Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées : projets autorisés en janvier 2026 (02/02/2026)
Etude du rôle des leukocytes dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Objectifs
La naissance prématurée est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Les infections maternelles pendant la grossesse peuvent déclencher une réaction inflammatoire qui favorise l’accouchement prématuré et fragilise le cerveau du fœtus. Cette inflammation peut entraîner des lésions cérébrales, appelées encéphalopathie du prématuré, responsables de troubles du développement, notamment des difficultés sociales. Dans cette étude, nous cherchons à comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires du cerveau (microglie) et de cellules immunitaires circulantes (neutrophiles) dans ces lésions et leurs conséquences à long terme. Pour cela, nous utilisons un modèle murin, qui reproduit la période de vulnérabilité cérébrale du troisième trimestre de grossesse chez l’humain. Nous provoquons une inflammation précoce et étudions l’impact de la présence ou de l’absence des neutrophiles sur le développement du cerveau et sur le comportement social ultérieur des animaux.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle murin mimant un syndrome inflammatoire avec une atteinte cérébrale, nous évaluerons l’impact de la présence des cellules immunitaires circulantes dans le cerveau sur les autres types cellulaires réactifs à l’inflammation. Les répercussions sur le comportement social seront également étudiées. Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension du rôle de ces cellules immunitaires dans la modulation de l’inflammation cérébrale au cours du développement. Ces résultats permettront de déterminer si leur présence favorise la résolution de l’inflammation ou, au contraire, en aggrave les conséquences. À terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et à améliorer la prévention ou la prise en charge des troubles du neurodéveloppement et des pathologies associées à la neuroinflammation chez l’être humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections d’une substance induisant une inflammation au niveau de l’abdomen deux fois par jour sur animaux éveillés durant les 4 premiers jours de vie et une fois le 5ème jour de vie. A l’âge adulte, des tests comportementaux seront réalisés.
Impact sur les animaux
Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cette substance inflammatoire peut engendrer des signes de déshydratation, un retard de croissance, une perte de poids et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ jusqu’à la fin de leur 2ème semaine de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Les retards de croissance et de pousse du pelage sont rattrapés au fur et à mesure après la 2ème semaine et ne sont plus visibles par la suite. A l’âge adulte, les animaux peuvent présenter une modification de leur comportement et des troubles de la respiration.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt, à savoir au 5ème et 10ème jour de vie pour les analyses développementales du cerveau et à 2 mois pour les analyses comportementales chez l’adulte.
Remplacement
Pour comprendre l’inflammation du cerveau, ses conséquences et les moyens de la traiter, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant complet. En effet, seule une approche chez l’animal permet de reproduire les interactions complexes du cerveau à différents stades du développement.
Réduction
Le nombre minimum de 6 animaux par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel spécialisé afin de garantir des résultats fiables. Pour les groupes exposés à l’inflammation, nous prévoyons 10 % d’animaux en plus pour compenser une mortalité connue. Chaque type d’analyse nécessite une préparation spécifique, ce qui implique que les prélèvements d’un même animal ne peuvent pas être utilisés pour plusieurs analyses différentes.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout et avec cabane pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles de la souche choisie ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal vigile sans nécessité d’anesthésie. Le sevrage est effectué 21 jours après la naissance avec un maximum de 6 animaux par cage. À la phase aiguë, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance hebdomadaire pour observer une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Ce modèle murin d’inflammation a déjà été utilisé par notre équipe pour étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation. De plus, les souris utilisées présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que la taille des portées, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère. Les animaux seront injectés avec une substance inflammatoire durant leur première semaine de vie afin de provoquer une inflammation cérébrale périnatale, puis étudiés à 2 stades de développement : 5ème et 10ème jour de vie et à 2 mois correspondant au stade adulte. L’étude permet d'étudier l’effet des cellules immunitaires circulantes infiltrées dans le cerveau sur le contexte inflammatoire qui perturbe le développement cérébral mais également les conséquences sur le comportement au stade adulte.
Etude des effets de la supplémentation en mélatonine sur des anomalies des cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Objectifs
La naissance prématurée est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Les infections maternelles pendant la grossesse peuvent déclencher une réaction inflammatoire qui favorise l’accouchement prématuré et fragilise le cerveau du fœtus. Cette inflammation peut entraîner des lésions cérébrales, appelées encéphalopathie du prématuré, responsables de troubles du développement, notamment des difficultés sociales et des troubles du spectre autistique. Dans cette étude, nous testons la mélatonine comme moyen d’améliorer le contexte neuroinflammatoire durant le développement en étudiant certaines populations cellulaires caractéristiques (microglie et astrocyte). Pour cela, nous utilisons un modèle murin, qui reproduit la période de vulnérabilité cérébrale du troisième trimestre de grossesse chez l’humain. Nous provoquons une inflammation précoce et étudions l’effet de la mélatonine sur le développement du cerveau et sur le comportement social ultérieur des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour ambition d’étudier le potentiel protecteur de la mélatonine sur le développement du cerveau dans un contexte inflammatoire précoce similaire à ce que l’on retrouve chez les nouveau-nés prématurés. L’objectif est de déterminer si la mélatonine peut rétablir un environnement cérébral favorable au développement normal et ainsi limiter les altérations cellulaires et comportementales causées par l’inflammation précoce.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections d’une substance induisant une inflammation au niveau de l’abdomen deux fois par jour sur animaux vigiles durant les 4 premiers jours de vie et une fois le 5ème jour de vie. L’acte de l’injection dure quelques secondes et les animaux sont directement remis dans leur cage avec leur mère. Ces injections ont pour but de créer un contexte inflammatoire chez le souriceau afin de modéliser l’inflammation du cerveau observée chez les nouveau-nés prématurés. A l’âge adulte, des tests comportementaux pour évaluer le comportement social seront réalisés.
