Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
La durée des projets, disponible dans la base ALURES, n’est pas indiquée ici dans la mesure où elle désigne uniquement une durée prévue d’autorisation et n’apporte aucune information sur la durée réelle des projets.
Documents
Niveau de souffrances
Données ajoutées au fil de l’eau au moins une fois par semaine
Création d’une lignée zebrafish mutante pour un gène impliqué dans la reproduction des femelles
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Créer une lignée de poissons zèbres mutants pour un gène de la reproduction, tel est l'objet de ce projet qui utilise 1 050 poissons zèbres dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage passe par la section d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et les femelles peuvent voir leurs pontes se bloquer, ce qui conduit alors à leur mise à mort. Après deux générations, les animaux sont tués pour l'analyse de leurs ovaires, et 100 poissons hétérozygotes sont réutilisés pour maintenir la lignée. Le projet vise à vérifier si l'effet d'un microARN sur la reproduction, déjà observé chez le médaka, se retrouve chez le poisson zèbre.
Objectifs
Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans l’ovaire, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez la femelle médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins d’œufs produits et moins bien fécondés. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse du nombre d’œufs a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les femelles mutantes pondent elles aussi moins d’œufs, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Les microARN sont très bien conservés au cours de l'évolution, et on considère généralement que leurs cibles le sont aussi. Pourtant, aucun modèle expérimental n'a encore démontré cette conservation évolutive des cibles de microARN, ni celle des phénotypes associés à leur régulation. Notre microARN d'intérêt ayant un impact similaire sur les phénotypes reproducteurs chez le médaka et le zebrafish, démontrer une conservation évolutive de ces phénotypes et de leurs gènes cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir de nouvelles voies pour étudier les défauts de fertilité humaine.
Procédures
Ce projet concerne la création d'une lignées mutante. Pour l'établissement de cette lignée, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisée sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthésie du poisson compris. La récolte des oeufs est faite dans l'aquarium, une fois qu'ils sont tombés dans le fond après que le mâle a fécondé les oeufs expulsés par la femelle (il n'y a donc pas manipulation directement sur l'animal pour cette récolte).
Impact sur les animaux
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car nos gènes d’intérêts sont principalement exprimés dans les gamètes. Le gène sera modifié pour empêcher la fixation de son inhibiteur dessus et donc empêcher sa régulation. Nous nous attendons principalement à une réduction du nombre d’œufs pondus. Cependant, chez le médaka, il peut arriver un blocage des pontes lorsque les poissons sont mis en couple (arrêt des pontes par la femelle), caractérisé par une absence d’œufs dans le bassin et un gonflement anormal du ventre de la femelle. Si cet événement venait à se produire chez le zébrafish, un autre male serait d’abord ajouté en première instance, afin de stimuler la femelle. Et si cela ne débloque pas la femelle, et que des modifications de la nage ou de comportement alimentaire venant à apparaitre, une euthanasie sera effectuée. Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. Les anesthésies pratiquées pour les prélèvements (fragment de nageoire) peuvent entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Devenir
Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 100 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet à venir ensuite).
Remplacement
L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre miR‑202 et le gène tead3b sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule sans recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour miR‑202, et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.
Réduction
In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur 6x4 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en F2) et 6x4 individus de génotype sauvage (WT), soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus F0 porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en F1 lorsque les F0 sont croisés avec des animaux WT. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la génération F1 produira une génération F2 homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de la génération F2). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse de l’ovaire des 48 animaux.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Son ovaire est accessible à l'analyse histologique et transcriptomique Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 mois âge de maturité et 6 mois), l’analyse moléculaire, transcriptomique et histologique des ovaires permettant une étude a deux stades de maturité de développement de l’organe.
Etablissement d’une lignée zebrafish mutante pour l’étude d’un gène impliqué dans le succès reproducteur
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Sectionnés d'un fragment de nageoire caudale pour le génotypage puis soumis à un prélèvement de sperme, 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. La lignée mutante créée sert à vérifier si l'inactivation d'un site de fixation d'un microARN réduit la fertilité, comme observé chez le médaka. La plupart sont tués après deux générations pour l'analyse des organes, 75 individus hétérozygotes étant réutilisés pour entretenir la lignée dans un autre projet. Le porteur reconnaît qu'une lignée déjà présente au laboratoire, où ce microARN est désactivé, ne montre aucun effet délétère, ce qui interroge l'ampleur des atteintes attendues ici.
Objectifs
Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans les testicules, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez le male médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins de spermatozoïdes et moins fécondant. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse de la capacité de reproduction du male a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les males mutants ont aussi une baisse la qualité et de la quantité spermatique, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Les miARN, dont celui de l'étude, sont très bien conservés au cours de l’évolution, et il est généralement admis que leurs cibles le sont également. Pourtant, à ce jour, aucun modèle expérimental n’a permis de démontrer clairement une conservation évolutive des cibles de ces microARN, ni une conservation des phénotypes associés à la régulation d’un miARN sur un gène cible. Dans notre cas, le miARN travaillé, chez le médaka et le zebrafish, un impact similaire sur les phénotypes de reproduction, la mise en évidence d’une conservation évolutive des phénotypes et de leurs cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’étude des défauts de fertilité humaine.
