l’état de santé des animaux. • Anesthésie par isoflurane, susceptible d’induire un stress léger et transitoire lors de l’induction, rapidement supprimé par l’effet anesthésique. • Prélèvement sanguin par ponction cardiaque, réalisé sous anesthésie profonde, ne provoquant pas de douleur perçue par l’animal. • Euthanasie par dislocation cervicale, effectuée immédiatement après le prélèvement sanguin sur les animaux profondément anesthésiés Aucune douleur prolongée, souffrance chronique ou atteinte durable du bien-être animal n’est attendue, les animaux étant maintenus sous anesthésie jusqu’à l’euthanasie.
Devenir
Le prélèvement sanguin unique réalisé en fin de procédure est incompatible avec la survie des souris. En conséquence, les animaux ne peuvent être maintenus en vie à l’issue de la procédure. Ainsi, toutes les souris seront mises à mort immédiatement après ce prélèvement sanguin.
Remplacement
Le remplacement complet de l’utilisation d’animaux vivants n’est pas possible dans ce projet, car les objectifs pédagogiques nécessitent l’étude de paramètres physiologiques sanguins et biologiques dans un organisme entier, incluant les interactions entre les différents organes et systèmes. Cependant, le recours à l’animal est limité au strict nécessaire et justifié par l’impossibilité de reproduire fidèlement ces phénomènes par des modèles in vitro, des simulations numériques ou des supports pédagogiques virtuels. Lorsque cela est possible, des supports alternatifs (cours théoriques, vidéos pédagogiques, données expérimentales préexistantes) sont utilisés en amont afin de réduire le nombre d’animaux manipulés et de préparer les étudiants aux expérimentations.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs pédagogiques du projet. Environ 300 étudiants sont concernés. Chaque étudiant nécessite 170 µL de sang ; toutefois, afin de réduire le nombre d’animaux, les manipulations seront mutualisées. Ainsi, au minimum quatre étudiants travailleront sur la thématique de la numération formule sanguine (NFS) à partir d’un même échantillon (besoin total de 680 µL), correspondant à une seule souris. Cette organisation permet d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire significativement le nombre total de souris nécessaires. Par ailleurs, les organes d’intérêt (foie, pancréas, tissus adipeux, rate et cerveau) seront prélevés après la mise à mort et utilisés à d’autres fins pédagogiques dans le cadre des travaux pratiques, contribuant ainsi à maximiser l’exploitation scientifique de chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Une anesthésie générale sera réalisée avant la mise à mort.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus), et plus particulièrement la souche C57BL/6J ou BALB/c, a été choisie pour sa forte pertinence scientifique et pédagogique. Des souris mâles et femelles seront utilisées, âgées de 4 à 20 semaines. L’âge et le sexe ne constituent pas des facteurs déterminants pour les objectifs pédagogiques du projet, qui portent principalement sur l’apprentissage des techniques de base en hématologie et en biochimie plasmatique. D’un point de vue scientifique, la souris est un modèle de référence en recherche biomédicale en raison de sa proximité physiologique avec l’humain, notamment pour l’étude des paramètres hématologiques et métaboliques. D’un point de vue technique, la large disponibilité des outils expérimentaux (anticorps, kits de dosage, réactifs), la standardisation des protocoles, ainsi que les coûts limités de maintenance, en font un modèle particulièrement adapté à un cadre d’enseignement universitaire.
Caractérisation des gènes du moustique hématophage, Anopheles, impliqués dans la réponse immune de l’insecte contre le parasite Plasmodium adapté au rongeur de laboratoire.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Objectifs
Des études antérieures ont permis d’identifier un gène associé à une résistance vis-à-vis du parasite Plasmodium responsable du paludisme. Des résultats préliminaires montrent que dans certains cas, le moustique utilise différentes formes de ce gène pour se protéger contre le parasite humain et contre le parasite de rongeur. Nous nous intéressons aux mécanismes sous-jacents à cette spécificité de la réponse immunitaire vis-à-vis d’un pathogène avec lequel le moustique a partagé une histoire évolutive ou avec un nouveau pathogène (qu’il n’aurait jamais rencontré) tels que les parasites de rongeurs. L’objectif de ce projet est d’identifier les gènes candidats et régulateurs potentiels présents de ce gène chez ce moustique qui concourent à ce statut réfractaire vis-à-vis de différents parasites. Plus précisément, 10 gènes candidats et 10 candidats « ARN non-codants » régulateurs seront testés. De plus, les moustiques sauvages devenant de plus en plus résistants aux insecticides, nous avons également généré une lignée de moustique résistante à la deltaméthrine (un insecticide très utilisé sur le terrain). Nous aborderons dans ce projet le rôle des 20 candidats dans un fond génétique de moustiques résistants à la deltaméthrine. Enfin, la flore bactérienne des moustiques jouant un rôle sur leur capacité à transmettre le parasite Plasmodium, nous évaluerons si les gènes protecteurs interagissent avec le microbiote bactérien. En effet en piquant un hôte mammifère traité aux antibiotiques, les moustiques seront à leur tour soumis à cet antibiotique susceptible de modifier l’ensemble de leur flore bactérienne. Ce dernier point permet d’aborder et de mimer, sur un modèle murin, l’impact de piqûres du moustique sur des individus traités aux antibiotiques (commune sur le terrain) sur la modulation de la compétence vectorielle des moustiques au parasite Plasmodium, ainsi que sur la réponse immunitaire de ces insectes vis-à-vis du parasite.
Bénéfices attendus
Les moustiques constituent les vecteurs les plus dangereux pour l'humanité, responsables de plus de 700 000 décès annuels selon l'OMS. Ce fardeau sanitaire s'aggrave avec le changement climatique qui favorise l'expansion de ces insectes vers des zones tempérées autrefois épargnées, où des cas autochtones de maladies tropicales émergent désormais. Parallèlement, l'efficacité des stratégies actuelles fondées sur les insecticides est gravement compromise par le développement de résistances généralisées chez les populations de vecteurs. Ce projet propose une approche fondamentale novatrice visant à identifier les composantes moléculaires et génétiques du système immunitaire des moustiques qui permettent à certains individus de bloquer naturellement le développement du parasite du paludisme. Cette compréhension permettra de concevoir des stratégies de lutte biologique consistant à renforcer ces mécanismes de défense naturels au sein des populations de vecteurs. Contrairement aux insecticides chimiques, ces approches cibleraient spécifiquement la capacité de transmission sans éliminer les insectes, préservant la biodiversité et limitant l'impact écologique. Les connaissances acquises sur les interactions complexes entre hôte, parasite et vecteur, nécessitant l'étude du cycle infectieux complet qui justifie ce recours indispensable et strictement limité à l'expérimentation animale, ouvriront la voie à des outils de contrôle génétique ou biologique durables et transférables à d'autres systèmes vectoriels (dengue, zika). Les bénéfices attendus sont majeurs pour la santé publique mondiale, particulièrement pour les populations vulnérables des régions tropicales, et permettront d'anticiper proactivement les risques sanitaires émergents sur le territoire européen.