Impact sur les animaux
Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cette substance inflammatoire peut engendrer des signes de déshydratation, un retard de croissance, une perte de poids et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ jusqu’à la fin de leur 2ème semaine de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. A l’âge adulte, les animaux peuvent présenter une modification de leur comportement et des troubles de la respiration.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt, à savoir au 5ème et 10ème jour de vie pour les analyses dévelopmentales du cerveau et à 2 mois, après les analyses comportementales chez l’adulte. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale. En particulier, une population de cellule immunitaire spécifique du cerveau sera étudiée car cruciale dans les mécanismes liés à l’inflammation et au développement du cerveau.
Remplacement
Pour comprendre l’inflammation du cerveau, ses conséquences et les moyens de la traiter, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant complet. En effet, seule une approche chez l’animal permet de reproduire les interactions complexes du cerveau à différents stades du développement.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel spécialisé afin de garantir des résultats fiables. Pour les groupes exposés à l’inflammation, nous prévoyons 10 % d’animaux en plus pour compenser une mortalité connue. Chaque type d’analyse nécessite une préparation spécifique, ce qui implique que les prélèvements d’un même animal ne peuvent pas être utilisés pour plusieurs analyses différentes.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout et avec cabane pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal vigile sans nécessité d’anesthésie. Durant toute la procédure d’injection, on surveillera quotidiennement la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance clinique bi-hebdomadaire pour observer une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Une surveillance accrue des animaux en difficulté est mise en place mais si l’un des points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Ce modèle murin d’inflammation a déjà été utilisé par notre équipe pour étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation. De plus, les souris utilisées présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que la taille des portées, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère. Les animaux seront injectés avec une substance inflammatoire durant leur première semaine de vie afin de provoquer une inflammation cérébrale périnatale, puis étudiés à 2 stades de développement : 5ème et 10ème jour de vie et à 2 mois correspondant au stade adulte. L’étude permet d'étudier l’effet de la supplémentation en mélatonine sur le contexte inflammatoire qui perturbe le développement cérébral mais également les conséquences sur le comportement au stade adulte.
Développement d’une méthode utilisant les isotopes stables du carbone et de l’azote comme indicateur de l’efficacité alimentaire chez le bar et la dorade
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Autres poissons : 100
Objectifs
L’objectif du projet est de développer une méthode pour mesurer l’efficacité alimentaire ( le poids de nourriture ingéré divisé par le gain de poids ) d’un poisson d’aquaculture en utilisant des marqueurs naturellement présents dans les aliments. Pour cela, le projet combine deux types de mesures : La quantité de nourriture mangée par chaque poisson, obtenue grâce à des vidéos de poissons élevés en petits groupes. La vitesse à laquelle ces marqueurs passent de l’aliment au poisson. L’analyse vidéo permettra de savoir précisément combien chaque poisson mange. En y ajoutant la mesure de sa croissance, on pourra calculer son efficacité alimentaire individuelle. Avant l’expérience, les poissons seront habitués à un aliment A. Pendant l’évaluation, ils recevront un aliment B. Ces deux aliments auront des compositions différentes (par exemple des proportions différentes d’huile ou de farine de poisson), ce qui leur donnera des signatures distinctes pour les marqueurs étudiés. Ces signatures seront ensuite mesurées dans différents tissus des poissons, comme les écailles ou les nageoires, grâce à une technique d’analyse spécialisée. Enfin, on vérifiera s’il existe un lien entre la manière dont chaque poisson absorbe ces marqueurs et sa capacité à utiliser efficacement la nourriture.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle méthode pour évaluer l’efficacité alimentaire, basée sur l’analyse de la façon dont les poissons absorbent certains marqueurs naturels présents dans l’aliment, permettra d’estimer facilement les performances individuelles de plusieurs milliers de poissons élevés en groupe. Grâce à un simple changement d’aliment et à un prélèvement léger de tissu (comme des écailles ou une nageoire), il sera possible de mesurer l’efficacité alimentaire des bars et des dorades. Cette approche rendra plus simple et plus pratique la sélection des poissons qui utilisent le mieux leur nourriture. Ainsi, il deviendra possible de mettre en place une sélection ciblée dans une ferme pour choisir les animaux les plus performants et améliorer ce caractère sur le plan génétique. Améliorer l’efficacité alimentaire apporte à la fois des avantages économiques (réduction du coût de l’alimentation) et des bénéfices environnementaux (moins de rejets dans le milieu naturel).
Procédures
Pour réaliser ce projet, les animaux seront prélevés à trois reprises d'un bout de nageoire et d'écailles. Chacun de ces prélèvements prend moins d'une minute et sera réalisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Le projet n'implique qu'une procédure légère. Les petites blessures causées par les prélèvements d’écailles ou de fragments de nageoires guérissent rapidement. En quelques semaines, les poissons régénèrent entièrement les zones prélevées. Les prélèvements répétés sur les nageoires n’ont pas d’effet négatif sur leur façon de nager. Les prélèvements de nageoires sont réalisés avec un emporte-pièce de petite taille (3 mm de diamètre), ce qui permet une repousse complète du tissu en moins de deux semaines. Ces prélèvements auront lieu aux mois 0, 1 et 3. Enfin, chaque poisson sera identifié grâce à une petite puce d’identification, ce qui permettra de suivre ses performances individuelles tout au long de l’étude.
Devenir
Tous les poissons seront euthanasiés à l'issue de la procédure. La réutilisation et le replacement de ces individus n'est pas possible. Leurs fonds génétiques restreints ne permettent pas de les relacher dans le milieu naturel.
Remplacement
Ce type d'expérimentation, où la variation observée et recherchée est liée à l'individu, ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n'y a donc pas de remplacement possible. La mesure de l'efficacité alimentaire (ingéré/gain de poids) est un caractère complexe mettant en jeu une multitude de mécanismes comme la capacité à assimiler les nutriments, le métabolisme énergétique, l'activité de nage des poissons, la microflore intestinale. Ce caractère complexe étudié au niveau individuel n'a pas d'alternative non animale disponible du fait de ses nombreuses composantes et des variabilités individuelles qu'explore l'étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes sur le bar pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés. Les modèles linéaires qui serviront à analyser les données de corrélation entre l'efficacité alimentaire individuelle et la signature isotopique des tissus prélevés seront réalisés à partir d'un logiciel de statistique.
