Les projets approuvés

Rasés, équipés d'un gilet à électrocardiogramme porté 6 h 30 par jour pendant trois jours, épilés à la crème dépilatoire, puis soumis à six injections intrapéritonéales espacées de trois ou quatre jours, chacune suivie d'un électrocardiogramme d'une heure, 40 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur neuf semaines de suivi par individu. Quatre d'entre eux subissent en plus une restriction calorique de 30 % et une pièce ramenée à 15 °C. Le résumé ne nomme jamais l'espèce, seulement "un modèle de petit primate", et compare l'activité cardiaque des individus de 1 à 5 ans à celle des individus de 6 à 12 ans. Le champ structuré du devenir annonce 24 mises à mort et 16 réutilisations, tandis que la narration prévoit la mise à mort de tous les individus de la classe 6-12 ans et une dégradation possible de l'état de santé chez les plus âgés de la classe 1-5 ans.

Objectifs

Avec le vieillissement de la population, 75% des personnes de plus de 65 ans souffriront de déficiences cardio- vasculaires, limitant leur autonomie physique et cognitive et pouvant dégénérer en maladies potentiellement mortelles. Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies. La fréquence cardiaque maximale diminue chez les personnes âgées, indépendamment du mode de vie. Chez ces personnes, le remodelage fonctionnel du stimulateur naturel du cœur, et sa modulation anormale par le système nerveux autonome pourraient être à l'origine de la diminution de fréquence cardiaque. Les statistiques nous indiquent que 1 personne âgée sur 600 développera ralentissement du coeur directement appelées syndrome du sinus malade. Ce syndrome pourrait aussi être une des causes de la fibrillation auriculaire, l’arythmie la plus courante chez les personnes âgées, qui se vérifie dans 5 à 10 % de ces personnes. Pour clarifier la modification de la fréquence cardiaque au cours du vieillissement, nous allons étudier l'activité cardiaque chez un modèle de petit primate. Les données seront comparées aux études déjà réalisées chez la souris et pourront, à plus long terme, permettre le développement de traitements visant à réduire la déficience cardiaque chez les personnes âgées.

Bénéfices attendus

Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies, ainsi que la morbidité et mortalité associés à ces maladies. Pour clarifier la modification de la fréquence cardiaque au cours vieillissement, nous avons choisi un modèle de petit primate qui présente de plus grandes similitudes avec l’homme comparé à la souris. En effet, bien que de taille similaire aux petits rongeurs, cette espèce à une espérance de vie (12 ans) bien plus longue que celles des souris (3 ans). Par conséquent, le nombre de battements cardiaques générés dans une vie chez cette espèce est de 3 milliards, similaire au nombre qui peut attendre le cœur humain au long d’une vie alors que la majorité des autres mammifères génèrent un maximum de 1 million de battements cardiaques dans une vie. Ces comparaisons montrent la similarité entre homme et ce petit primate et justifient l'utilité de cette espèce comme meilleur modèle pour des études sur le vieillissement cardiaque. A plus long terme, cela permettrait d'envisager des thérapies visant à réduire la déficience cardiaque au cours du vieillissement

Procédures

Contention pour rasage et pose du gilet incluant un dispositif d’Electrocardiogramme (5 minutes), permettant l'enregistrement dans lieu de vie (6h30) pendant 3 jours, anesthésie gazeuse (30 minutes), épilation à la crème dépilatoire (2 minutes), échographie (30 minutes), injection intrapéritonéale de molécules (durée 1 minute) avec un intervalle de 3 ou 4 jours, 6 injections au total suivi d'un électrocardiogramme (1h) sur une durée de 2 semaines. Pour 4 animaux, restriction calorique de 30% et diminution de la température de la pièce à 15°. La durée totale du suivi est de 9 semaines pour chaque animal. En fin de procédure, lors de l'euthanasie le prélèvement de sang intracardiaque est fait sous analgésie et anesthésie profonde .