Procédures
- Injection de parasites responsable du paludisme de rongeur durée quelques secondes (degré de gravité modérée) une fois dans la vie la souris - Injection pour anesthésie, durée de quelques secondes, une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Prélèvement sanguin, veine caudale, durée (moins d’une minute), une seule fois dans la vie de la souris, 4 jours après injection de parasites. - Nourrissage des insectes sur souris anesthésiées, durée : 30 minutes, une seule fois dans vie de la souris, 4 jours après injection de parasites.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent ressentir un stress temporaire lié à la manipulation (préhension) et aux injections et prélèvement nécessaires pour le projet. Une douleur légère et ponctuelle de courte durée peut survenir au moment de l’injection. L’injection de parasites entraîne une augmentation de la parasitémie dans le sang, ce qui peut provoquer un état de fatigue de courte durée (3 jours), une locomotion ralentie, une baisse de vivacité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, le nourrissage par les moustiques doit se faire à un niveau de parasites bien déterminé et à un âge de souris bien déterminée. En d’autres termes, nous ne pouvons pas utiliser des souris plus vieilles et chez lesquelles le niveau de parasites dans le sang serait certainement plus élevée ; cela influencerait le niveau et l’efficacité d’infection de nos moustiques.
Remplacement
Pour étudier l’infection des parasites Plasmodium (responsables du paludisme) chez les moustiques, nous avons exploré des méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, ces approches présentent des limites majeures pour notre projet. Une première méthode consiste à nourrir les moustiques sur une membrane artificielle chauffée à température corporelle (37°C), contenant du sang infecté. Malheureusement, cette technique ne permet pas aux moustiques de s’infecter de manière suffisamment efficace. Les résultats obtenus sont trop variables pour garantir une analyse fiable des effets étudiés, ce qui rend cette approche incompatible avec nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, notre question de recherche exige que les parasites soient transmis aux moustiques dans des conditions aussi proches que possible de leur cycle naturel. En effet, lors d’une infection naturelle, les parasites interagissent avec les composants du sang (comme les anticorps ou les facteurs immunitaires) et évoluent dans un environnement complexe, essentiel à leur développement. Une méthode artificielle ne peut pas reproduire ces interactions, ce qui risquerait de fausser nos observations. Nous avons également envisagé l’utilisation de cellules de moustiques en culture, mais cette solution n’est pas adaptée. Les stades infectieux du parasite ne peuvent pas se développer correctement dans ces cellules, et ce système ignore le rôle clé du microbiote intestinal du moustique, indispensable à la maturation du parasite. Sans ces éléments, les résultats ne refléteraient pas la réalité biologique de l’infection. Ainsi, pour répondre de manière rigoureuse à notre problématique, nous devons recourir à des souris préalablement infectées par Plasmodium. Ces modèles, bien que minimalistes, sont les plus petits mammifères permettant de reproduire fidèlement les mécanismes de l’infection humaine. Ils offrent un compromis éthique et scientifique optimal pour étudier les interactions entre le parasite, le vecteur et l’hôte, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet est strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Chaque expérience est conçue de manière à optimiser l’utilisation des animaux, avec une seule souris utilisée pour permettre l’infection d’un nombre élevé d’insectes, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Par ailleurs, le choix d’utiliser exclusivement des souris femelles permet de réduire la variabilité entre les individus. Les mâles présentent plus fréquemment des comportements agressifs pouvant entraîner du stress ou des blessures, susceptibles d’influencer les résultats expérimentaux. L’utilisation de femelles favorise ainsi des conditions plus homogènes et fiables, ce qui contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet, conformément au principe de réduction des 3R.
Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur et le stress des souris lors du nourrissage des insectes, les animaux sont placés sous anesthésie générale. Cette mesure empêche que les piqûres des insectes provoquent une souffrance. Les souris sont hébergées dans des conditions optimales à l’animalerie, avec un nombre de souris
Choix des espèces
Les expériences visant à suivre l’évolution de l’infection parasitaire (Plasmodium berghei ou Plasmodium yoelii) chez les insectes ont été développées et optimisées chez la souris. L’utilisation d’une autre espèce de rongeur nécessiterait de refaire entièrement ces travaux de mise au point, sans garantie de succès, ce qui rallongerait considérablement la durée des expériences et pourrait augmenter le nombre d’animaux utilisés. La souris est donc l’espèce la mieux adaptée pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le recours à des animaux supplémentaires. Ce stade a été sélectionné sur la base de données de validation expérimentale préalable établissant que la dose infectante de parasites et la cinétique d'évolution de la parasitémie sont caractérisées de manière optimale, et reproductibles chez des animaux de cet âge. L'utilisation de souris plus jeunes (stade juvénile, croissance en cours) ou plus âgées (adultes matures) présenterait une variabilité de la volémie et du poids corporel significative, rendant nécessaire une recalibration complète des quantités de parasites à administrer et une réévaluation de la cinétique de développement parasitaire propre à chaque classe d'âge. Cette standardisation à 4-5 semaines garantit la robustesse méthodologique et la reproductibilité des résultats tout en évitant la multiplication de séries expérimentales préliminaires, ce qui augmenterait le nombre total d'animaux utilisés, conformément au principe de réduction.
Différenciation cellulaire chez l’embryon précoce de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Objectifs
Notre recherche cherche à comprendre comment les toutes premières cellules d’un embryon de souris se transforment pour former différents types de cellules, juste après la fécondation, avant que l’embryon ne s’accroche à l’utérus. Au tout début du développement, les cellules de l’embryon commencent à se spécialiser pour former : 1) celles qui construiront le futur corps de l’animal, 2) celles qui formeront des tissus de soutien, 3) celles qui deviendront le futur placenta. Ces étapes se passent pendant les trois premiers jours chez la souris, ce qui correspond à environ six jours chez l’humain. Comprendre ce qui contrôle cette transformation est très important, car cela aide à mieux connaître les débuts de la vie, à améliorer la fécondation in vitro, et développer des traitements médicaux utilisant des cellules souches pour réparer des organes ou des tissus. Comme on ne peut pas encore reproduire ces étapes précoces du développement en laboratoire, l’étude sur la souris reste indispensable. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées : cela nous permet de tester le rôle de certains gènes en les supprimant ou en les activant, afin de voir comment cela influence la formation des premières cellules de l’embryon.
Bénéfices attendus
Ce projet se propose d'étudier des différenciations cellulaires présentes uniquement chez les mammifères. Ces analyses sont inédites et permettront à non seulement d'accroître nos connaissances en embryogénèse (à court terme) mais aussi d'apporter des améliorations de conditions de cultures (à long terme) lors de fécondations in vitro humaines ou cultures de cellules souches embryonnaires humaines au gros potentiel thérapeutique. A l'heure actuelle, il n'y a pas de solution de remplacement par des cultures cellulaires (malgré l'avènement des blastoïdes) sur les types/différenciations cellulaires que nous étudions.