Raffinement
Pour limiter la souffrance et l'angoisse des animaux, toutes les mesures individuelles et tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie profonde. Les prélèvements de nageoire et d'écailles seront réalisés à chaque fois à une localisation différente. Tout au long de l'expérimentation, les poissons seront hebergés entre congénères et seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Le bar et la dorade sont deux espèces majeures en aquaculture et pour lesquels la question de l'efficacité alimentaire se pose avec un vif intérêt. Ces élevages consomment aujourd'hui, à quantité de production égale, près de deux fois plus d'aliments qu'un élevage de truite ou de saumon. Les animaux seront au stade juvénile (entre 50 et 200g de poids moyen) pour pouvoir mesurer des croissances significatives.
Étude du contrôle moléculaire du développement des vaisseaux lymphatiques et de leurs fonctions chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques ont pour fonction le nettoyage des tissus en drainant les fluides et les déchets dans les différents organes. Ils participent aussi à la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons aux vaisseaux lymphatiques autour du système nerveux central. Ils sont capables de drainer les débris, les antigènes cérébraux et le liquide céphalorachidien. Leur implication a été démontrée dans de nombreux modèles de pathologies neurologiques. Ce réseau se développe après la naissance chez la souris et est à l’heure actuelle peu étudiée. Nos objectifs sont d'étudier le développement postnatal des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau et d'identifier les mécanismes qui contrôlent leur fonction.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser la mise en place des vaisseaux lymphatiques et leur fonction. Les mécanismes biologiques seront caractérisés dans le but développer des outils moléculaires capable de moduler les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques méningés et de la réponse immunitaire. À long terme, les informations recueillies grâce à ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies pour les troubles neurologiques.
Procédures
Injections de molécules sur souris vigiles : entre 1-15 injections, durée geste: entre 1 et 10 min. Incisions cutanées et injections sous anesthésie : 1-2 injections, durée geste: entre 10 et 15 min
Impact sur les animaux
L'anesthésie, les instillations intranasales et les injections de modulateurs et de traceurs peuvent provoquer une légère douleur et un certain stress au moment de leur administration. Les incisions cutanées peuvent entraîner une irritation modérée pendant les deux heures séparant le réveil de l'anesthésie de la mise à mort des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études des vaisseaux lymphatiques méningés et du cerveau des animaux.
Remplacement
Les médiateurs de croissance des vaisseaux lymphatiques que nous caractériserons dans ce projet ont été sélectionnés parmi un ensemble de médiateurs candidats en fonction de leur capacité à moduler de manière reproductible la migration des cellules endothéliales lymphatiques in vitro. Afin d'étudier leur rôle spécifique dans le drainage lymphatique cérébral et leur potentiel thérapeutique, le recours à des modèles animaux est indispensable. Cependant, à chaque fois que ce sera possible, l’étude des mécanismes moléculaires identifiés in vivo sera approfondie sur des cellules lymphatiques in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichie. Ils sont anesthésiées pour toute intervention. Nous avons défini une grille de score avec des points limites adaptés. En cas d'une altération modérée ne répondant aux critères de mise-à-mort, les soins à apporter seront définis avec la personne responsable du bien-être animal. Pour les incisions cutanées, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant thermostatée. Du gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter l’assèchement. Les souriceaux seront placés dans une chambre de réveil chauffée et hydratée afin de faciliter leur rétablissement post-opératoire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes moléculaires du remodelage et de fonction lymphatiques. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. L’existence de modèles génétiques permettant de visualiser les vaisseaux lymphatiques et d’inactiver de manière temporelle et spatiale des gènes d'intérêt fait de la souris le modèle de choix pour décrypter les mécanismes contrôlant les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques. Les souris seront analysées à différents jours après la naissance et chez l’adulte pour étudier les effets de nos gènes d’intérêt et/ou des agents activant ou bloquant les voies de signalisation impliquées dans la mise en place et le maintien du réseau vaisseaux lymphatiques.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de l’immunité maternelle sur les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le CMV, à différents niveaux d’analyse : aux niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences neurologiques pendant la période postnatale précoce, et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques. MODIFICATION : L’étude de deux traitements supplémentaires nécessite une modification du projet initial, avec l’ajout de 832 animaux.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h après l’injection. Après plusieurs jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Autour du 30e jour postnatal, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anesthésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Au stade adulte, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système sans fil permettant d’enregistrer les activités corticales. Ces explorations fonctionnelles (durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage. MODIFICATION : Deux traitements supplémentaires visant à éliminer un type cellulaire précis dans les cerveaux en développement sont pratiqués mais ils ne modifient pas les nuisances décrites ci-dessus : d’une part, un composé ajouté à la nourriture est administré pendant 4 jours consécutifs aux femelles gestantes ; d’autre part un composé est mélangé au CMV pour injection dans les cerveaux embryonnaires.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h post-injection. Après plusieurs jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, une inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide et le test de retournement. A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neuropathologiques des infections congénitales par le CMV reposent sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral, ceci dans un contexte de grossesse et d'un statut immunitaire maternel modifié. Il est évident que la plupart de ces évènements, leur évolution, ainsi que leur complexité et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (coupes cérébrales), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, qui sont consignées dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures sont quotidiennes pendant les 2 premières semaines postnatales. Au delà, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’au 20e jour postnatal, puis 1 fois par semaine jusqu’au sevrage (au 30e jour postnatal). Ensuite, les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 individus par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine. Au stade adulte, les tests comportementaux seront effectués, ils seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro sera réalisée autour du 15e jour postnatal, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés autour du 30e jour postnatal, une période classiquement utilisée pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats (40e jour postnatal et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements électro-encéphalographiques sur plusieurs jours consécutifs.