Procédures
Ce projet concerne la création d'une lignée mutante. Pour valider une lignée mutante un génotypage par fin clip (section d'un fragment de nageoire caudale) sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Cette procédure est très rapide : moins de 2 minutes par animal, anesthésie et récupération incluses. Les animaux de première génération seront isolés jusqu’à 8 jours maximum, le temps de recevoir les résultats de séquençage du prestataire. Afin d'identifier les poissons, ceux-ci resteront dans des bacs individuels à paroi transparente, permettant un contact visuel avec leurs congénères. Les animaux mutants et sauvages de troisième génération subiront un prélèvement de sperme sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car ce microARN est surtout exprimé dans les gonades. Le gène cible sera modifié pour empêcher la fixation du microARN et donc sa régulation. Nous anticipons principalement une diminution de la fertilité. Dans une lignée déjà présente au laboratoire où le microARN est désactivé, aucun phénotype délétère n’a été observé, nous ne nous attendons donc pas à des effets graves. Cependant, chez le médaka, un blocage des pontes peut survenir (arrêt de ponte par manque de stimulation mâle), caractérisé par l’absence d’œufs et un gonflement abdominal de la femelle, d’où un suivi spécifique des femelles zébrafish. Le génotypage est invasif (petit fragment de nageoire) mais réalisé sous anesthésie pour minimiser les nuisances, pouvant causer une réduction temporaire de l’activité locomotrice. La récolte de sperme est bien maîtrisée et n’entraîne pas d’inconfort notable. Les anesthésies pour prélèvements peuvent modifier temporairement le comportement alimentaire le jour même.
Devenir
Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 75 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet).
Remplacement
L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre un micro ARN et un gène sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour le microARN et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.
Réduction
In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur au moins 12 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en 2ème génération) et au moins 12 individus de génotype sauvage (non mutés) soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus fondateurs porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en 1ère génération lorsque les individus fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype sauvage. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la 1ère génération produira une 2ème génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de cette 2ème génération ). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse des testis d’au moins 24 animaux.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau,densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Le génotypage ainsi que la récolte de sperme se feront sous anesthésie. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l'interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d'œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d'édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Le testicule est accessible à l'analyse histologique et l’analyse de l’expression des gènes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, les testicules permettant une étude au stade de maturité de développement de l’organe.
Etablissement d’une lignée zébrafish mutante pour l’étude du rôle des immunoglobulines de type D dans la réponse immunitaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privés du gène de l'immunoglobuline D par ciseaux moléculaires, les poissons zèbres créés dans ce projet perdent une partie de leurs défenses et deviennent plus sensibles aux infections. 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un génotypage par section d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, geste de moins de deux minutes qui peut réduire son activité de nage et modifier sa prise alimentaire dans la journée. Seuls 50 hétérozygotes de la première descendance sont maintenus pour produire la génération suivante, dont les œufs partiront vers un autre laboratoire pour y être infectés par des virus, les 850 autres étant tués.
Objectifs
Malgré la conservation évolutive dans le système immunitaire de l'immunoglobuline D (IgD), les fonctions spécifiques de cette Immunoglobuline restent une énigme. Le rôle précis de l'IgD lorsqu'elle est exprimée avec d'autres immunoglobulines à la surface des cellules immunitaire (cellules B) n'a été clarifié ni chez les poissons ni chez les mammifères. On pense que l’IgD joue un rôle important dans les muqueuses mais son rôle exact n’est pas encore bien compris. Pour mieux comprendre la fonction de l’IgD nous allons utiliser le modèle poisson zébrafish qui produit aussi ces immunoglobulines D au niveau des cellules immunitaires B. Pour cela, nous créerons deux lignées de poissons-zèbres dont le gène de l’IgD aura été inactivé grâce à la technique des ciseaux moléculaires : les Crispr/Cas9. Dans un deuxième temps et dans un autre laboratoire (nouvelle demande d'autorisation de projet), les poissons mutants seront soumis à des infections virales afin d’étudier les effets de l’absence d’IgD sur leur système immunitaire.
Bénéfices attendus
Malgré la conservation évolutive de l'IgD, les fonctions spécifiques de cette immunoglobuline restent une énigme. C'est pourquoi la génération de mutants de poisson zèbre dépourvus de l'expression de l'IgD serait un outil extrêmement précieux pour comprendre le rôle de l'IgD à la fois lorsqu'elle est sécrétée et lorsqu'elle est co-exprimée avec l'IgM à la surface des cellules. Plus précisément, cela nous permettrait de déterminer comment l'absence d'IgD affecte la réponse immunitaire aux agents pathogènes qui pénètrent dans l'hôte par les voies muqueuses et comment elle conditionne la réponse IgM. Le fait de disposer de ces poissons sera déterminant pour clarifier le rôle immunitaire de cette immunoglobuline énigmatique.
Procédures
Ce projet concerne uniquement la création de 2 lignées mutantes n'exprimant pas le gène de l'immunoglobuline. Pour l'établissement de ces lignées, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudal) sera réalisé sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthie du poisson compris.
Impact sur les animaux
L’inactivation du gène codant l’IgD peut entraîner une altération des fonctions immunitaires. Ainsi: la reconnaissance des microbes et la régulation des cellules immunitaires sont altérées.Les animaux pourraient être un peu plus sensibles aux infections ou au stress environnemental. Cependant, d’autres anticorps (comme l’IgM) peuvent compenser partiellement cette absence, donc les effets ne sont pas toujours graves, mais ils peuvent apparaître dans certaines conditions (infection, changement d’environnement, etc.). Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. L’anesthésie pratiquée pour le prélèvement de fragment de nageoire peut aussi entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Devenir
Ce projet vise à créer 2 lignées mutantes pour étudier le fonctionnement du système immunitaire après l’inactivation de l’Immunoglobuline D. Seuls les 2 x 25 animaux hétérozygotes de la première descendance seront maintenus en vue de la production de la descendance suivante.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du fonctionnement du système immunitaire. Il n’existe donc pas d’alternative à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène IgD dans la fonction des cellules B du système immunitaire et les interactions avec les autres cellules immunitaires.