Procédures
Pour toutes les procédures des injections seront pratiquées. Une seule procédure comprend un acte chirurgical, une ovariectomie, d'une durée de 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont de la douleur légère associée aux injections et potentiellement des douleurs modérées post-opératoires pour une des procédures.
Devenir
Pour toutes les procédures, les femelles seront mises à mort pour collecter les embryons. Les femelles non gestantes issues des expériences de superovulation seront remises avec le pool commun de femelles de même génotype et réaccouplées après un délai de 15 jours.
Remplacement
Pour certains projets se déroulant après l'implantation de l'embryon dans l'utérus, nous avons mis en place des modèles de différenciation cellulaire in vitro à base de cellules souches embryonnaires ES. Ceci réduit drastiquement le nombre de souris utilisées. Néanmoins, pour les projets portant sur des analyses avant l'implantation, l'utilisation de souris est indispensable car à ce jour aucun modèle cellulaire ne peut récapituler ces différenciations, même depuis l'avènement des embryons synthétiques produits à partir de cellules ES car nous étudions des différenciations cellulaires qui surviennent avant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utilisons des combinaisons génétiques qui permettent d'obtenir le génotype voulu avec une plus grande efficacité (systèmes inductibles).
Raffinement
Nous utilisons des animaux avec des systèmes inductibles pour réduire les contraintes. Ces modifications génétiques n'occasionnent aucun stress ni douleur. Les animaux seront observés quotidiennement afin de suivre leur état général (perte de poids, comportements anormaux) et seront mis à mort en cas de points limites atteints et après consultation de la SBEA ou une dose supplémentaire d'analgésique pourra être administrée dans le cas d'acte chirurgical. Dans le cas d'injections répétées, le côté de la piqûre sera alterné. Lors des ovariectomies, la souris sera traitée en amont avec un analgésique et elle sera placée sur un matelas chauffant lors de l'acte chirurgical
Choix des espèces
Nous travaillons sur les premières différenciations cellulaires chez les mammifères qui ne peuvent être effectuées dans des modèles d'autres classes de vertébrés. La souris est le choix idéal principalement pour les outils génétiques qui y ont été développés.
Différences de sensibilité rénale entre les différentes souches de souris de laboratoire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Objectifs
La souche B6 de souris noires a été développée dans les années 1950 au Jackson Laboratory, puis transférée au National Institutes of Health (NIH). Au fil du temps, une dérive génétique a conduit à la formation de deux sous-souches distinctes, les souris B6J et B6N. Une analyse génomique effectuée en 2013 a identifié plus de 34 mutations génétiques entre ces deux sous-souches. Certaines mutations spécifiques, notamment dans le gène Nlrp12, présentes uniquement chez les B6J, ont été associées à des différences phénotypiques significatives entre les deux sous-souches. Dans ce contexte, nos travaux récents ont mis en évidence une variation de sensibilité entre les B6J et les B6N au développement d’une dysfonction rénale aiguë suite à une atteinte rénale ischémique. Ainsi, les B6J développent des lésions rénales aiguës sévères avec un taux de mortalité accru après une ischémie-reperfusion rénale bilatérale, alors que les B6N semblent protégées. Ces observations suggèrent que des différences phénotypiques majeures existent dans la réponse au stress ischémique rénal entre les sous-souches de souris noires. D'après la littérature, une hypothèse génétique majeure peut être avancée pour expliquer les différences observées entre les souris B6J et B6N. Il a été démontré qu'une mutation du gène Nlrp12 chez les souris B6J altère le recrutement des neutrophiles dans les tissus inflammatoires. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail sera d’identifier si un défaut de recrutement des neutrophiles en lien avec la mutation de Nlrp12 peut être responsable de l'hypersensibilité rénale post-ischémique des souris B6J comparativement aux B6N.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des différences phénotypiques de lésions rénales entre les deux sous lignées les plus utilisées dans la littérature de souris noires. Ces deux sous lignées ont accumulé des variations génétiques influençant leur sensibilité aux atteintes rénales. Ces différences peuvent modifier de manière significative les résultats obtenus par la communauté scientifique dans les modèles d’atteinte rénale aiguë et chronique. Leur caractérisation contribuera à améliorer la reproductibilité expérimentale, à éviter les biais d’interprétation des modèles transgéniques et à renforcer la fiabilité ainsi que la pertinence translationnelle de la recherche préclinique en néphrologie.
Procédures
Chaque animal subira les interventions suivantes : A. Procédures chirurgicales ou prélèvement invasif sur animal anesthésié au nombre de quatre : 1. Modèle d'insuffisance rénale par ischémie rénale bilatérale (1 fois, durée : 30 min) 2. Mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) (3 fois max, durée : 2h) 3. Prélèvement de sang par la veine cave (1 fois, durée : 2 min). B. Procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Échographie rénale sur animal anesthésié (3 fois max, durée : 20 minutes) 2. Irradiation corporelle totale sur animal vigile (1 fois, durée : 15 min) 3. Greffe de cellules mononuclées de la moelle osseuse en rétro-orbitaire sur animal anesthésié (1 fois, 5 min) 4. Prélevement de sang à la queue sur animal vigile (1 fois, durée 5 min) 5. Gavage avec l'inhibiteur de MPO ou au solvant sur animal vigile (18 fois max à raison deux fois par jour; durée : 20 secondes) 6. Injection intrapéritonéale d'un anticorps neutralisant des neutrophiles ou d'un isotype contrôle (1 injection; durée : 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés à la contention/manipulation des animaux pouvant engendrer du stress ou ceux liés à la récupération post-irradiation ou post-chirurgie (modèle d’insuffisance rénale post-ischémique) ; pouvant conduire à une perte de poids dans les 24 premières heures (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite). De notre expérience, l'irradiation corporelle totale des souris est très bien tolérée une fois que la greffe des cellules médullaires d'une souris donneuse a été effectuée. L'ischémie rénale bilatérale peut conduire dans les trois premiers jours suivant l’opération à une atteinte rénale aiguë avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints (30%). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une ischémie rénale bilatérale, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l'hétérogénéité du recrutement des neutrophiles entre les deux sous souches de souris noires, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total des animaux par de la culture cellulaire n'est pas réaliste car les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre le système immunitaire et le rein in vivo. L'utilisation de modèles animaux pour étudier les variations de sensibilité rénale en lien avec le recrutement des neutrophiles reste nécessaire pour atteindre les objectifs de notre projet de recherche. Dans ce contexte, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies rénales humaines.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échographie rénale, mesure du débit de filtration glomérulaire) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses fonctionnelles, histologiques et moléculaires compte tenu de la variabilité interindividuelle et de la mortalité post-opératoire dans notre modèle chirurgical (ischémie rénale bilatérale).