Mise en évidence de gènes clés dans la réplication du parasite responsable du paludisme.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 150
Objectifs
Malgré de nombreux efforts depuis des décennies, le paludisme reste un problème de santé majeur dans le monde. Il touche environ 100 pays, et 40 % de la population mondiale vit dans des zones à risque. En 2020, on a recensé 241 millions de cas, entraînant 627 000 décès, principalement chez les enfants de moins de 5 ans. Le paludisme est causé par un parasite appelé Plasmodium, qui a besoin de deux hôtes pour survivre : un moustique du genre Anopheles et l’être humain, dans le cas du paludisme humain. Chez ce dernier, le parasite se multiplie dans les globules rouges, provoquant les symptômes de la maladie. Bien qu’il existe des médicaments, leur efficacité diminue à cause de l’apparition de résistances. Il est donc crucial de mieux comprendre ce parasite pour développer de nouveaux traitements. Notre projet vise à étudier comment le parasite contrôle son cycle de vie et se développe dans les globules rouges. Nous cherchons à identifier les gènes clés impliqués dans sa multiplication. Pour cela, nous allons créer des parasites fluorescents, puis les modifier afin de bloquer l’expression de certains gènes. Cela nous permettra de comprendre leur rôle et d’identifier de nouvelles cibles pour lutter contre le paludisme. Nous utiliserons Plasmodium berghei, un parasite qui infecte les rongeurs. Il est très similaire à Plasmodium falciparum, le plus dangereux pour l’Homme. De plus, il permet de mener des expériences en laboratoire qui sont impossibles à réaliser avec Plasmodium falciparum. Grâce à une technique innovante de transformation des parasites, nous pourrons réduire drastiquement le nombre d’animaux nécessaires, tout en obtenant des résultats robustes qui permettront d’ouvrir de nouvelles voies de lutte contre cette maladie toujours aussi dramatique.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels contre le paludisme ne sont plus assez efficaces, car les parasites deviennent de plus en plus résistants. Il est donc urgent de trouver de nouveaux médicaments pour éliminer cette maladie. Pour cela, il faut chercher des solutions innovantes et viser de nouvelles cibles afin de limiter l’apparition de résistances. Notre projet va aider à mieux comprendre la biologie du parasite responsable du paludisme, d’abord chez la souris, puis chez l’Homme.Cette meilleure compréhension pourrait permettre de découvrir de nouveaux moyens de lutter contre le paludisme, surtout dans les pays où la maladie est très présente et où les résistances augmentent.
Procédures
Dans chacune des procédures, les animaux seront infectés par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles ; il s’agit d’une injection unique. Tout au long de l’infection, environ 8 jours, un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue sera réalisé, de manière journalière. Cette procédure ne prend que quelques secondes, et correspond à un prélèvement identique à celui de la glycémie. Finalement, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et un prélèvement total du sang sera fait de manière post-mortem. Au total, 2 822 souris et 150 rats seront injectés vigiles, monitorés par prélèvements sanguins et euthanasiés dans cette étude.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un léger stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection ou du prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue, sur animaux vigiles. Lors de notre étude, nous atteindrons uniquement une faible parasitémie (correspondant au nombre de globules rouges infectés sur la totalité des globules rouges). À ce niveau-là, aucun signe clinique n’est à prévoir. Cependant, dans les cas rares de paludisme cérébral, la parasitémie reste faible, mais les souris peuvent développer des signes cliniques tels que : l’apparition de mouvements du corps désordonnés ou mal contrôlés, puis paralysie partielle allant jusqu’au coma irréversible.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures, pour récupérer le sang contenant les parasites pour la suite des analyses in-vitro.
Remplacement
Plasmodium falciparum est le parasite responsable du paludisme le plus dangereux pour l’Homme. Pour bien comprendre comment il vit et se développe, il faudrait l’étudier directement dans un organisme vivant, mais cela est très difficile. Cependant, il existe un parasite très proche, Plasmodium berghei, qui infecte les rongeurs et que l’on peut étudier de manière in vivo. Cela permet de mieux comprendre le cycle de vie du parasite et donc de pouvoir lutter plus efficacement contre la maladie. Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer complètement l’étude sur les rongeurs, mais nous faisons d’abord le plus d’expériences possibles en laboratoire pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Pour limiter l’utilisation d’animaux dans nos recherches, nous avons mis en place une méthode innovante permettant d’étudier plusieurs gènes en une seule expérience. Plutôt que de tester un gène à la fois, nous pouvons désormais modifier une centaine de gènes en une seule étape, en infectant un seul groupe de souris, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. De plus, Plasmodium berghei infecte systématiquement les rongeurs, ce qui nous permet d’optimiser nos expériences en utilisant le strict minimum d’animaux. Le nombre de rongeurs est calculé en fonction de la quantité de globules rouges infectés dont nous avons besoin pour nos analyses.
Raffinement
Avant l’expérimentation, durant toute la période d'acclimatation d'une durée d'une semaine minimum, les souris sont manipulées de manière journalière pour éviter un stress lors de l'expérience. Lors des expérimentations, les animaux seront manipulés et injectés le plus rapidement possible, de manière à les remettre avec leurs congénères rapidement, et ainsi éviter un trop grand stress d’isolement. Lors de notre étude, nous nous limiterons à de faibles taux de parasitémie. Cela nous permettra d’obtenir une quantité de parasites suffisante pour une étude robuste, tout en évitant l’apparition de signes cliniques chez l’animal. Les animaux seront monitorés de manière journalière, l'observation de leur comportement ainsi qu'un examen clinique sera retranscrit sur une grille de score, que nous avons établi préalablement, et qui permettra de s'assurer de leur bonne santé. Cette grille comporte des critères considérés comme points limites, s’ils sont atteints les animaux seront immédiatement euthanasiés, afin d'éviter toute souffrance animale
Choix des espèces
Les recherches sur Plasmodium falciparum nécessitent généralement des modèles animaux complexes, comme certains singes ou des souris génétiquement modifiées, qui sont rares, difficiles à élever et très coûteux. Grâce à un génome très proche de ce dernier, nous pouvons utiliser Plasmodium berghei, qui infecte naturellement les rongeurs, pour mieux comprendre le paludisme humain. De plus, ces parasites murins ne présentent aucun risque pour l’Homme et ne se transmettent entre rongeurs que par la piqûre de moustiques Anopheles, absents en France métropolitaine. Nous utilisons des souris et des rats âgés de 8 à 12 semaines, car à cet âge, ils sont assez développés pour fournir un volume de sang suffisant pour nos analyses, tout en restant en bonne santé pour supporter l’infection.