Réduction
In fine, il s’agit de créer 2 lignées pures (dans la descendance de 2ème génération) présentant une inactivation du gène de l'immunoglobuline D. Pour cela, par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus de la porteurs de mutations intéressantes (génération fondatrice). Au maximum 150 de ces individus atteindront le stade adulte selon les chiffres habituels. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygotes (possédant des copies de gènes différentes) en descendance de 1ère génération lorsque les animaux fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype naturel. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes de la génération de 1ère descendance produira une descendance de deuxième génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif obtenu). Après validation de chacune des lignées, nous produirons et conserverons un minimum de poissons respectant dans le même temps la demande en œufs de cette descendance pure contenant 100 homozygotes mutants complets.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce. Les différents paramètres de suivi sont relevés quotidiennement. Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en densité optimale . Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique de IgD) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien-être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la SBEA sera immédiatement avertie. La procédure de génotypage (permettant d'estimer le taux de mutants) qui consiste en un prélèvement de fragment de très petite taille durera moins de 2 minutes, temps d'anesthésie et réveil du poisson compris.
Choix des espèces
La demande concerne la fourniture de 2 lignées zébrafish présentant une inactivation de gène en vue de test infectieux. Le zébrafish est un poisson osseux qui possède un système immunitaire adaptatif fonctionnel. Le zébrafish exprime les immunoglobulines communes aux mammifères. Dans le cas de zébrafish présentant une mutation de gène, cela permet de réaliser des cribles en conditions infectieuses à grande échelle, ce qui est non réalisable chez les mammifères. De plus, le poisson zèbre est une espèce chez laquelle les outils d’édition de génome peuvent être appliqués de manière simple en raison du très fort taux de fécondité chez cette espèce et du développement rapide : 1 animal mature sexuellement peut être obtenu en 3 mois. Il est possible de produire beaucoup d’individus avec un gène inactivé plus rapidement que chez d’autres modèles vertébrés. Les animaux seront utilisés au stade adulte (pour la génération fondatrice et les animaux de 1ère génération) pour la création de lignée puis les œufs de la 2ème génération seront fournis au demandeur pour la suite des expérimentations (tests ultérieurs d’infection virale non réalisés par notre laboratoire). Au préalable, une vérification du taux de transmission de la mutation sera faite sur des alevins de la 2ème génération âgés de 1 mois. Cela permettra aussi de vérifier la qualité phénotypique et comportementale des individus cette 2ème génération.
Etablissement d’une lignée zébrafish mutante pour l’étude d’un gène impliqué dans la sécrétion ionique par les cellules épithéliales intestinales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis un prélèvement de sperme pour les mâles : 1 050 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet crée une lignée mutante pour un gène exprimé dans l'intestin, absent chez la souris, afin d'observer les effets de son inactivation sur le microbiote. Le porteur indique que 48 poissons seulement seront analysés après leur mise à mort, répartis entre individus mutants et non modifiés. Il ne dit rien du sort des mille autres, au-delà du fait qu'il faut selon lui "un grand nombre d'œufs" pour obtenir la mutation recherchée.
Objectifs
Un nouveau type de cellules a récemment été découvert dans l’intestin chez plusieurs espèces dont l’humain et le poisson-zèbre. Ces cellules pourraient jouer un rôle important dans le fonctionnement de l’intestin en régulant la composition du mucus, le pH et la production de substances antimicrobiennes. Elles pourraient donc avoir un impact sur le microbiote, qui est essentiel à la digestion et à la santé. Cependant, la fonction exacte de ces cellules reste inconnue, car elles ne sont pas présentes chez la souris, un modèle couramment utilisé en recherche. Pour mieux comprendre leur rôle, ce projet vise à étudier le rôle d’un gène (BEST4) spécifiquement exprimé par ces cellules chez le poisson-zèbre. Après modification génétique, l’intestin des poissons sera analysé afin d’observer les éventuels changements dans sa structure et son fonctionnement, ainsi que sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Aucun modèle animal n’a encore été développé pour étudier l’inactivation de ce gène. Ce projet permettra donc de mieux comprendre le rôle de ces cellules récemment découvertes dans l’intestin de nombreuses espèces. Ces nouvelles connaissances sur le fonctionnement de l'intestin pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies digestives, tant chez l’humain que chez l’animal.
Procédures
Les animaux sont des animaux mutants qui seront prélevés pour organes post-mortem. Il s'agit donc de créér une lignée génétiquement modifiée dont les animaux subiront un génotypage et prélèvement de sperme pour les mâles concernés.
Impact sur les animaux
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système digestif, car ce gène est surtout exprimé dans l’intestin. Des modifications pourraient affecter la sécrétion d’ions, l’hydratation du mucus, la régulation du pH et la production de substances antimicrobiennes, ce qui pourrait influencer l’équilibre du microbiote intestinal et, par conséquent, la santé intestinale. Cependant, comme ce gène n’est pas fonctionnel chez la souris sans provoquer de troubles majeurs, il est probable que l’intestin du poisson-zèbre puisse s’adapter en compensant l’absence de ces cellules. Le genotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction de l'activité de nage. La récolte de gamètes est bien maîtrisée et ne génère pas d’inconfort ou de nuisance pour les animaux.
Devenir
Ce projet vise à étudier le fonctionnement de l’intestin après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes.
Remplacement
Les cellules intestinales peuvent être étudiées à l’aide de modèles in vitro. Toutefois, ces modèles ne reproduisent pas encore toute la complexité de l’intestin, notamment la présence d’un microbiote diversifié. Il n’existe donc pas d’alternative aux études sur l’animal pour comprendre le rôle de ces cellules dans l'intestin.