Raffinement
Pour raffiner, les animaux importés de deux éleveurs différents pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. La souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées, placée sur plaque chauffante à 37°C pour éviter toute hypothermie et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Dans la semaine suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera renforcée avec un examen bi-quotidien par du personnel compétent afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
Dans cette étude, notre objectif est de comparer la sensibilité au stress rénal ischémique dans les deux sous souches de souris noires les plus couramment utilisées au laboratoire. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles rénales in vivo ainsi que ex vivo dans ce modèle de stress rénal aigü chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes de 7 à 10 semaines pour notre étude. A ce stade, le rein est parfaitement formé et nous possédons déjà tous les paramètres fonctionnels et structurels de ces deux organes pour l'ensemble des génotypes à tester. Nous n'utiliserons que les mâles dans cette étude car les femelles sont naturellement protégées de lésion rénale post-ischémique ne nous permettrant pas d'étudier les différences de sensibilité entre les deux sous-souches de souris noires.
Influence du microbiote intestinal postnatal précoce dans les réponses inflammatoires associées à une douleur cornéenne en lien avec la sécheresse oculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Objectifs
Après la naissance, le système immunitaire apprend progressivement à faire la différence entre ce qui est inoffensif et ce qui peut etre dangereux pour l’organisme. Cet apprentissage dépend en grande partie du microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des bactéries qui vivent naturellement dans l’intestin. Un moment clé de cette maturation est le sevrage, lorsque l’alimentation du nourrisson se diversifie. A cette période, le système immunitaire s’active afin de s’adapter aux nouvelles bactéries présentes dans l’intestin. Cette étape est essentielle pour installer une tolérance immunitaire, qui permet d’éviter des réactions excessives ou dirigées contre les propres tissus du corps. Si le microbiote est perturbé à ce moment critique, par exemple après la prise d’antibiotiques ou en cas de déséquilibre des bactéries intestinales, cet apprentissage peut être altéré. Le système immunitaire devient alors plus susceptible de réagir de manière inappropriée, augmentant le risque de maladies inflammatoires ou auto-immunes plus tard dans la vie. Des travaux récents ont également mis en évidence un lien étroit entre l’intestin, le cerveau et l’œil, appelé axe intestin cerveau œil. Une perturbation précoce du microbiote peut interférer avec le développement normal de la cornée, la surface transparente de l’œil, ainsi que de ses nerfs. Cela peut rendre l’œil plus vulnérable à l’inflammation, qui, lorsqu’elle devient chronique, peut entraîner des douleurs oculaires ou une sécheresse oculaire. Ce projet vise à comprendre comment un microbiote déséquilibré en début de vie perturbe le système immunitaire et favorise l’apparition de douleurs oculaires. A terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements permettant de mieux prévenir et soulager ces troubles, et d’améliorer la qualité de vie des personnes concernées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment le système immunitaire (les mécanismes de défense du corps) agit au niveau de la cornée, la surface transparente de l’œil. En identifiant précisément ces mécanismes, il permettra de mettre en évidence de nouvelles pistes pour développer des traitements plus efficaces. Le projet s’intéresse également au role du microbiote intestinal, l’ensemble des micro organismes vivant dans l’intestin, en particulier lorsqu’il est perturbé très tôt dans la vie. Ces perturbations précoces peuvent avoir des effets durables sur la santé, y compris en dehors de l’intestin. L’objectif est de comprendre comment elles influencent la santé de la surface de l’œil, favorisent l’inflammation et peuvent conduire à des douleurs cornéennes chroniques ou à une sécheresse oculaire. À plus long terme, ces travaux pourraient ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes, visant à rétablir un bon équilibre des réponses immunitaires, à soulager durablement la douleur et la sécheresse oculaire, voire à prévenir leur apparition. En ciblant les interactions entre le système immunitaire et les nerfs impliqués dans la douleur, ce projet ambitionne d’améliorer significativement la qualité de vie des patients souffrant de douleurs oculaires chroniques ou de maladies inflammatoires associées.
Procédures
Perturbation du microbiote intestinal précoce : Le microbiote intestinal sera perturbé par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 4 semaines, associée à un régime alimentaire dépourvu de fibres. Modèle d’inflammation intestinale (colites) : Un agent inducteur de colite sera administré dans l’eau de boisson pendant 14 jours au total, selon deux cycles successifs de 7 jours. Les instillations nécessiteront une contention de quelques secondes chez l’animal vigile. Les tests comportementaux, réalisés chez des animaux vigiles, impliqueront également des contentions brèves : test d’anxiété (2 sessions de 10 minutes par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 sessions de 30 secondes) et test de sensibilité chimique cornéenne (1 session de 30 secondes). Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale (4 sessions de 5 minutes), et une euthanasie règlementaire sera effectuée après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Modèle de douleur inflammatoire par instillation d’un conservateur de collyre : La douleur inflammatoire sera induite par des instillations d’un conservateur de collyre abrasif, réalisées deux fois par jour pendant 7 jours, suivies d’instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique (2 fois par jour espacées de 4 heures pendant 7 jours). Les instillations et tests comportementaux nécessiteront des contentions de quelques secondes chez l’animal vigile, selon les mêmes modalités que précédemment (tests d’anxiété et de sensibilité cornéenne). Les sessions d’imagerie (4 × 5 minutes) et l’euthanasie règlementaire seront effectuées après injection d’anesthésiques et d’antalgiques. Thérapie par instillations oculaires : Les traitements topiques (agent pharmacologique ou solvant) seront administrés par instillations oculaires deux fois par jour pendant 7 jours, espacées de 4 heures, une heure après l’instillation d’un conservateur de collyre abrasif chez l’animal vigile. Les modalités de contention, de tests comportementaux et d’anesthésie pour l’imagerie et l’euthanasie seront identiques à celles décrites ci-dessus.
Impact sur les animaux
Les antibiotiques et l’alimentation pauvre en fibres peuvent parfois provoquer une légère perte de poils sur le dos et un ralentissement modéré de la prise de poids. Les substances utilisées pour provoquer une inflammation peuvent entraîner une irritation de l’intestin ou de l’œil, une perte de poids et, plus rarement, la présence de sang dans les selles. Les animaux sont manipulés régulièrement pour l’administration de gouttes dans les yeux, ce qui peut générer un léger stress. Les injections d’anesthésiques ou d’antalgiques peuvent aussi provoquer une gêne brève au point d’injection. L’anesthésie générale comporte un faible risque (ralentissement cardiaque ou respiratoire, baisse de la température corporelle) et, très rarement, un décès. Des réactions locales au site d’injection (rougeur, douleur, petite infection) peuvent apparaître mais restent peu fréquentes. Les examens d’imagerie de l’œil nécessitent une anesthésie générale, ce qui représente un risque léger. Les tests comportementaux peuvent entraîner un stress passager (fatigue ou modification temporaire du comportement). Les traitements testés sont destinés à soulager l’inflammation oculaire. Leur administration est généralement indolore, mais une légère irritation transitoire peut parfois être observée. Les animaux sont surveillés attentivement afin de détecter et limiter tout inconfort.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires, impliquant l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à l’issue de chaque procédure expérimentale. Tous les animaux inclus dans le champ du projet et soumis aux procédures expérimentales feront l’objet de prélèvements post-mortem et seront euthanasiés. Les femelles reproductrices ne font pas l’objet de prélèvements mais, ne pouvant être réutilisées, sont néanmoins euthanasiées conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire, le microbiote et l’activation des voies nociceptives cornéennes. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire, le système nerveux et le microbiote intestinal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur.