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à la pose du gilet pour enregistrer les électrocardiogrammes peut provoquer un léger stress. Les injections intrapéritonéales des molécules ou des anesthésiques entrainent aussi un stress de très courte durée. Les analyses d' échographie seront faites après anesthésie gazeuse de l’animal, ce qui permet ensuite un réveil très rapide. Les animaux en fin de vie seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie pour permettre les prélèvements d'organes pour des études post mortem au niveau tissulaire et cellulaire.

Devenir

Tous les animaux dont l'état de santé se dégrade seront euthanasiés pour récupérer les organes d'intérêt et étudier l'effet du vieillissement sur ces organes. Donc on estime que tous les individus de la classe 6-12 ans seront euthanasiés au cours du projet et certains individus les plus âgés de la classe 1-5 ans pourraient présenter une dégradation de leur état de santé compte tenu de la durée du projet.

Remplacement

Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des dysfonction cardiaques dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. Par ailleurs, la variabilité individuelle chez les primates mime la variabilité chez l'homme. Ainsi,cette forte similitude entre la physiologie de ce petit primate et la physiologie humaine, comparée aux rongeurs, permet d’obtenir des données plus fiables qui auront une meilleure applicabilité pour le développement de traitement clinique.

Réduction

Nos procédures sont planifiées de façon à réutiliser les mêmes animaux dans plusieurs tests non invasifs. Les expériences précédentes sur d'autres animaux de laboratoire, suggèrent que 10 animaux par groupe seraient suffisants pour appliquer des tests et mettre en évidence des différences statistiquement significatives. Nos protocoles prévoient un suivi individuel (avant et après traitement). Ainsi chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de réduire le nombre d'individus dans les groupes, sans compromettre les objectifs du projet. Pour ce qui concerne les analyses statistiques, tous les tests seront faits de façon telle à comparer les groupes sur la base de l'âge et du sexe des animaux . Pour les données post mortem, les analyses sont faites sur le cœur isolé à partir des animaux dont l'euthanasie est décidée car en fin de vie ou présentant une altération forte de leur bien-être (blessure, pathologie) et pour lesquels les points limites de bien-être animal sont atteints. Tous les organes seront prélevés et conservés pour partage éventuel de tissus à la communauté scientifique, ce qui réduit le besoin d’animaux à plus large échelle.

Raffinement

Les animauxen élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. Les animaux sont groupés par 4 ou 5 individus de même sexe. L’observation quotidienne des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux est réalisée. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux sont enregistrés par des dispositifs externes posés sous des gilets, ce qui évite l’installation d’implants télémétriques. Les enregistrements sont réalisés sur des animaux qui continuent à avoir une vie normale en élevage et qui portent le gilet seulement durant 6h30, et pas sur une durée de plusieurs mois comme c'est le cas pour des animaux implantés. De plus la technique d échographie sous anesthésie gazeuse permet d’obtenir des informations structurales sur le cœur et le cerveau des animaux in vivo, sans intervention invasive. En cas d'atteinte des points limites, les animaux sont retirés de l'étude voire euthanasiés. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement d'organes, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Le nombre de battements cardiaques dans une vie est commun à plusieurs espèces de primates et trois fois plus élevé que dans les espèces de rongeurs (souris et rat) communément utilisées en recherche. Notre modèle primate possède l'avantage, par sa petite taille, d'être facile à maintenir en élevage. De plus, au cours de leur vie (espérance de vie de 12 ans), ces petits primates génèrent autant de battements cardiaques qu’une personne âgées, soit environ 3 milliards. Cela indique que les cœurs de ce modèle, des humains et d’autres primates doivent avoir des adaptations qui leur permettent de soutenir dans une vie, une activité cardiaque trois fois plus longue que les autres mammifères. De ce fait, cette espèce est un meilleur modèle pour étudier les effets du vieillissement au niveau cardiaque . Les animaux est considérés comme âgés à partir de 5 ans donc nous comparerons les fréquences cardiaques des animaux âgés (plus de 5 ans) à celles d'animaux adultes (moins de 5 ans) . Notre étude sera donc réalisée sur des animaux , entre 1 et 5 ans pour les adultes et entre 6 et 12 ans pour les individus âgés.