Réduction
Au total, 48 poissons seront étudiés après euthanasie, répartis équitablement entre deux groupes : des individus mutants et des individus non modifiés. Pour obtenir ces poissons, un grand nombre d'œufs doit être produit, car seuls quelques-uns porteront la mutation recherchée. Le nombre strictement nécessaire de poisson sera produit afin de garantir l'obtention des 48 poissons nécessaires aux analyses.
Raffinement
Les poissons seront élevés dans des conditions optimales, adaptées à leur espèce, en veillant à la température, à l’éclairage, à la qualité de l’eau et à la densité des aquariums (30 individus maximum par bac dans un volume de 9.5 litres). Des plantes seront ajoutées pour enrichir leur environnement. Toutes les manipulations, comme la mise en ponte ou l’anesthésie, seront effectuées rapidement afin de minimiser le stress. Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’apparition de symptômes, qu’ils soient liés ou non à la modification génétique, le poisson sera pris en charge par le vétérinaire du laboratoire, qui décidera des mesures à adopter pour préserver son bien-être.
Choix des espèces
Les études sur la physiologie digestive utilisant des techniques de modification génétique sont souvent réalisées chez la souris. Cependant, ce modèle n’est pas adapté ici, car les cellules spécifiquement étudiées sont absentes dans son intestin. Le poisson-zèbre a été choisi car ces cellules sont bien présentes dans son intestin et partagent des caractéristiques similaires avec celles des mammifères. De plus, cette espèce est idéale pour la recherche génétique en raison de sa reproduction très efficace (plus de 200 œufs par femelle), du développement rapide des embryons, et du fait qu’un individu atteint sa maturité en seulement trois mois. Enfin, le poisson-zèbre est déjà largement utilisé pour mieux comprendre le fonctionnement de l’intestin des mammifères. Dans ce projet, les analyses seront réalisées sur des animaux adultes, afin d’étudier l’intestin à un stade de développement mature.
Prélèvements pour la réalisation de génotypage de nos lignées de zebrafish génétiquement modifiées maintenues en élevage
- Recherche fondamentale
- Oncologie
5000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à terme. Chaque poisson subit sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale (fin clip) pour prélever son ADN et le génotyper, puis reste isolé jusqu'à quinze jours. Les individus non retenus sont euthanasiés et ceux conservés comme reproducteurs sont gardés jusqu'à dix-huit mois avant d'être tués à leur tour. Le porteur indique que le travail sur le génome ne peut se faire que sur un "organisme entier" et signale que certaines nouvelles lignées peuvent développer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou un retard de croissance.
Objectifs
L’élevage et le maintien de lignées sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Le prélèvement qui est alors pratiqué est ce que l’on appelle le « fin clip ». Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 3 millimètres de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. Lors de création de nouvelles lignées ou de nouveaux croisements entre mutants, dont nous ne connaissons pas encore la résultante phénotypique, les poissons peuvent pour certains avoir un phénotype qui serait qualifié de dommageable. L’impact que l’on peut avoir aux vues des maladies ciblées vont être des impacts sur la reproduction : retard de croissance, mort subite ou anomalies au cours du développement, diminution de la fécondité, anomalies physiques (déformations de la colonne de type scoliose). Une évaluation de ces observations sera faite en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) pour suivre les animaux et éviter toute souffrance. Une évaluation éthique complémentaire sera alors demandée Ne seront prélevés, que les animaux que nous pensons pouvoir élever par la suite sans impact important sur la nage, la capacité à se nourrir et à se reproduire.
Bénéfices attendus
Le prélèvement tissulaire permet d’accéder à de l’ADN en quantité suffisante pour réaliser un génotypage complet ou pour rechercher les séquences génétiques d’intérêt. Ce travail permet de connaître le génome du poisson et de rapprocher ces informations génétiques des signes cliniques, des modifications histologiques et moléculaires étudiés. Ces corrélations vont permettre de mieux appréhender certaines maladies du système nerveux chez l’Homme.
Procédures
Les animaux ont un prélèvement cutané unique au niveau de la nageoire caudale qui dure moins d’une minute par poisson, inférieur à 3 mm réalisé sous anesthésie, cela nécessite une prise en charge de 3 à 5 minutes par poisson avec la surveillance du réveil. Les poissons demeurent ensuite isolés au plus 15 jours dans des bacs cloisonnés au sein du système commun d’hébergement. Exceptionnellement pour les poissons hébergés dans la pièce de quarantaine, si un prélèvement de ce type doit être réalisé, il suivra le même procédé et l‘isolement aura lieu en dehors du système, dans un aquarium plus petit, dont l’eau sera renouvelée tous les 2 jours après le nourrissage pour en préserver les qualités physico-chimiques.
Impact sur les animaux
Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 3 millimètres va être faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme avant cicatrisation et régénération en 2 semaines. Ils seront maintenus isolés jusqu’à l’obtention des résultats de l’analyse génétique. Cet isolement se fait dans le système pour leur garantir un environnement contrôlé et dure au maximum 15 jours. Si le prélèvement doit avoir lieu en quarantaine, ce qui est très rare, l’isolement se fera en dehors du système avec un changement d’eau tous les 48hrs et au maximum pendant une dizaine de jours. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Si des symptômes en relation avec les manipulations génétiques apparaissaient de manière répétée, nous pourrions avoir l’émergence d’un phénotype dommageable tel que des anomalies au cours du développement (mort prématurée, malformation) ou des signes cliniques visibles une fois le poisson développé (malformations sur la colonne vertébrale (scoliose), des retards de croissance, des absences ou modifications de certaines organes ou fonctions…), ces effets indésirables seront évalués au fur et à mesure des lignées et pourront faire l’objet d’une évaluation éthique complémentaire s’ils semblent s’installer sur une lignée de poisson.