Réduction
Afin de limiter au maximum le recours aux animaux, le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été strictement calculé et optimisé. Sur une durée totale de 5 ans, le projet impliquera au maximum 2 832 souris utilisées dans les procédures expérimentales. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’études précédentes et de calculs statistiques, afin d’utiliser le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ces calculs montrent qu’il faut au moins 10 animaux analysables par groupe expérimental. Dans nos expériences, les petits d’une même mère sont considérés comme appartenant à une même “portée”. Comme les frères et sœurs se ressemblent biologiquement, on tient compte de cette particularité dans le calcul du nombre total d’animaux. Le total inclut donc aussi les femelles reproductrices nécessaires pour obtenir suffisamment de petits par groupe. En moyenne, une mère donne naissance à environ 5 souriceaux. Ainsi, pour disposer de 10 animaux réellement analysables dans un groupe, environ 12 animaux sont nécessaires au total. Cela explique pourquoi le nombre final d’animaux n’est pas toujours un multiple exact de 10. Afin de réduire encore le nombre total d’animaux utilisés, plusieurs tissus sont prélevés sur chaque animal après euthanasie (œil, nerfs, cerveau, intestin, organes immunitaires). Cette approche permet de réaliser plusieurs analyses complémentaires à partir d’un même animal, sans multiplier les expérimentations. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés, afin de garantir une interprétation fiable et objective. Ces analyses permettent de déterminer si les différences observées sont réelles ou dues au hasard, selon des critères reconnus par la communauté scientifique.
Raffinement
Les animaux importes observeront une periode d acclimatation de 5 jours minimum avant le debut des experimentations ainsi que des temps de repos etablis entre les differents actes experimentaux. Les animaux seront heberges dans des cages ventilees en stabulation standard avec enrichissement maison en carton avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous eviterons tant que possible l hebergement individuel des animaux. Les conditions d hebergement sont conformes a la reglementation en vigueur. Des points limites ont ete definis et les animaux seront examines quotidiennement par le personnel qualifie de l animalerie et ou les experimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera note dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l echelle decisionnelle definie par notre structure du bien etre animal SBEA pouvant mener a l administration d un traitement a decaler dans le temps les actes prevus ou a euthanasier l animal si cela est necessaire. Lors de la gestation et ce jusqu a la fin du sevrage les meres sont placees au nombre de 2 par cage et restent avec les nouveaux nes. La nourriture et l eau de boisson sont fournies ad libitum. La temperature de la zone d hebergement est maintenue a 22 plus ou moins 2 et suit un cycle d eclairage non inverse 12h jour 12h nuit hygrometrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent. Un systeme d etiquetage associe a des pastilles visuelles permettra d assurer un suivi rigoureux du bien etre des animaux. Pour eviter toute souffrance les procedures chirurgicales se feront sous anesthesie generale associee a un protocole analgesique en pre per et post operatoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l animal ne soit stabilise pour ces differentes constantes. Si un animal anesthesie presentait une detresse respiratoire ou cardiaque ou s il se trouve en hypothermie nous procederons a un arret immediat du protocole en cours et en l absence de retablissement selon le temps defini pour respecter le bien etre animal l euthanasie de l animal sera envisagee. Les tests de la lampe a fente et l imagerie confocale in vivo qui peuvent induire un leger stress et necessitent que l animal soit immobile seront realises sous anesthesie generale.
Choix des espèces
Pour comprendre comment le systeme immunitaire et les bacteries de l intestin (microbiote) interagissent, nous utilisons des souris commerciales non transgeniques. Ces souris sont bien adaptees pour ce type d etude car leur biologie et leur developpement sont proches de ceux de l homme, et les connaissances acquises sont utiles pour mieux comprendre la sante humaine. Elles sont egalement un modele reconnu pour l etude de la douleur oculaire, car leurs yeux et leur cerveau sont similaires a ceux de l homme. Nous utiliserons des souris a differentes etapes de la vie, de la naissance a l age adulte, pour etudier comment les changements du microbiote precoce peuvent influencer les reactions du systeme immunitaire plus tard. Chaque experience durera 14 a 16 semaines maximum, et aucun animal ne depassera l age de 16 semaines. Les stades choisis sont bases sur les connaissances scientifiques, afin de suivre le developpement des animaux sur la duree et comprendre les effets des perturbations du microbiote sur la sante des yeux et du systeme immunitaire a l age adulte.
Maturation In Vivo des anticorps par édition génétique des lymphocytes B et implémentation d’un gène suicide dans des souris immunodéprimées MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer des thérapies utilisant des cellules immunitaires. Cela consiste à modifier les cellules immunitaires, appelées lymphocytes T, provenant d'un patient, pour les reprogrammer afin qu'elles reconnaissent spécifiquement un marqueur à la surface de cellules cibles, telles que les cellules cancéreuses. Ces lymphocytes T modifiés sont ensuite réinjectés au patient et, grâce à leur affinité accrue pour, par exemple, une protéine présente sur les cellules cancéreuses, ils vont pouvoir les détruire. Ce type de thérapie a déjà fait ses preuves dans le traitement de cancers comme les leucémies et les mélanomes. Le but est de développer ces stratégies pour d'autres cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes B. Ces cellules produisent des anticorps et sont également responsables de la mémoire immunitaire, ce qui permet une réponse plus rapide et efficace lors d’une seconde infection. Modifier ces cellules présente un intérêt, car les lymphocytes B mémoires pourraient exercer une action durable même après une seule administration de cellules modifiées. Actuellement, nous modifions déjà l’ADN des lymphocytes B en utilisant un outil qui agit comme des ciseaux pour altérer l’ADN. Les cellules sont modifiées afin d’exprimer des anticorps spécifiques (anticorps à chaîne unique) capables de reconnaître une cible que nous choisissons. L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité de ces thérapies dans un organisme vivant complexe, ainsi que d'améliorer la modification des cellules pour les rendre plus efficaces et plus sûres en tant que traitement. Pour cela, nous testerons des cellules, afin que, dans le cas où elles auraient des effets secondaires, elles puissent être éliminées.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient nous permettre d'obtenir un anticorps mutant avec une affinité améliorée, qui pourra être utilisé dans la suite de nos projets pour le développement de thérapies cellulaires à partir de lymphocytes B. D’autres cellules immunitaires pourraient également être utilisées. La fonctionnalité du gène suicide devrait également être démontrée. Finalement, nous allons évaluer la production et l'efficacité de notre anticorps contre des cellules cancéreuses.