Pesées, mesures de composition corporelle sous contention, incision au bout de la queue chaque mois pour une goutte de sang, prélèvements sanguins tous les trois mois à partir de 17 mois : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une étude qui les suit jusqu'à leur mort. Un premier groupe de 32 est tué pour vérifier le mode d'administration du traitement, 128 autres à 24 mois pour des analyses tissulaires, et les souris restantes sont gardées "aussi longtemps que possible, jusqu'à leur mort naturelle" ou jusqu'à l'atteinte d'un point limite. Le projet associe un traitement qui élimine les cellules sénescentes et un traitement de reprogrammation cellulaire, avec l'espoir déclaré d'allonger l'espérance de vie. Le porteur annonce des tests de motricité, de force physique et de mémoire répétés jusqu'en fin de vie, sans préciser lesquels.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'explorer une nouvelle approche pour ralentir le vieillissement et améliorer la santé en agissant directement sur nos cellules. Des recherches ont montré qu'il est possible de "réinitialiser" certaines cellules adultes et de les rendre plus jeunes (reprogrammation). Ce phénomène a été observé chez les souris et les humains, où ces cellules reprogrammées peuvent même contribuer à reconstruire des tissus et des organes. D’autres études ont révélé que lorsqu’on applique ce processus de manière temporaire chez des souris atteintes d'une maladie provoquant un vieillissement accéléré, leur état de santé s’améliore et leur espérance de vie s’allonge. Cependant, nous avons constaté qu’une seule intervention tardive n’a pas d'effet significatif sur la longévité et les organes. Nous pensons que l'accumulation de cellules trop âgées, qui ne fonctionnent plus correctement, pourrait empêcher ce processus de rajeunissement d’être pleinement efficace. C’est pourquoi notre projet vise à associer deux stratégies : Éliminer les cellules trop usées, qui pourraient gêner la régénération. Stimuler le renouvellement des cellules restantes, pour leur redonner une "seconde jeunesse". En testant cette combinaison chez la souris, nous espérons mieux comprendre comment ralentir le vieillissement et, à terme, trouver des pistes pour améliorer la santé au fil des années.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le processus de rajeunissement des cellules pourrait être encore plus efficace s'il était associé à un traitement capable d’éliminer les cellules trop vieilles et dégradées. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons observer de près les effets de cette approche chez des souris âgées. Nous examinerons leurs tissus au microscope, analyserons les différentes cellules présentes et étudierons certains marqueurs biologiques du vieillissement. Nous espérons ainsi constater non seulement une amélioration de la santé des tissus, mais aussi une augmentation de leur espérance de vie chez les souris recevant ces deux traitements combinés. Ce projet nous aidera à mieux comprendre les transformations qui accompagnent le vieillissement et à explorer une nouvelle approche pour limiter les maladies liées à l’âge. À terme, ces découvertes pourraient ouvrir la voie à des applications pour l’être humain. Si les résultats sont concluants, il pourrait être possible d’activer ce processus de rajeunissement grâce à des méthodes similaires à celles utilisées pour certains vaccins récents, ou encore via des traitements ciblés directement sur les organes ou tissus concernés (comme la peau, les muscles ou les articulations). Ce projet pourrait ainsi poser les bases d’une nouvelle approche pour vieillir en meilleure santé.

Procédures

Les interventions prévues pour les animaux seront les suivantes : - Suivi du poids et de la composition corporelle : Pesée hebdomadaire et mesure de la composition corporelle (méthode non invasive, 2 minutes de contention) tous les mois jusqu’à 18 mois, puis tous les 15 jours jusqu’à la fin de vie. - Surveillance de la glycémie : Une mesure mensuelle jusqu’à 24 mois SUR TOUTE LA COHORTE, nécessitant une petite incision à l’extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang (3 secondes) AINSI QU'UN PRELEVEMENT SANGUIN TOUS LES 3 MOIS A PARTIR DE 17 MOIS- Traitements pharmacologiques : Administrés via l’alimentation pour limiter les interventions OU PAR INJECTION SELON LES RÉSULTATS DE LA PROCÉDURE TEST, l’un dans les croquettes pour éliminer les cellules vieillissantes (pour 48 animaux, de 18 à 24 mois / pour 90 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie), l’autre dans l’eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire (pour 48 animaux de 2 à 24 mois / pour 32 animaux de 18 à 24 mois / pour 90 animaux de 2 mois jusqu'en fin de vie / pour 60 animaux de 18 mois jusqu'en fin de vie). - Évaluations fonctionnelles et comportementales : Tests de motricité (5 tests de 3 fois 5 minutes pour 128 animaux / 5 tests de 3 fois 5min puis 1 test tous les mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux), force physique (5 tests de 1 min pour 128 animaux / 5 tests de 1 min puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) et mémoire (4 tests de 2 fois 10 minutes pour 128 animaux / 4 tests de 10 minutes puis 1 test tous les 2 mois jusqu'en fin de vie pour 240 animaux) réalisés à différentes étapes de l’étude