Devenir
Nous ne conserverons que les animaux avec le patrimoine génétique d’intérêt, les autres seront euthanasiés. Ces poissons seront regroupés en fonction de leur génotype et maintenus en tant que reproducteurs pour obtenir œufs et larves d'intérêt. Les animaux seront gardés jusqu'à l'âge de 18 mois, puis euthanasiés.
Remplacement
Le travail sur le génome corrélé à l’expression clinique (symptômes physiques), histologique et moléculaire (analyses des tissus), ne peut se faire que sur un organisme entier. Le poisson zèbre a 70% de son génome qui est commun à l’Homme d’où l’intérêt de pouvoir l’utiliser comme modèle pour la recherche scientifique. Les modifications génétiques sont bien maitrisées dans ce modèle animal et cela permet d’explorer de nouvelles pistes de recherche, et mettre en lumière de meilleures possibilités de traitement pour les maladies qui impliquent ces parties du génome notamment ici les maladies neurologiques.
Réduction
Les poissons génotypés sont les poissons qui sont issus de croisement d’intérêt ou qui ont eu des injections pour modifier leur génome au stade de l’œuf. Nous utilisons un minimum de 10 couples pour maintenir une lignée. Nous entretenons environ 200 lignées. Nous réaliserons ce geste au maximum sur un total de 5000 poissons au cours de ce projet qui doit courir sur 5 ans. En effet le nombre d’œufs par ponte peut être important, mais c’est une espèce qui accuse toujours une perte conséquente d’individus au cours du développement larvaire, et suite aux injections destinées à obtenir les modifications génétiques recherchées. Nous ferons le prélèvement sur les animaux de taille adaptée (corps d’une taille de 2 cm minimum) et qui semblent en apparente bonne santé pour ensuite être destinés à la reproduction. Ces croisements doivent générés des œufs et des larves qui seront inclus dans des recherches sur le développement, le phénotype, le comportement ou encore en imagerie.
Raffinement
L’hébergement est fait dans des aquariums de 3.5L (densité de 20 poissons maximum par aquarium) en groupe constitués à partir des connaissances génétiques et contient un sexe ratio si possible à 50-50. L’eau du système est contrôlée et circule de manière automatisée. Des contrôles indépendants de la qualité de l’eau sont réalisés en plus, régulièrement. Les animaux sont nourris plusieurs fois par jour à la fois avec une nourriture sèche et une nourriture vivante, pour que le comportement de prédation puisse s’accomplir. Les cultures, l’eau et les poissons font l’objet d’un contrôle sanitaire tous les 4 mois. Un cycle lumineux est mis en place 14-10 avec un changement progressif (aube et crépuscule). Un enrichissement visuel est prévu sur les paillasses pour limiter l’éblouissement (sticker de graviers). Lors des mises en accouplement des bacs spéciaux, mimant une plage sont utilisés pour favoriser le fraie et la récupération des œufs. De l’enrichissement social est également disponible à l’animalerie, en élevant des poissons sauvages physiquement différents de manière à pouvoir compléter les effectifs pour éviter les animaux isolés et maintenir les animaux au moins par 3 en conservant la possibilité de les reconnaitre facilement. La biopsie de la nageoire a lieu sur des animaux en apparente bonne santé, ayant atteint un développement (environ 3 mois, taille corporelle de 2 cm) qui limite le risque de l’anesthésie. Les gestes sont réalisés dans le calme et par des personnes formées (tutorat et vérification régulière de la pratique). L’utilisation de l’épuisette se fait avec des mouvements tranquilles et respectueux de l’animal pour limiter le stress. Les conditions environnementales sont adaptées à l’espèce et contrôlées par un système automatique. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Toute anomalie est rapidement signalée, prise en charge et tracée. Si un phénotype dommageable émerge au cours du suivi, il sera évalué, et un avis éthique complémentaire sera demandé.
Choix des espèces
Le zebrafish a une reproduction rapide et efficace qui se déroule à l’extérieur du corps des animaux adultes (ovipares). Les spermatozoïdes du mâle et les ovules de la femelle sont émis de manière concomitante dans le milieu extérieur pour assurer la fécondation qui conduit à la formation des œufs. Ces œufs, puis l’embryon qui s’y développe, sont transparents ce qui permet un accès très facile à ces cellules pour en modifier le génome lors des premiers stades de développement pour obtenir des animaux génétiquement modifiés (mutants, perte ou gain d’ADN). Ce travail va pouvoir être rapproché de ce qui se passe dans le génome humain lors de certaines maladies impliquant la génétique. Ces modifications vont avoir des conséquences moléculaires, cellulaires, histologiques et anatomiques qui vont pouvoir faire progresser les connaissances et aider à l’émergence de nouvelles pistes pour la recherche médicale. Les animaux seront en général prélevés aux alentours de l’âge de 3 mois (exceptionnellement sur des animaux de 2 mois mais ayant atteint une taille suffisante, autrement dit 2cm de long, nageoires non comprises). Cela nous permet d’avoir trié et conservé à un stade précoce, les animaux qui nous semblent en mesure d’assurer la génération d’œufs et de larves pour permettre les recherches scientifiques. Cet âge assure également une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes.
Caractérisation du processus de calcification cardiovasculaire chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à "phénotype nocif". Le porteur indique n'attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu'aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l'animal demeure "crucial".