Procédures
MODIFICATION Selon l'expérimentation, les différents lots de souris recevront des traitements spécifiques. Une injection unique de cellules (codant pour un anticorps, tumorales ou primaires humaines) sera réalisée par animal pendant environ une minute. Pour l'induction immunitaire, les souris recevront un antigène par voie intrapéritonéale une fois par semaine pendant 12 semaines (6 injections au total), chaque procédure durant quelques secondes. Le suivi du développement tumoral et les traitements médicamenteux seront effectués de manière hebdomadaire par injection et manipulation pendant 5 minutes, sur une période maximale de 20 semaines. L'état de santé général des animaux sera évalué par des prélèvements sanguins bimensuels durant moins d'une minute. Certains groupes subiront également une séance d'irradiation unique de 30 minutes maximum, avec un apport supplémentaire d'oxygène pour réduire le stress. Enfin, en cas de développement d'une GvH, les animaux recevront un traitement quotidien pendant une minute sur une période de 7 jours (pouvant être prolongée jusqu'à 9 jours). Ce traitement sera administré par voie orale (gavage ou eau de boisson) ou par injection.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances et d’effets indésirables sont attendus après l’injection de cellules. Une légère sensation d’inconfort pourra être ressentie en raison des lésions causées par les piqûres. Le développement tumoral peut entraîner un affaiblissement de l’animal. Les autres nuisances attendues proviendront de l’irradiation corporelle totale, qui provoque une immunodépression complèt, qui peut entraîner un affaiblissement notable de l'animal. L’immunisation répétée pourra provoquer une réaction immunitaire et un stress supplémentaire. Les injections répétées, qu'elles soient sous-cutanées ou intrapéritonéales, peuvent entraîner douleur et inconfort localisés, ainsi que de l'inflammation ou une irritation au site d'injection. Il est essentiel de minimiser ces effets en variant les sites d’injection et en respectant les bonnes pratiques d’administration. Les injections seront réduites au minimum lorsque cela sera possible, et des antalgiques seront administrés en cas de signes de douleur. Des prélèvements sanguins répétés, peuvent causer des gênes supplémentaires chez les animaux, principalement sous forme d'inconfort au site de prélèvement et de stress lié à la manipulation fréquente. Le risque de formation d'hématomes ou d'inflammation locale existe, notamment lorsque les prélèvements sont effectués sur des sites souvent sollicités. MODIFICATION Le gavage répeté peut induire des lésions œsophagiennes et du stress. L’isolement social peut générer de l'anxiété, mais permet une auto-administration sans douleur.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt qui seront rigoureusement exploités et analysés afin de recueillir un maximum d'informations.
Remplacement
De nombreuses études in vitro ont validé la fonctionnalité de notre anticorps ainsi que l'édition des lymphocytes B pour qu'ils expriment cet anticorps. Cependant, le système de mutation intra-cellulaire, qui améliore les anticorps dans les cellules et permet la sélection des clones in vivo, est un mécanisme très complexe dont l'efficacité ne peut être reproduite in vitro. L'efficacité du gène d'autodestruction a également été démontrée in vitro, mais doit être confirmée dans un organisme vivant complexe. Étant donné que ce projet vise à développer une thérapie, l'efficacité finale de la stratégie ne peut être évaluée que dans un organisme entier. En raison de ces contraintes, il n'est actuellement pas possible de remplacer complètement les études in vivo par des modèles in vitro. Toutefois, nous avons maximisé l'utilisation des modèles cellulaires et des approches in vitro afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés. Les études in vivo restent essentielles pour valider les résultats et évaluer les effets dans un contexte biologique complet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été conçues de manière à utiliser le moins de souris possible tout en collectant le maximum d’informations. Pour ce faire, plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) seront prélevés et analysés sur un même animal, permettant ainsi de réaliser diverses analyses sans augmenter le nombre de souris. De plus, nous allons tester simultanément l’induction du gène d'autodestruction et l’efficacité de notre anticorp, ce qui permettra de réduire le nombre de lots nécessaires pour ces expériences. Cette approche combinée nous permettra d'obtenir des données robustes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Des analyses statistiques ont été employées pour définir la taille des lots, afin de garantir que le nombre d'animaux utilisés soit le plus petit possible tout en assurant la fiabilité et la significativité des résultats obtenus. Cela nous permet d'optimiser le design expérimental et de réduire l'utilisation d'animaux au strict minimum nécessaire.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimales : locaux confinés, portoirs ventilés, environnement contrôlé (température, humidité, pression) avec alternance jour/nuit de 12 heures, accès à la nourriture ad libitum et à l'eau, et un maximum de 5 animaux par cage (aucun animal seul). Les cages sont changées une fois par semaine. Pour réduire le stress, les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (coton, "maisons" en carton, boîtes à œufs). Les animaux recevront une anesthésie et/ou analgésie adaptée à chaque procédure. Des points limites sont établis pour détecter rapidement les signes de souffrance. Une évaluation régulière du score de grimace, du poids et du comportement permet un contrôle continu de leur état de santé. Les techniques d'imagerie in vivo non invasives (bioluminescence) permettront une détection précoce sans douleur d'un éventuel envahissement tumoral.
Choix des espèces
Pour la première partie du projet, qui consiste à améliorer l'affinité de nos anticorps, nous souhaitons utiliser un modèle de souris déjà publié. Ce modèle utilise des souris avec un système immunitaire complet, incluant toutes les niches cellulaires nécessaires pour accueillir les cellules modifiées ainsi que tous les mécanismes fonctionnels pour l'amélioration des anticorps. Les souris immunodéprimées, choisies pour la suite du projet, sont totalement dépourvues de la plupart de leurs cellules immunitaires. L'utilisation de souris sans système immunitaire permet d'éviter le rejet de la greffe réalisée avec des cellules humaines, qui seraient autrement reconnues comme étrangères par le système immunitaire de la souris. Ces souris permettent la croissance de nombreuses cellules humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. L'emploi de cellules humaines chez ces souris nous permet de développer et tester une thérapie qui pourra être facilement transposée à l'homme, puisque les techniques de traitement et d'édition seront identiques. Cela nous permet également de valider leur fonctionnalité une fois greffées dans un hôte. Bien que l'utilisation de ces animaux immunodéprimés expose à un risque accru d'infections, ce risque sera maîtrisé par des précautions sanitaires adaptées, notamment en les hébergeant dans un environnement protégé. Ce phénotype défavorable ne s'exprimera donc pas dans les conditions appliquées à ce projet. Les souris utilisées dans ces études auront entre 7 et 9 semaines, conformément à la majorité des travaux scientifiques, afin d'obtenir des résultats comparables. De plus, à cet âge, les souris ont un système immunitaire complètement développé.