Impact sur les animaux

Effets indésirables prévus sur les animaux : Vieillissement naturel et effets associés ; Stress ponctuel lié aux tests de force, de motricité, de comportement et au suivi ; Douleurs légères et ponctuelles (Biopsies, tatouage, mesure de la glycémie, injection d'anesthésique lors de la fin de procédure ET INJECTION DU TRAITEMENT SI LE CHOIX SE PORTE SUR CETTE MÉTHODE). Désagréments digestifs mineurs liés à l'utilisation d'un antibiotique dans l'eau de boisson pour stimuler la régénération cellulaire, mais rien de significatif n'a pu être observé dans les expériences passées avec les mêmes concentrations. ET STRESS / LEGERE DOULEUR LIEE AU PRELEVEMENT D'UN PETIT VOLUME SANGUIN.

Devenir

UN PREMIER GROUPE DE 32 ANIMAUX SERA EUTHANASIÉ POUR VÉRIFIER LE MODE D’ADMINISTRATION ET L’EFFICACITÉ DU TRAITEMENT, AU TRAVERS D’UN CERTAIN NOMBRE D’ANALYSES TISSULAIRES ET HISTOLOGIQUE. Au terme des 24 premiers mois, un groupe de 128 animaux sera euthanasié afin de réaliser un large panel d’analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires. Les animaux restants seront gardés aussi longtemps que possible, jusqu'à leur mort naturelle, ou jusqu’à l’atteinte des points limites préalablement définis et enregistrés sur une grille de score.

Remplacement

Bien que la reprogrammation cellulaire ait déjà montré des effets positifs sur la santé et la longévité des souris, nos recherches indiquent qu’elle fonctionne moins bien chez les souris âgées. Cela semble être dû à l’accumulation de cellules usées qui perturbent le bon fonctionnement des tissus et empêchent le processus de rajeunissement d’agir efficacement. Ce projet vise à améliorer cette approche en éliminant ces cellules vieillissantes dans différents organes pour lever cet obstacle. Il permettra aussi d’étudier en détail l’impact de ces traitements sur les cellules et les molécules des organes, notamment sur les cellules responsables de la régénération des tissus. L’utilisation d’animaux est essentielle pour comprendre comment ces traitements influencent le vieillissement et évaluer leur potentiel pour améliorer la santé au fil du temps.

Réduction

Des travaux réalisés au sein de l’équipe ont démontré pour la première fois qu’il existait une différence de la réponse à la reprogrammation cellulaire entre les mâles et les femelles. Afin d’optimiser au mieux l’utilisation de tous les animaux produits, nous allons réaliser nos tests à la fois sur les mâles et les femelles. Le nombre de groupes a été réfléchi de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques. Plusieurs tests statistiques seront envisagés afin d'analyser les données.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les interventions et les nuisances dues aux différents traitements, ces derniers ne seront administrés que par l’alimentation (EAU DE BOISSON ET NOURRITURE), SAUF SI LES RÉSULTATS DES TESTS SONT PLUS CONCLUANTS PAR INJECTION. Les procédures expérimentales étant non invasives, l’utilisation d’analgésiques ne sera pas nécessaire. L’ajout d’éléments d’enrichissement dans les cages sera systématiquement effectué. Un tunnel en plexi rouge permet à la fois de déplacer les animaux sans stress et de les habituer à la contention pour la mesure de composition corporelle. Les animaux seront préalablement habitués aux tests de motricité. L’examen, hebdomadaire jusqu’à l’âge de vingt QUATRE mois puis bi-hebdomadaire ensuite (sauf incident avec un individu nécessitant plus d’attention ou de soins), de l’ensemble des souris sera effectué pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi les premiers signes comportementaux de douleur ou d’éventuelles anomalies. L’état de santé des animaux sera évalué et l’atteinte d’un point limite entraînera la mise à mort de l’animal. Les animaux seront pesés tous les 15 jours jusqu’à 18 mois puis chaque semaine. Dès les premiers signes de difficultés de déplacement ou de nutrition, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages. Enfin, nous avons fixé des points limites qui, lorsqu'ils seront atteints, déclencheront l'arrêt du test ou l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