Objectifs
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d'imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l'excès de teinture - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 30 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 60 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux - 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) - Expérience de 90 jours - les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l'ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l'eau ou par injection intrapéritonéale. - Injection intrapéritonéale avec un temps d'anesthésie inférieur à 5 minutes. - Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L'administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d'absorption. 4. Choc thermique local - Moins de 1 minute pour le choc thermique - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 90 jours (maximum) - Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d'aileron pour le génotypage - Moins de 1 minute par clip d'aileron - Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d'animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu'à l'âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu'à 2 ans après la fécondation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d'alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c'est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d'ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse (histologique, moléculaire)
Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
Réduction
La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l'exigence d'un plus grand nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d'animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d'utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d'animaux demandé est le plus grand nombre d'animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d'utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d'imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d'animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : - Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux - Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d'imagerie qui ne sont pas possibles avec d'autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d'autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d'ablation génétique, font du poisson zèbre l'organisme idéal pour l'expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l'établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l'âge adulte pour comparer l'apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu'aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l'on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).
Analyse fonctionnelle des gènes codant pour les récepteurs aux hormones corticostéroïdes chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Une partie subit des tests de performance comportementale, une autre une exposition de 48 heures à une eau appauvrie en sel qui provoque un déséquilibre osmotique, avant prélèvement des tissus. Le projet utilise des lignées dont les récepteurs au cortisol, l'hormone de stress, sont inactivés, pour comprendre leur rôle. Le porteur relie ces travaux au bien-être des animaux non-humains en élevage et à l'amélioration des méthodes d'aquaculture, bénéfices renvoyés au développement futur d'indicateurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de chaque récepteur au cortisol (hormone de stress) dans la régulation de l’homéostasie ionique et hydrique ainsi que dans des activités comportementales du poisson. L’exposition du poisson à une situation stressante active l’axe corticotrope et conduit très rapidement à la libération de cortisol dans le sang. Ce cortisol va modifier différents processus comportementaux et métaboliques, dont le métabolisme hydrominéral, via des voies de signalisation mettant en jeu les 2 récepteurs au cortisol. Concernant l’homéostasie ionique et hydrique (métabolisme hydrominéral), plusieurs études ont montré le rôle déterminant du cortisol dans la régulation des échanges ioniques et la perméabilité de la branchie, principal organe impliqué dans la régulation de la balances hydrominérale. Par contre, pour des raisons techniques, le rôle des récepteurs au cortisol dans le maintien de l’homéostasie ionique et hydrique est controversé. Plusieurs travaux ont aussi étudié les rôles de ces 2 récepteurs sur le comportement des poissons. Tout comme pour le maintien de l’homéostasie, des résultats contradictoires sont mesurés sur le rôle des récepteurs. Plusieurs travaux suggèrent une notion de complémentarité fonctionnelle des 2 récepteurs et l'hypothèse d'une réponse compensatrice, quand l'un des 2 récepteurs est muté. Mais pour l’instant, rien n’a été clairement démontré. Dans ce contexte, afin de caractériser les rôles respectifs des 2 récepteurs au cortisol dans la régulation des fonctions branchiales (organe-clé de l’homéostasie chez le zebrafish) et des activités comportementales, nous proposons d'utiliser des lignées de zébrafish pour lesquels les gènes codant pour les récepteurs au cortisol sont inactivés et non fonctionnels. Les rôles de ces récepteurs seront étudiés en condition contrôle et lors de stress.
Bénéfices attendus
Des stress en relation avec la qualité d'eau et/ou conditions d'élevage ont clairement des effets néfastes sur l’homéostasie et le comportement du poisson qui peuvent se traduire par une baisse de la productivité et l’établissement de situations de mal-être alors que le bien-être des animaux en élevage est un objectif important pour la profession en réponse à la demande sociétale. Une meilleure connaissance des réponses au stress, que l'on peut obtenir dans cette étude, devrait permettre le développement d’indicateurs biologiques d’état ou d’indicateurs prédictifs de bien-être chez les poissons et le cas échéant de problèmes de santé potentiels. Ces indicateurs seront utiles pour l’amélioration des méthodes d’élevage en aquaculture, pour le choix d'espèces à domestiquer et comme critères phénotypiques dans la sélection pour des caractères d’adaptation à l’environnement.
Procédures
Un nombre de 180 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère une seule fois de 30s pour la plus courte, à 9 minutes pour la plus longue. Un autre nombre de 90 individus seront exposés à une eau appauvrie en sels pendant 48 heures une seule fois. La diminution de la quantité en sels de l’eau se fera progressivement sur 24heures.
Impact sur les animaux
Afin de mesurer les capacités à maintenir leur homéostasie ionique et hydrique, les poissons seront exposés à un stress osmotique: exposition à une eau appauvrie en sel. Ce stress va induire un déséquilibre de la teneur en sels du poisson.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthaniés puis prélevés pour différentes analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n'est pas possible d'étudier in vitro les fonctions des récepteurs sur - 1. le maitien de l'homéostasie ionique et hydrique des poissons, car nous ne disposons pas de lignées cellulaires pour les différents organes et type cellulaires impliqués dans cette fonction - 2. le comportement, parce que les analyses comportementales complexes que nous envisageons ne peuvent être réalisées que sur animal et qui plus est seulement caractérisables chez l'adulte.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre une évaluation statistique de la variabilité individuelle des réponses.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Pour la fonction en relation avec le maintien de l'homéostasie ionique et hydrique, le challenge osmotique aura lieu progressivement et ne durera que 48h, à des concentrations en sels déjà utilisés dans plusieurs autres études publiées récemment. De plus l'eau sera supplémentée en oxygène via un bullage d'air. Pour la partie comportement, un seul test comportemental sera réalisé par jour. En dehors des procédures les poissons seront élevés en groupe dans des structures d'élevage adaptées à l'espèce.