Fibrose hépatique : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur la fibrose hépatique et la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 500
Objectifs
L’apparition d’une fibrose hépatique est une complication principale des maladies chroniques du foie, d'origine alcoolique, virale, parasitaire, biliaire ou autre. Elle se caractérise par un dysfonctionnement des hépatocytes mesurable par une augmentation des taux circulants des enzymes hépatiques, de la bilirubine, et par une altération de la production de protéines comme l’albumine et la prothrombine. La stéatose hépatique non alcoolique (NASH) est une pathologie caractérisée par des anomalies du bilan hépatique avec augmentation du taux de transaminases dans le sang. Son diagnostic repose essentiellement sur l’analyse histologique d’une biopsie hépatique qui montre une augmentation des lipides stockés dans les cellules hépatiques accompagnée d’une inflammation, et d’une fibrose plus ou moins marquée en fonction de l’avancement de la maladie. Elle survient chez un patient qui n'a pas d'autre maladie hépatique d'origine virale, auto-immune, génétique ou toxique, et surtout qui n'a pas une maladie alcoolique du foie. La stéatose hépatique non alcoolique (NASH), chez environ un tiers des patients, évolue à travers différents degrés de fibrose vers une cirrhose et favorise l'apparition d'un carcinome hépato-cellulaire (CHC). La greffe de foie reste la seule solution envisageable pour le patient à ce stade de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose hépatique et la NASH. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour lesquelles les options sont pour le moment limitées à des traitements symptomatiques et à une greffe de foie.
Procédures
Pour induire une fibrose hépatique chez la souris ou le rat adulte, 2 administrations intrapéritonéales de CCl4 seront effectuées chaque semaine avec 3-4 jours d’intervalle pendant toute la durée des études. Pour induire une stéatose hépatique, ces injections seront associées à un régime enrichi en graisses et en sucres qui sera fourni à volonté tout au long des études. Les études de fibrose dureront 6 semaines en cas d’évaluation d’un composé préventif, 10 semaines en cas d’évaluation d’un composé thérapeutique. Les études de stéatohépatite dureront au maximum 10 semaines. Elles comprendront au minimum 3 groupes de 10 à 12 animaux. Pour reproduire de manière plus complète la maladie humaine, un modèle progressif de stéatohépatite métabolique, fibrose et carcinome hépato-cellulaire (Modèle STAM) sera induit chez les souris. Il consistera à injecter à des souriceaux mâles de 2 jours de la streptozotocine, ce qui induira un désordre métabolique, puis à leur fournir à partir de leurs 4 semaines une nourriture riche en sucres et graisses. Ces études dureront au maximum 16 semaines, avec au moins 5 groupes de de 10 souriceaux mâles. Ces souriceaux seront obtenus en acquérant des femelles gestantes. Les souriceaux femelles ne seront pas intégrés aux études. L’induction pouvant causer environ 10-12% de mortalité, 12 souriceaux mâles seront initialement intégrés à chaque groupe. Les animaux recevront des composés chimiques ou biologiques à tester (voies intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale avec analgésie, orale sur animaux vigiles, sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile, ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable). Les anesthésies pour les administrations de composés dureront moins d’une heure. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang…).
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus dans les modèles de fibrose hépatique et de NASH chez les adultes sont modérés avec une perte de poids transitoire (10%) consécutive à chaque exposition à l’agent chimique. Dans le cas du modèle sur nouveaux nés, de la mortalité pourra être observée suite à l’induction initiale à la STZ (environ 10-12% des animaux). Suite à cela, les animaux augmenteront en poids et auront une forte tendance à l’obésité (prise de poids jusqu’à environ 100% du poids initial contre 50% normalement dus à la croissance). Les administrations et prélèvements, compte tenu de l’analgésie et de l’anesthésie mises en place le cas échéant, pourront générer une douleur légère et un stress léger, de très courte durée. La chirurgie éventuelle d’implantation des pompes osmotiques pourra générer une douleur légère et un stress léger compte tenu de la prise en charge analgésique prévue. L’alimentation déséquilibrer est à l’origine d’un transit plus lent et augmente le risque de fécalome.
Devenir
Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Pour les modèles de fibrose hépatique et de NASH chez les souris et rats adultes, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre de 12 animaux par groupes pourra être nécessaire pour l’évaluation de paramètres variables (cytokines etc) mais on pourra diminuer jusqu’à 10 animaux adultes par groupe pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (analyse histologique). Pour le modèle induit à la STZ, des souris femelles gestantes seront hébergées jusqu’à mise bas et seuls les souriceaux mâles seront conservés, la maladie étant moins bien induite chez les femelles. Il faudra compter environ 1 femelle gestante pour 3 souriceaux mâles. L’objectif sera d’avoir à terme 10 souriceaux mâles par groupe. Du fait de la mortalité suite à l’induction (10-12%), un effectif de 12 souriceaux par groupe sera initialement visé. En conséquence, par groupe de 10 souriceaux mâles final, en prenant en compte la mortalité, 4 souris gestantes seront acquises pour obtenir 12 souriceaux mâles.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids au-delà de 20% constituera un point limite. A partir de 10% de pertes de poids constatée une pesée quotidienne sera mise en place et maintenue jusqu’à résolution. En cas de perte de poids (à partir de 10% sur certains animaux), de l’eau gélifiée et de la nourriture humidifiée seront placés au fond de toutes les cages. L’administration d’un anti-émétique pourra être décidée sur recommandation vétérinaire. Si une déshydratation associée à une perte de poids est constatée, les animaux seront réhydratés en sous-cutané. En cas de douleur constatée ou suspectée, une analgésie (opiacé) sera réalisée. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Sur les animaux pour lesquels on aura induit un diabète, si une pollakiurie est constatée, la fréquence de change des cages sera ajustée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus des modèles pathologiques et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le choix du rongeur se base sur trois points : La fibrose hépatique et la stéatohépatite métabolique sont bien documentées dans la littérature chez le rat et la souris La combinaison d’un modèle de fibrose induit au CCl4 avec un régime gras et sucré est aussi décrite dans la littérature chez le rat. Le modèle de développement de cancer du foie sur fond de stéatohépatite métabolique est décrit dans la littérature chez la souris. Lors du développement d’un candidat médicament, les études de toxicité pour toute nouvelle molécule doivent être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), pour les modèles de fibrose et stéatohépatite au CCL4 chez l’adulte, étant donné que ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur des rongeurs sevrés de plus de 6 semaines. A l’inverse, le modèle STAM impliquera l’utilisation de souris adultes gestantes puis de leurs nouveaux-nés dès la naissance (premier acte à 2 jours de vie).
Evaluation pharmacologique d’approches thérapeutiques dans divers modèles de tumeurs obtenues par greffe ectopique chez le rongeur (rat ou souris).