La reprogrammation permet de faire revenir des cellules adultes à un état plus jeune et moins spécialisé. Afin d’étudier l’impact de la sénescence sur la reprogrammation, les expérimentations et analyses seront réalisées sur des souris adultes. Le modèle souris permet d’étudier des animaux génétiquement modifiés et capables d’être reprogrammés lors de l’administration d’un traitement. Ainsi, les traitements (DANS LA NOURRITURE OU L’EAU DE BOISSON) seront réalisés sur des animaux dont les signes de vieillissement commencent à se manifester (à partir de 18 mois, équivalent à environ 60 ans en âge humain). La reprogrammation sera faite dès l’âge de 2 mois, ou bien sur des animaux déjà âgés de 18 mois.

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une alimentation enrichie en graisses pendant seize semaines, et chaque souris passe trois échographies cardiaques sur animal vigile, trois prélèvements sanguins, puis un test de glycémie comportant six prélèvements répétés en deux heures. Le porteur signale une sensibilisation ou une irritation de la queue liée à la répétition des prélèvements, et annonce qu'aucun effet indésirable n'est attendu chez les souris transgéniques. Sur le remplacement, il écrit que l'étude des interactions entre vieillissement, obésité, inflammation et fonction cardiaque "nécessite un organisme entier", et mentionne des analyses complémentaires sur une banque de tissus humains.

Objectifs

L’obésité et le vieillissement augmentent le risque de maladies du cœur. Parmi celles-ci, il existe une forme particulière d’insuffisance cardiaque dans laquelle le cœur pompe normalement mais se remplit mal, appelée insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Cette pathologie est particulièrement fréquente chez les personnes âgées et en situation d’obésité, et reste encore mal comprise et difficile à traiter. L’ostéopontine (OPN) est une molécule impliquée dans l’inflammation et les modifications tissulaires, qui sont augmentés dans l’obésité et les pathologies cardiovasculaires. Ce projet vise à déterminer le rôle de l’OPN et de la sénescence (processus de vieillissement) de certaines cellules immunitaires dans les restructurations cardiaques associées à l’obésité et au vieillissement, et avec l’apparition d’une insuffisance cardiaque. Trois différents modèles de souris sont utilisés, chacun ayant une spécificité vis-à-vis de l’OPN ou de la sénescence, et étudiés notamment sous régime riche en graisses et au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies cardiaques liées à l’obésité et au vieillissement. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de traitement pour des maladies pour lesquelles il existe encore peu de solutions thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris reçoivent une alimentation enrichie en graisses pendant une durée de 16 semaines. Au cours de l’étude, chaque animal bénéficie de trois échographies cardiaques, d’une durée d’environ 5 minutes chacune, réalisées sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins de très faible volume sont également réalisés, à trois reprises au cours de l’étude (environ 1 minute par prélèvement), sur animaux vigiles. Des tests visant à évaluer la régulation de la glycémie sont également effectués. Ces tests consistent en l’administration d’une substance (glucose ou insuline), suivie de six points de prélèvements sanguins répétés sur une durée totale de 2 heures, sur animaux vigiles. Enfin, un prélèvement sanguin terminal est réalisé une seule fois en fin d’étude, sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce projet sont globalement modérés et de courte durée. Aucun phénotype dommageable ni effet indésirable n’est attendu chez les souris transgéniques. Les manipulations nécessaires aux examens (contention, échographie, prélèvements sanguins) peuvent entraîner un stress passager chez les animaux. L’utilisation d’une crème dépilatoire avant l’échographie peut occasionner une légère irritation cutanée transitoire. Les prélèvements sanguins répétés au niveau de la queue peuvent provoquer une gêne locale légère, des saignements transitoires et, plus rarement, la formation d’un léger hématome. La répétition de ces prélèvements peut également entraîner une sensibilisation locale ou une irritation de la queue. Les injections réalisées dans le cadre des tests métaboliques peuvent entraîner une gêne ponctuelle au point d’injection. Certains tests peuvent induire une baisse transitoire du taux de sucre dans le sang, susceptible d’entraîner des signes cliniques tels qu’une diminution de l’activité ou une faiblesse passagère. Le régime enrichi en graisses peut entraîner une prise de poids et des altérations métaboliques, correspondant au phénotype expérimental recherché.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