Choix des espèces
Les lignées de zebrafish avec inactivation des récepteurs au cortisol sont appropriées pour notre étude visant à étudier le rôle de chaque récepteur dans le maintien de l'homéostaise ionique et le comportement des poissons. De plus, les mécanismes impliqués dans le maintien de la balance hydrominérale ainsi que les différents traits de comportement sont bien caractérisés chez cette espèce. L'étude sera réalisée au stade adulte afin de mesurer les réponses des 2 sexes.
Étude de la réponse immunitaire innée induite par des bactéries pathogènes chez le vertébré Danio rerio (zebrafish).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
70 610 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 64 410 d'entre eux, la plupart tués en fin d'expérience et quelques adultes gardés vivants pour la reproduction. Aux stades embryonnaire et larvaire, ils sont infectés par des bactéries pathogènes et observés par transparence, puis mis à mort par surdose d'anesthésiant. Le porteur présente le recours au poisson zèbre comme relevant lui-même du "Remplacement" des mammifères, tout en déclarant plus de 64 000 individus en souffrance sévère. Il affirme que l'usage d'animaux reste "incontournable", une cellule ne pouvant reproduire un organisme entier.
Objectifs
Les maladies infectieuses affectent les personnes et les animaux avec un impact considérable sur les économies mondiales et la santé publique. La résistance aux antimicrobiens est responsable des échecs de traitement entraînant une estimation de 700.000 décès humains chaque année dans le monde (OMS, 2018). Il donc est urgent de résoudre ce problème croissant en développant des thérapies alternatives. Comprendre comment les infections affectent les organismes vivants est une étape importante pour le développement de ces thérapies . Cependant, elle nécessite de travailler avec des modèles animaux. Afin d’adopter la stratégie 3R (Remplacement, Raffinement et Réduction) pour ses travaux, ce projet implique l’utilisation du zebrafish (Danio rerio) (Remplacement). Le zebrafish a été choisi car l’étude de son embryon offre de nombreux avantages pour l’étude de certaines maladies infectieuses. En effet, du fait de sa transparence, nous pouvons l’observer directement sous un microscope pour suivre sa réponse immunitaire aux infections à différents temps sans avoir à l’euthanasier. Ceci permet de Réduire de façon substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour mener convenablement les études. De surcroit, de très nombreux outils expérimentaux sont disponibles, comme par exemple, des lignées de zebrafish où l’on peut observer directement les cellules qui luttent contre les infections avec un microscope. Ces outils permettent de Raffiner les expériences et donc d’obtenir des résultats beaucoup plus robustes et statistiquement plus significatifs. Le but du présent projet est de : -comprendre le developpement d’une infection induites par des microbes impliqués dans des maladies humaines - étudier et comparer la nocivité des différentes bactéries, c’est-à-dire comprendre comment ces bactéries infectent les organismes vivants (animaux), survivent et se développent dans ces organismes, -identifier les facteurs microbiens impliqués dans ces processus -identifier les gènes de l’hôtes impliqués dans la défense contre les bactéries -identifier des médicaments ou therapies permettant lutter contre les infections bactériennes.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est d’apporter des solutions thérapeutiques à des problèmes clefs du domaine des infections bactériennes. A couts terme, le projet fournira des connaissances fondamentales sur le développement des maladies infectieuses. Ces connaissances seront plubliées dans des revues scientifiques spécialisées permettant la diffusion de la science. Les différents microbes que nous étudierons ont en commun la capacité de survivre dans l’organisme qu’ils infectent, leur permettant ainsi de persister à long terme, conduisant à des infections chroniques. Ce projet permettra de comprendre comment les microbes échappent aux défenses immunitaires de de l’organisme hôte et nous identifierons les molécules produites par l’agent infectieux qui sont importantes pour la persistance du microbe dans l’organisme hôte. Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet permettront à moyen terme d’identifier des molécules pouvant être ciblée par de futurs traitements anti-microbiens. A plus long terme de nouveaux medicaments anti-bactériens seront developpés pour traiter des patients atteints d’ infections chroniques.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux de plus de 5 jours de développement sont les suivants : - Immobilisation sous anesthésie générale dans de l’eau à 28°C dans une boite avec un fond en verre pour l’observation avec un microscope, au stade 6 à 17 jours de développement sur une durée courte inferieur à 1h ou sur une longue durée (entre 1 et 15 heures au cours de la nuit). Cette intervention lorsqu’elle est courte (inférieur à 1 h) pourra être répétée une fois chaque jour jusqu’à 17 jours (n total= 46 800 embryons et larves).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont les suivantes : -Pour les embryons ayant subies une infection, les microbes présents dans l’organisme peuvent induire une infection aigue ou chronique. Du fait de l’infection, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement. - Pour les embryons traités avec des médicaments, si la dose n’est pas adaptée, elle peut induire des effets secondaires sur l’organisme. Si tel est le cas, l’animal peut ressentir des effets nuisibles et changer de physiologie ou de comportement La surveillance régulière des embryons par simple observation permettra de détecter ces changements dès leur apparition, la prise de nourriture et les mouvements de nage seront surveillés.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort, soit en fin d’expérience, soit en cours d’expérimentation pour tout animal qui, présente un état prédictif d’une grande douleur ou d’une mort prochaine. Pour la mise à mort, les animaux seront traités tout d’abord avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée pour atteindre une dose léthale et induire la mort. Les animaux morts seront ensuite traités avec de l’eau de javel (lorsque l’animale est infecté par un microbe), puis ils seront ensuite congelés à -20°C et éliminés comme des déchets biologiques et incinérés. Pour l’étude des gènes importants dans la défense contre les bactéries, seuls les animaux porteurs des modifications génétiques permettant l’inactivation du gène d’intérêt, seront maintenus dans notre animalerie pour constituer le stock d’animaux reproducteurs, c’est-à-dire qui seront uniquement utilisés pour des accouplements afin d’obtenir des embryons. Ces animaux seront gardés sous observation quotidienne jusqu’au stade adulte et pendant les deux premières années afin de déceler toute anomalie et détecter tout signe de maladie afin de prévenir une soufrance ou une mort éventuelle par une mise à mort.