Creation de lignées de lapins porteurs d’une invalidation d’un gène codant pour un canal ionique intestinal EU1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Objectifs
Le microbiote, c'est-à-dire la flore bactérienne intestinale non pathogène, joue un rôle essentiel non seulement dans l'assimilation des résidus alimentaires non digestibles, mais aussi dans la protection de certaines infections en dialoguant avec le système immunitaire de l'hôte. Il est donc essentiel, au même titre que les cellules intestinales, à la santé humaine et vétérinaire. Ce projet a pour objectif de créer des lignées de lapins présentant une modification génétique ciblée, grâce à une nouvelle méthode qui utilise des cellules souches modifiées en laboratoire, injectées dans de jeunes embryons. Le gène que nous cherchons à désactiver, produit normalement une protéine présente dans les cellules de l’intestin, chez plusieurs espèces de mammifères. Cette protéine pourrait jouer un rôle important dans différentes fonctions intestinales et donc intervenir dans la régulation de l’environnement intérieur de l’intestin et influencer le microbiote qui est un acteur clé dans la physiologie digestive. Le gène étudié n’étant pas présent chez la souris, le lapin représente le seul modèle expérimental possible pour ces analyses, car les mini-organes intestinaux créés in vitro ne représentent pas encore la complexité des interactions entre microbiote et cellules de l’intestin. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs (EU1 et EU2) qui conjuguent leurs expertises.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de ce projet sont de trois ordres. Le premier est la validation de l'utilisation de cellules souches pour produire des lapins transgéniques, technique disponible actuellement uniquement chez les rongeurs. Le second est le développement de cette méthode pour produire des lapins modèles de maladie humaine ou de thérapie cellulaire. Enfin le troisième est la création d'un modèle animal permettant l'étude des fonctions physiologiques des cellules intestinales exprimant le gène d’intérêt dans la régulation du microbiote et de l'environnement intérieur de l'intestin.
Procédures
Cinq types d’interventions sont prévues : 1. Traitement de superovulation sur lapines vigiles: 1 fois par lapine, 7 injections d’hormones durant 3 secondes chacune (2 minutes maximum avec la contention) sur 4 jours, 50 femelles (EU1); 2. Insémination artificielle des lapines vigiles: 1 fois par lapine, durée de la contention et de l'intervention 5 minutes maximum, 50 femelles (EU1); 3. Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 30 lapines prévues (EU1); 4. Echographie sur lapines vigiles: 1 fois par lapine opérée, durée de la contention et de l'échographie 10 minutes maximum (EU1); 5. Prélèvements de salive, de sang et éventuellement de peau sur lapereaux vigiles d'un mois avec anesthésie locale : 1 fois par animal, durée de l'expérimentation 5 minutes (25 minutes avec le temps d'action maximal de la pommade anesthésiante), 260 lapereaux (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de faibles douleurs liées aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants avec une durée de contention de 2 minutes. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles avec une durée de contention de 5 minutes maximum et des douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire (durée 1h15 jusqu'au réveil). Les lapereaux sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles, avec une durée de contention un peu stressante de 25 minutes maximum (10 à 20 minutes pour l'effet de la pommade anesthésiante et 5 minutes d'intervention). Les responsables de ce projet resteront attentifs à l’apparition de problèmes digestifs ou de douleurs chez les lapins dépourvus du gène d’intérêt.
Devenir
Les lapines productrices d'embryons seront euthanasiées pour récupérer les embryons de 1,5 jours. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Seules, les femelles issues des transferts d’embryons microinjectées avec des cellules souches modifiées seront utilisées pour produire les lignées de lapins dépourvus du gène d’intérêt, les mâles seront eux, à ce stade, euthanasiés. La création de ces lignées de lapins nécessitera ensuite deux générations de croisement de lapins porteurs ou non du gène d’intérêt, avec une sélection après génotypages des animaux à garder ou à euthanasier. Les lapereaux issus de ces croisements et dépourvus du gène d’intérêt seront alors euthanasiés pour les études des fonctions de ce gène.
Remplacement
Le projet nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'il vise à créer des lignées de lapins dépourvues d’un gène d’intérêt. Cependant l'utilisation de cellules souches permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés, car l’élimination du gène peut être vérifiée et validée in vitro avant la microinjection des cellules dans les embryons, contrairement aux techniques classiques basées sur des manipulations génétiques réalisées directement sur les embryons. De plus, les cellules de l’intestin exprimant le gène d’intérêt ne peuvent être étudiées qu'in vivo, car les modèles in vitro de type mini-organes ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de tube digestif et de son interaction avec le microbiote. Il n’existe donc pas d’alternatives à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène d’intérêt dans le dialogue entre les cellules de l’intestin et le microbiote.
Réduction
Le recours aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire des embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons des lapines ayant déjà eu des lapereaux pour transplanter des embryons, ce qui permettra d'éviter d'employer des lapines présentant des problèmes de nidation ou d’allaitement lors des transferts embryonnaires. Enfin, à chaque étape du projet, les expériences seront réalisées de façon séquentielle sur un petit nombre d’animaux, puis seront renouvelées uniquement si les résultats obtenus sont insuffisants pour poursuivre le projet.