L’étude des interactions complexes entre vieillissement, obésité, inflammation et fonction cardiaque nécessite un organisme entier avec un système immunitaire fonctionnel et un environnement métabolique intact. Il n’existe pas de modèle in vitro ou silico capable de reproduire fidèlement ces processus systémiques, c’est pourquoi l’utilisation de modèles murins est justifiée scientifiquement. Néanmoins, nous intégrons autant que possible des approches alternatives pour réduire la dépendance aux animaux vivants. Par exemple, nous mènerons des analyses sur des échantillons humains disponibles (banque de tissus myocardiques/adipeux de patients) en complément des données animales. Ces expériences in vitro permettent d’explorer certains mécanismes (voie de signalisation de l’OPN, interactions cellulaires) sans mobiliser d’animaux supplémentaires. De plus, les modèles informatiques et l’analyse de bases de données transcriptomiques publiques seront mises à profit en amont pour affiner nos hypothèses et réduire les explorations in vivo hasardeuses. Ainsi, le recours à l’animal est limité au strict nécessaire, c’est-à-dire pour valider les phénomènes intégrés qu’on ne peut tester autrement (impact global sur la fonction cardiaque, réseau hormonal et immunitaire entier).

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation. Les paramètres étudiés concernent la fonction cardiaque (évaluée par échocardiographie) et le métabolisme (gestion du sucre dans le sang). Sur la base de l’expérience du laboratoire et de la littérature, un effectif de 10 animaux par groupe a été retenu, correspondant au minimum nécessaire pour atteindre la puissance statistique souhaitée. Pour les souris âgées (12 mois), cet effectif est porté à 15 animaux par groupe afin de compenser les pertes attendues liées à l’âge.

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1)Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisse est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. De plus, ce modèle murin présente l’avantage de développer le vieillissement et d’offrir des conditions très reproductibles d’induire une cardiomyopathie métabolique. 2)L’étude des voies impliquées dans le mécanisme de sénescence cellulaire est possible en recourant aux animaux transgéniques. Les animaux déficients pour les gènes d’intérêt de notre étude existent uniquement chez la souris ce qui explique l’utilisation de souris. 3)La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences qui contiennent pour la plupart des protocoles chronophages et des analyses à différents âges parfois tardifs. Les animaux âgés de 5, 8 et 12 mois correspondant respectivement au stade jeune adulte, âge intermédiaire et âge avancé afin de caractériser l’évolution progressive des altérations cardio-métaboliques liées au vieillissement et/ou au régime riche en graisse.

Cinq jours de gavage quotidien, puis une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour y provoquer une lésion musculaire : 2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. S'y ajoutent deux tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prélèvements de sang à la queue, un régime enrichi en lipides dont le porteur indique que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines", et des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. L'objectif déclaré est d'établir un lien de cause à effet entre la graisse logée dans le muscle et deux mécanismes, la régulation du glucose et la régénération musculaire, chez des souris tuées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois selon les groupes. Le porteur justifie le recours à Mus musculus en le décrivant comme "le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature", ce qui permettrait "de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats".