Remplacement
Une cellule ne pouvant reproduire la complexité d’un organisme entier, pour l’instant, l’utilisation des animaux reste incontournable. Aujourd’hui, aucun des modèles animaux disponibles pour l’étude de l’inflammation et des infections faisant l’objet de ce projet ne permet de combiner à la fois : 1) l’induction d’une véritable infection induisant le développement d’une maladie proche de celle observée chez l’homme 2) la possibilité d’une évaluation rapide de l'efficacité des médicaments en visualisant leur effet sans mettre à mort l'animal grâce notamment aux techniques d’imagerie des organismes vivants par transparence. Le développement du modèle animal zebrafish reste donc un choix incontournable. Il offre ainsi une alternative tres intéressante aux modèles mammifères permettant ainsi le Remplacement. En effets les infections ainsi qu’une grande partie des observations faites sur l’animal seront realisées avant le stade de 5 jours de développement.
Réduction
La transparence intrinsèque des embryons et des larves de zebrafish permet de décrire et de suivre les infections en temps réel par transparence, à differents temps sans avoir à euthanasier l’animal et donc de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, les adultes assurant uniquement la production d’œufs. Pour des raisons de reproductibilité, chaque expérience est reproduite 3 fois de façon indépendante, avec un nombre minimal d’individus à utiliser pour chaque expérience. Les tests statistiques et le nombre de poissons pour chaque experience ont été determinés grâce aux données bibliographiques. Par la suite, le nombre d’animaux sera réajusté au cours du projet grâce à des logiciels de statistique permettant d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tous nos poissons font l’objet d’une surveillance quotidienne (y compris les week-ends et jours fériés) par du personnel qualifié et avec roulement d’astreinte. Pour les larves de zebrafish, la surveillance est basée sur l’observation par transparence de plusieurs paramètres physiologiques comme la presence d’une bonne circulation sanguine, la mesure du rythme respiratoire ou autre symptômes anormaux. Pour les adultes, la surveillance est basée sur l’observation de changements du rythme respiratoire, de leur comportement, et d’une réponse de stress, ainsi que l’observation des signes externes de maladies. Les individus présentant des caracteristiques anormales seront automatiquement mis à mort avec un anesthésiant puis la dose d’anesthésiant sera augmentée jusqu’à une dose léthale pour induire la mort. Tout au long des expériences, les embryons et les larves de zebrafish sont maintenus à la température optimale de 28°C avec un cycle jour/nuit. La qualité de l’eau est surveillée afin de presenter en permanence les paramètres en sel et de pH optimaux. Nous contrôlons qu'ils ne soient pas maintenus en trop forte densité et que les individus ayant des caractéristiques anormales soient mis à mort systématiquement. Les larves maintenues au dela de 5 jours auront un milieu enrichi en micro-organismes. Tout geste technique sera réalisé avant 5 jours de développement et sous anesthésie générale. Des réunions concernant l’animalerie et la surveillance des poissons sont organisées régulièrement et permettent de faire évoluer le système de suveillance des animaux et de raffinement.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le zebrafish (Danio rerio). Les nouvelles techniques rendent le zebrafish pertinent pour le Remplacement des mammifères pour l’étude de l’inflammation et des maladies infectieuses notamment grâce à sa transparence et à l’utilisation d’imagerie en temps réel qui permettent de Réduire le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement bons. De plus, l’existance de nombreux outils expérimentaux permettant de suivre facilement les cellules immunitaires marquées par transparence permettent de Raffiner les études. Par rapport au modèle souris, le zebrafish répond donc parfaitement aux besoins de Remplacer, de Réduire et de Raffiner. Par sa taille, le zebrafish se révèle attractif pour la découverte de nouveaux médicaments . Pour les expériences de test de médicaments et d’infections, nous utilisons des embryons et des larves de zebrafish. Tous les gestes techniques sont effectués avant le stade 5 jours. Une partie des analyses se font sur des embryons et larves dont les stades ne dépassent pas 5 dpf et qui ne nécessitent donc pas de répondre à un protocole soumis au comité d’éthique. Seules certaines larves font l’objet d’un suivi plus long, notamment pour l’étude des infections persistentes au-delà de 5 jours. Aucune infection n’ est réalisée sur le stade adulte. Donc en fonction de l’analyse realisée, nous utiliserons des larves de différents stades de developement : du stade 1-cellule (0 jour de développement) à 17 jours de développement. Seules certaines larves etudiées en microscopie seront maintenues en vie jusqu’à 1 mois. Pour l’obtention d’animaux portant une modification génétique permettant l’étude des gènes importants pour la réponse immunitaires, les animaux sont elevés jusqu’à l’age adulte mais ne subissent aucune infection. S’ils portent la modification génétique d’intérêt, ils seront maintenus dans l’animalerie pour assurer la reproduction et pour produire des œufs.