Raffinement
Les injections nécessaires aux différentes procédures seront faites de préférence par voie sous-cutanée, moins douloureuse que par voie intramusculaire. Dès que possible (pour 1 à 3 femelles puisque nous hébergeons 3 mâles), des accouplements naturels seront réalisés à la place des inséminations artificielles pour éviter du stress et de la douleur aux femelles. Les lapines opérées seront placées par deux dans une cage propre à leur réveil. Elles seront surveillées deux fois par jour par des animaliers qualifiés et bénéficieront d'un régime alimentaire amplifié avec des croquettes adaptées, à volonté à partir du second tiers de leur gestation. Après vérification des gestations par une échographie de contrôle, les lapines seront déplacées pour être seules par cage et une boite à nid adaptée aux cages sera ajoutée 5 jours avant la mise-bas, ainsi que du papier absorbant qui leur servira à amorcer la préparation de leur nid fait avec leurs poils. Après la mise-bas, une surveillance de l'allaitement et du bien-être des lapereaux sera faite chaque matin, avec le recours à une adoption ou à une supplémentation par biberon en cas de défaillance ou d'agression de la mère. Les lapereaux seront maintenus avec leur mère jusqu'à leur sevrage, soit entre 6 à 8 semaines, puis les mâles et les femelles seront séparées. Les lapereaux issus des transferts embryonnaires seront transportés dans la seconde animalerie, par camion agréé, sous température régulée, en plaçant deux à trois lapereaux par carton à air filtré contenant du foin et un bloc d’hydrogel. Toute manipulation sera effectuée de mamnière douce, après habituation progressive des lapins aux contacts humains (animaliers et expérimentateurs). Lors de l’application des procédures expérimentales et des mises à mort, des analgésiques et/ou anesthésiants seront utilisés, afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. De même, une surveillance adaptée avec une grille de score et des points limites ont été définis pour chaque procédure et seront appliqués par des animaliers qualifiés qui surveilleront les lapins quotidiennement.
Choix des espèces
Le but du projet est de créer des lignées de lapins dépourvus d’un gène d’intérêt impliqué dans la physiologie digestive. L’intérêt de l’espèce lapin est de deux ordres : d’une part la création d’un modèle expérimental, puisque la souris ne peut être utilisée, le gène d’intérêt étant absent chez les rongeurs ; et d’autre part la validation de la technique employant des cellules souches pour créer des animaux modèles, qui a été récemment développée chez le lapin. Dans ce cadre, le lapin présente de nombreux avantages comme sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Il est physiologiquement et génétiquement apparenté à l’Homme, et présente un développement embryonnaire et une organisation du placenta identiques à ceux des primates. De ce fait, l’utilisation de cellules souches de lapin faciliterait la création de modèles de maladies humaines et de réacteurs biologiques, des lapins capables de produire des molécules pharmaceutiques dans leur lait. Enfin, ce projet est réalisé en collaboration avec un laboratoire qui s'intéresse au gène étudié dans différentes espèces, dont le lapin qui exprime ce gène dans 5% des cellules de son tube digestif. Une partie des animaux sera utilisée en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 5 et 36 mois pour les femelles. L'autre partie sera utilisée précocement, soit à 18 jours ou 5 à 6 semaines, pour le génotypage ou les études des fonctions du gène étudié.
Creation de lignées de lapins porteurs d’une invalidation d’un gène codant pour un canal ionique intestinal EU2/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Objectifs
Le microbiote, c'est-à-dire la flore bactérienne intestinale non pathogène, joue un rôle essentiel non seulement dans l'assimilation des résidus alimentaires non digestibles, mais aussi dans la protection de certaines infections en dialoguant avec le système immunitaire de l'hôte. Il est donc essentiel, au même titre que les cellules intestinales, à la santé humaine et vétérinaire. Ce projet a pour objectif de créer des lignées de lapins présentant une modification génétique ciblée, grâce à une nouvelle méthode qui utilise des cellules souches modifiées en laboratoire, injectées dans de jeunes embryons. Le gène que nous cherchons à désactiver, produit normalement une protéine présente dans les cellules de l’intestin, chez plusieurs espèces de mammifères. Cette protéine pourrait jouer un rôle important dans différentes fonctions intestinales et donc intervenir dans la régulation de l’environnement intérieur de l’intestin et influencer le microbiote qui est un acteur clé dans la physiologie digestive. Le gène étudié n’étant pas présent chez la souris, le lapin représente le seul modèle expérimental possible pour ces analyses, car les mini-organes intestinaux créés in vitro ne représentent pas encore la complexité des interactions entre microbiote et cellules de l’intestin. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs (EU1 et EU2) qui conjuguent leurs expertises.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de ce projet sont de trois ordres. Le premier est la validation de l'utilisation de cellules souches pour produire des lapins transgéniques, technique disponible actuellement uniquement chez les rongeurs. Le second est le développement de cette méthode pour produire des lapins modèles de maladie humaine ou de thérapie cellulaire. Enfin le troisième est la création d'un modèle animal permettant l'étude des fonctions physiologiques des cellules intestinales exprimant le gène d’intérêt dans la régulation du microbiote et de l'environnement intérieur de l'intestin.
Procédures
injections d’hormones durant 3 secondes chacune (2 minutes maximum avec la contention) sur 4 jours, 50 femelles (EU1); 2. Insémination artificielle des lapines vigiles: 1 fois par lapine, durée de la contention et de l'intervention 5 minutes maximum, 50 femelles (EU1); 3. Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 30 lapines prévues (EU1); 4. Echographie sur lapines vigiles: 1 fois par lapine opérée, durée de la contention et de l'échographie 10 minutes maximum (EU1); 5. Prélèvements de salive, de sang et éventuellement de peau sur lapereaux vigiles d'un mois avec anesthésie locale : 1 fois par animal, durée de l'expérimentation 5 minutes (25 minutes avec le temps d'action maximal de la pommade anesthésiante), 260 lapereaux (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de faibles douleurs liées aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants avec une durée de contention de 2 minutes. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles avec une durée de contention de 5 minutes maximum et des douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire (durée 1h15 jusqu'au réveil). Les lapereaux sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles, avec une durée de contention un peu stressante de 25 minutes maximum (10 à 20 minutes pour l'effet de la pommade anesthésiante et 5 minutes d'intervention). Les responsables de ce projet resteront attentifs à l’apparition de problèmes digestifs ou de douleurs chez les lapins dépourvus du gène d’intérêt.
Devenir
Les lapines productrices d'embryons seront euthanasiées pour récupérer les embryons de 1,5 jours. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Seules, les femelles issues des transferts d’embryons microinjectées avec des cellules souches modifiées seront utilisées pour produire les lignées de lapins dépourvus du gène d’intérêt, les mâles seront eux, à ce stade, euthanasiés. La création de ces lignées de lapins nécessitera ensuite deux générations de croisement de lapins porteurs ou non du gène d’intérêt, avec une sélection après génotypages des animaux à garder ou à euthanasier. Les lapereaux issus de ces croisements et dépourvus du gène d’intérêt seront alors euthanasiés pour les études des fonctions de ce gène.