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

2 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gavées une fois par jour pendant cinq jours, reçoivent dans le quadriceps sous anesthésie une injection de glycérol ou de cardiotoxine qui lèse le muscle, subissent des tests métaboliques avec injection intrapéritonéale et prises de sang à la queue, et une partie d'entre elles passe des tests d'agrippement, de cadre inversé et d'endurance sur tapis roulant. Une partie est soumise à un régime enrichi en lipides, dont le porteur écrit que l'inconfort peut durer plusieurs semaines, et les mises à mort sont échelonnées à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois pour prélever les tissus. L'effectif, lui, repose sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant présenté comme difficile à mettre en œuvre avec autant de tests dans la même procédure.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Établir un lien causal entre le tissu adipeux intramusculaire et le métabolisme du glucose conduit à utiliser 2 232 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, des gavages quotidiens pendant cinq jours, des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins caudaux allant jusqu'à 130 microlitres cumulés, une partie étant soumise à un régime enrichi en lipides dont le porteur écrit que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines". La fonction musculaire est évaluée par trois tests nommés, agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois, pour la récolte des tissus. Le porteur écrit qu'un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre ici et qu'il s'est appuyé sur ses "habitudes expérimentales" pour fixer l'effectif.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Pour mesurer l'effet de deux médiateurs lipidiques sur le vieillissement des vaisseaux, 320 souris âgées de deux à vingt-quatre mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un à trois mois, avec un prélèvement de sang hebdomadaire sur animal vigile, la dernière prise de sang étant terminale. Le porteur écrit que "le bien-être animal est au cœur de cette étude" et que les contraintes subies restent faibles, tout en reconnaissant le stress lié à la fréquence des manipulations et la douleur au point d'injection. Aucun analgésique ne peut leur être administré, les antidouleurs modulant l'expression des lipides étudiés, et les souris atteignant un point limite sont tuées.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle de 2 médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système de coagulation. Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation de l’implication du lipide 1 dans le vieillissement vasculaire Axe 2. Evaluation de l’implication du lipide 2 dans le vieillissement vasculaire

Bénéfices attendus

Le choix des lipides à tester (2) ainsi que leur concentration ont été déterminées grâce à nos études in vitro et ex vivo chez l’humain. Brièvement, les lipides circulants dans le sang des humains ont été mesurés et quantifiés en spectrométrie de masse, puis étudiés sur cellules tapissant les vaisseaux sanguins (les cellules endothéliales) in vitro. Cependant, l’effet in vitro est certes significatif, mais ne représente pas la complexité d’un modèle vivant entier. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’impact de ces lipides sur le vieillissement en général, mais aussi vasculaire et à l’échelle multi-cellulaire.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles auront lieu 1 fois par semaine sur 1 à 3 mois selon les groupes

Impact sur les animaux

Nous sommes conscients que la répétition de contentions restreignantes, d'injections IP, et de prises de sang peuvent entrainer des effets indésirables. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Les animaux risquent d'être stressé par le nombre fréquent de manipulation pour les injections en IP (1 à 3 fois par semaine, de 1 à 3 mois). Ils risquent de ressentir une douleur au niveau de l'injection en IP. La prise de sang est terminale sous anesthésie

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’usage de médiateurs lipidiques nécessite l’évaluation de l’efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant mise en place chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le vieillissement sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs. Afin de réduire le protocole, deux études pilotes dans l’Axe 1 et 2 utiliseront chacune 80 souris afin d’optimiser la durée du traitement avec les lipides et le nombre d’injection. Dans l’étude principale #2 et 4, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 10 par groupe experimentale (a

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations de la coagulation par exemple. Les souris utilisées seront de 2 à 24 mois. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (2 mois) et souris vieillissante de 6 à 24mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.

2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Le protocole enchaîne des tests métaboliques avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins à la queue, une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour léser le muscle, un régime enrichi en lipides destiné à rendre les animaux obèses, des mesures de force et d'endurance en isolement, et un transport entre deux établissements. Le porteur reconnaît que l'inconfort lié à l'obésité induite "pourrait durer plusieurs semaines". Il fonde l'effectif sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant jugé difficile à mettre en œuvre, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.