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 400
Objectifs
Le cancer n’est pas une maladie unique mais un groupe d’affections où des altérations génétiques ont conduit des cellules initialement normales à une croissance anormale et incontrôlée. De plus, au sein d’un même type de cancer, différents sous-types existent et deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des différences significatives en termes de localisation dans l’organe, d’agressivité, d’histologie, d’altérations génétiques et de réponse aux thérapies conventionnelles. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet consiste à évaluer l’activité antitumorale de différentes approches thérapeutiques dans des modèles de tumeurs obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale dans les tissus superficiels (en général souscutanés) de rongeurs (rat ou souris), la souris étant l’espèce animale la plus utilisée. Une masse tumorale se forme alors progressivement au site d’implantation. L’efficacité antitumorale d’une approche thérapeutique est déterminée par l’évolution de la croissance tumorale chez des animaux traités par rapport à des animaux non traités (ou recevant le placebo ayant servi à formulation des produits testés) ou recevant un traitement de référence. Pour ce projet d’une durée de 5 ans, il est prévu de réaliser 9 études par an pour les souris et 1 étude par an pour les rats.
Bénéfices attendus
A long termes, les bénéfices attendus du projet sont le développement et la mise sur le marché de nouvelles approches thérapeutiques telles que des candidtas médicaments et/ou des rayonnements ionisants (radiothérapie) efficaces et présentant un minimum d'effets secondaires dans le traitement des cancers. A court termes, ce projet permettra de démontrer que la candidat médicament est actif dans un modèle expérimental de tumeur et d'évaluer d'eventuels effets secondaires. Il permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux peuvent être soumis à des interventions telles que l'implantation du matériel biologique d'origine tumorale (1 fois, 10-15 min) sur l'animal vigile ou anesthésié, des contentions vigiles lors des administrations (2 min, Maximum 2 administrations/jour pendant 35 jours), des prélèvements sanguins (Maximum 5, 2 min) et des suivis réguliers des animaux et des tumeurs (5-10 min, minimum 1 fois /semaine jusqu’à 7 fois/semaine). Ils peuvent subir également des contentions lors des sessions d’imagerie vigiles ou sous anesthésie (5 à 30 min, Maximum 2 fois/semaines pendant 5 semaines), lors des sessions de radiothérapie (5 min, maximum 5 fois/semaine pendant 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie (pour l’implantation des cellules tumorales ou les suivis par imageries) et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations suivant le type d’administration utilisé ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation ou si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets indésirables provoqués par les produits testés et/ou le modèle.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, un premier tri des candidats-médicaments est réalisé in vitro sur des cellules tumorales en culture pour tester leur efficacité. Puis des tests in vivo sont réalisés avec les candidats-médicaments sélectionnés chez la souris et le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pharmacologiques d’une nouvelle molécule sur le développement tumoral sur un organisme complet. De plus avant l’administration à l’homme, l’administration chez l’animal permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 6-10 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique. et nous l'avons également confirmé et validé. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Les tumeurs seront mesurées régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine) afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Afin de minimiser les effets digestifs des irradiations, une supplémentation nutritive peut être réalisée pendant les jours qui suivent les irradiations. Pour les animaux immunodéficients, ils seront hébergés dans des cages spécifiques fermées avec un filtre qui permettent de protéger les animaux de l’extérieur et éviter ainsi toute infection. Pour les mêmes raisons, la manipulation de ces animaux est faite sous un poste de sécurité microbiologique (PSM). Les souris immunodéficientes sont hébergées en portoirs ventilés. Lors de l’anesthésie pour l’acquisition des données d’imagerie, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Lors du transport à l’extérieur, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une échelle de cotation pour la nécrose tumorale. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Des animaux transgéniques avec ou sans phénotype dommageable peuvent être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consulté pour valider les actions mises en place.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs obtenues par greffe de matériel biologiques d'origine tumorale dans les tissus superficiels. Généralement, les animaux âgés de 6 à 10 semaines seront utilisés au moment de l’implantation. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.
Exploration de la fonction endocrine de la surrénale dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Objectifs
La surrénale est une glande endocrine qui, par ses sécrétions hormonales permet la survie de l’individu. La surrénale est considéré comme l’organe principale de la réponse au stress et dépend de l’intégrité du cortex surrénalien, organisé en zones concentriques spécialisées : la zone glomérulée (zG) pour les minéralocorticoïdes (aldostérone) et la zone fasciculée (zF) pour les glucocorticoïdes (cortisol chez l’homme et corticostérone chez la souris). Les mécanismes responsables du maintien de cette organisation sont encore largement incompris. Des études antérieures ont permis de montrer que des modulations de la SUMOylation (modification des protéines) entraine des perturbations de la fonction endocrine de cette glande. Par ailleurs, d’autres travaux ont permis de montrer que les surrénales males et femelles ont des fonctions surrénaliennes propres à chacun des sexes. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction endocrine de la surrénale en réponse à différents stimulis dans plusieurs modèles murins.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la fonction surrénalienne et en particulier : 1) l’impact des mécanismes de SUMOylation (mécanismes de modification des protéines) ainsi que des acteurs du dimorphisme sexuel mais également 2) l’identification des modifications protéiques lors des différentes stimulations surrénaliennes.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises à une injection (234 souris) ou deux injections (264 souris) et un prélèvement de sang (264 souris), Ces interventions durent moins de 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des traitements réalisés sur 4 jours, peuvent être une perturbation du sommeil et de l’excitabilité. Les études antérieures utilisant les mêmes protocoles n’ont montré aucun comportement particulier, ni souffrance observable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience en vue du prélèvement des tissus requis pour la réalisation de différentes analyses.
Remplacement
Ce projet concerne l’étude de l’exploration fonctionnelle d’un organe de réponse au stress dont l’activité est soumise à un rétrocontrôle hypothalamo-hypophysaire. Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’intégrer ces différents niveaux de complexité.
Réduction
L’étude se fera sur 498 animaux au maximum Afin de diminuer le nombre d’animaux, les mêmes groupes témoins seront utilisés lorsque cela est possible ce qui permettra de diminuer le nombre de souris (diminution de 88 souris). De plus, Les animaux des groupes témoins seront issus des mêmes portées que les animaux génétiquement modifiés. Nous utiliserons les mêmes animaux pour réaliser deux stimulations surrénaliennes différentes.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi selon les recomandations en vigueur. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 individus pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. La surveillance se fera 2 fois par jour lors des différents traitements. Aucun raffinement supplémentaire n’est requis lors de nos procédures.
Choix des espèces
La souris présente une physiologie endocrine, très proche de l’espèce humaine et est le modèle mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques. Enfin, les méthodes d’exploration de la fonction hypothalamo-hypophysaire-corticotrope sont les mêmes que celles utilisées chez l’homme Pour l’analyse de la réponse endocrine de la surrénale, les animaux seront utilisés à l’âge de 11 semaines qui correspond à un stade adulte.