Remplacement
Le projet nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'il vise à créer des lignées de lapins dépourvues d’un gène d’intérêt. Cependant l'utilisation de cellules souches permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés, car l’élimination du gène peut être vérifiée et validée in vitro avant la microinjection des cellules dans les embryons, contrairement aux techniques classiques basées sur des manipulations génétiques réalisées directement sur les embryons. De plus, les cellules de l’intestin exprimant le gène d’intérêt ne peuvent être étudiées qu'in vivo, car les modèles in vitro de type mini-organes ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de tube digestif et de son interaction avec le microbiote. Il n’existe donc pas d’alternatives à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène d’intérêt dans le dialogue entre les cellules de l’intestin et le microbiote.
Réduction
Le recours aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire des embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons des lapines ayant déjà eu des lapereaux pour transplanter des embryons, ce qui permettra d'éviter d'employer des lapines présentant des problèmes de nidation ou d’allaitement lors des transferts embryonnaires. Enfin, à chaque étape du projet, les expériences seront réalisées de façon séquentielle sur un petit nombre d’animaux, puis seront renouvelées uniquement si les résultats obtenus sont insuffisants pour poursuivre le projet.
Raffinement
Les injections nécessaires aux différentes procédures seront faites de préférence par voie sous-cutanée, moins douloureuse que par voie intramusculaire. Dès que possible (pour 1 à 3 femelles puisque nous hébergeons 3 mâles), des accouplements naturels seront réalisés à la place des inséminations artificielles pour éviter du stress et de la douleur aux femelles. Les lapines opérées seront placées par deux dans une cage propre à leur réveil. Elles seront surveillées deux fois par jour par des animaliers qualifiés et bénéficieront d'un régime alimentaire amplifié avec des croquettes adaptées, à volonté à partir du second tiers de leur gestation. Après vérification des gestations par une échographie de contrôle, les lapines seront déplacées pour être seules par cage et une boite à nid adaptée aux cages sera ajoutée 5 jours avant la mise-bas, ainsi que du papier absorbant qui leur servira à amorcer la préparation de leur nid fait avec leurs poils. Après la mise-bas, une surveillance de l'allaitement et du bien-être des lapereaux sera faite chaque matin, avec le recours à une adoption ou à une supplémentation par biberon en cas de défaillance ou d'agression de la mère. Les lapereaux seront maintenus avec leur mère jusqu'à leur sevrage, soit entre 6 à 8 semaines, puis les mâles et les femelles seront séparées. Les lapereaux issus des transferts embryonnaires seront transportés dans la seconde animalerie, par camion agréé, sous température régulée, en plaçant deux à trois lapereaux par carton à air filtré contenant du foin et un bloc d’hydrogel. Toute manipulation sera effectuée de mamnière douce, après habituation progressive des lapins aux contacts humains (animaliers et expérimentateurs). Lors de l’application des procédures expérimentales et des mises à mort, des analgésiques et/ou anesthésiants seront utilisés, afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. De même, une surveillance adaptée avec une grille de score et des points limites ont été définis pour chaque procédure et seront appliqués par des animaliers qualifiés qui surveilleront les lapins quotidiennement.
Choix des espèces
Le but du projet est de créer des lignées de lapins dépourvus d’un gène d’intérêt impliqué dans la physiologie digestive. L’intérêt de l’espèce lapin est de deux ordres : d’une part la création d’un modèle expérimental, puisque la souris ne peut être utilisée, le gène d’intérêt étant absent chez les rongeurs ; et d’autre part la validation de la technique employant des cellules souches pour créer des animaux modèles, qui a été récemment développée chez le lapin. Dans ce cadre, le lapin présente de nombreux avantages comme sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Il est physiologiquement et génétiquement apparenté à l’Homme, et présente un développement embryonnaire et une organisation du placenta identiques à ceux des primates. De ce fait, l’utilisation de cellules souches de lapin faciliterait la création de modèles de maladies humaines et de réacteurs biologiques, des lapins capables de produire des molécules pharmaceutiques dans leur lait. Enfin, ce projet est réalisé en collaboration avec un laboratoire qui s'intéresse au gène étudié dans différentes espèces, dont le lapin qui exprime ce gène dans 5% des cellules de son tube digestif. Une partie des animaux sera utilisée en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 5 et 36 mois pour les femelles. L'autre partie sera utilisée précocement, soit à 18 jours ou 5 à 6 semaines, pour le génotypage ou les études des fonctions du gène étudié.
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU2/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU1/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).
Étude des embryons p16High et souris adultes qui en sont issues
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Objectifs
Le vieillissement est un phénomène complexe qui s’accompagne d’un affaiblissement progressif du fonctionnement des organes. De nombreuses recherches montrent que cela pourrait être dû à l’accumulation, dans le corps, de cellules particulières appelées cellules sénescentes. Ces cellules, originellement normales, entrent dans un état de sénescence après avoir subi un stress important et s'accumulent avec l'âge. Une fois sénescentes, elles perdent leurs fonctions habituelles et peuvent même avoir des effets néfastes sur leur environnement. Elles se mettent alors à produire des substances et des signaux qui modifient leur comportement et celui des cellules autour d’elles. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous utilisons une lignée spéciale de souris génétiquement modifiées, dans laquelle les cellules sénescentes peuvent être repérées grâce à un marqueur fluorescent. Avec à ce modèle, nous avons notamment observé que certains ovocytes produisent ce marqueur fluorescent et que ceux-ci peuvent se développer en un nouvelle souris. Les souris issues de ces ovocytes sénescents développeront plus rapidement des troubles du système immunitaire ainsi que des tumeurs en vieillissant. Ce projet a pour objectif d’étudier plus en détail ces ovocytes et de mieux comprendre les caractéristiques des souris qui en sont issues, notamment en ce qui concerne l’apparition et l’évolution des tumeurs au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de caractériser les ovocytes ainsi que les souris adultes qui en sont issues, en particulier au niveau de l'apparition des cancers associés au vieillissement. Ces découvertes rendraient possible un meilleur dépistage des individus ayant un risque accru de développer des tumeurs, donc une prise en charge plus rapide en cas de cancer.
Procédures
Toutes les souris de ce projet subiront, une seule fois dans leur vie, un prélèvement de tissu (2-3mm de l'extrémité de leur queue). Les 2 procédures se suivront et ne dureront que quelques secondes. Des souris subiront 2 injections à 48 heures d'intervalle, et d'autres subiront une injection d'une suspension de blastocystes par voie basse (passage par voie vaginale) a l'aide d'une pipette adaptée. L'injection, qui ne dure que quelques secondes, se fera une seule fois, sur animaux vigiles. En cas de douleur, des souris pourront recevoir des gavages répétés d'analgésique (1 par jour)
Impact sur les animaux
Toutes les souris de ce projet subiront une seule fois dans leur vie, un prélèvement de tissu (2-3mm de l'extrémité de leur queue) pouvant entraîner de léger saignement. Les souris transgéniques dont on doit collecter les ovocytes subiront 2 injections d'hormones, induisant une légère douleur au niveau des sites d'injection et un stress réduit pour un très court laps de temps. Les souris devant être implantées avec les embryons subiront un léger inconfort : ainsi, les femelles âgées de 8 semaines seront simplement implantées par voie basse à l'aide d'une pipette adaptée. Ces femelles seront isolées 21 jours jusqu'à la mise-bas, ce qui pourra engendrer un stress modéré. Les mâles dont on devra collecter les spermatozoïdes seront isolés 16 heures avant leur mise à mort, pouvant engendrer un léger stress. Enfin, certaines autres souris développeront respectivement des tumeurs spontanées à partir de 10 mois (lymphome et sarcome) et 5 mois. En cas de douleur, des administrations par gavage d'analgésique seront délivrées aux souris et lors d’un de ceux-ci une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus en vue d'une analyse in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Le vieillissement des cellules lié au développement des tumeurs, est un phénomène complexe, qui dépend de nombreuses interactions entre les cellules et les tissus. Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de modèles animaux reste donc essentielle, car ces mécanismes sont trop compliqués à reproduire en laboratoire, hors d’un organisme vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de souris à utiliser dans ce projet, nous pratiquerons un protocole de fécondation in vitro à partir d'ovocytes prélevés sur des souris femelles du génotype adéquat préalablement superovulées, puis implantés dans des souris receveuses. Ces femelles seront injectées non pas avec une hormone classique mais avec une hormone jusqu'à 5 fois plus efficace, diminuant ainsi le nombre de souris a traiter. D'autre part, chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure et pour chaque souches utilisées. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis.
Choix des espèces
Il s'agit d'une étude exploratoire et innovante basée sur des modèles murins qui ont déjà été utilisés dans le cadre d'études portant sur la sénescence. À notre connaissance, il n'existe pas d'autres organismes modèles transgéniques comparables et utilisables pour étudier la sénescence, tant au niveau de leur disponibilité, de la vitesse de leur vieillissement et de leur capacité à générer rapidement les animaux expérimentaux nécessaires. En fonction des procédures, les animaux seront utilisés à des âges différents. Certaines souris seront seulement utilisées à l'âge adulte pour créer les accouplements nécessaires au maintien de la lignée et la génération des animaux expérimentaux. Les femelles utilisées pour le prélèvement d'ovocytes auront entre 4 et 8 semaines, âge considéré comme optimum pour l'induction de la superovulation. Les mères porteuses auront approximativement 8 semaines, âge considère comme optimum pour l'implantation. Enfin , les souris issues des implantations seront gardées en vie jusqu'à 12 mois maximum.
Etude moléculaire des troubles du neurodéveloppement chez la souris-Modification1
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Objectifs
Notre étudions une molécule sécrétée dans le milieu extracellulaire qui contrôle des étapes cruciales du développement du cerveau. En effet, des altérations de niveaux de cette protéine d’intérêt sont observés dans de nombreuses pathologies psychiatriques dont l’autisme, la schizophrénie et la dépression mais aussi la lissencéphalie et l'épilepsie. Or plusieurs populations cellulaires sécrètent cette protéine lors d'étapes successives du développement du cerveau. L'objectif du projet est d’identifier les rôles respectifs de ces populations sources de notre potéine d'intérêt dans le développement du cerveau et l’étiologie des troubles du neuro-développement en combinant des approches moléculaires, histologiques, électrophysiologiques et comportementales.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ces travaux nous permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’étiologie des troubles du neurodéveloppement, pour envisager de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.
Procédures
Tous les souriceaux de plus de 7 jours subiront un stress léger lié à la contention et au tatouage (1 min) ainsi qu’une douleur légère liée au prélèvement à la queue (10 sec) entre P7 et P10. Cette intervention n’aura lieu qu’une fois, sauf cas exceptionnel de prélèvement dégradé. Lot1: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec); Lot 2: Tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) en juvénile puis perfusion intracardiaque à P25 (2 injections de 10 sec); Lot 3 : Tatouage (1min), isolation pour vocalisations (2x5min) et prélèvement (10sec) en juvénile, puis OF (20 min), EPM (7 min), 3-chambers (30 min), NOR (30 min), tests d'inhibition du réflexe de sursaut (32 min) et de conditionnement par la peur (8min/jour x 4 jours). Lot 4a: perfusion intracardiaque à P4 ou P7 (2injX10 sec); Lot 4b: Eléctroporation in utero (1injX10sec, chirurgie sous anesthésie générale profonde 35min, suture 10min, 2 injX10secX3 jours), tatouage (1 min) et prélèvement (10 sec) puis perfusion intracardiaque (2injX10sec); Lot 5: stress prénatal (3X45minX6jrs). Modification : Les animaux du lot 3 subiront en plus un test d’hyperlocomotion induite par la d-amphétamine (1h30 dont 2 inj x 10 sec). Les animaux du lot Lot 5 subiront soit un stress prénatal par inflammation maternelle (1 x 10sec, ip), soit un stress prénatal dû aux injections d’antidépresseur fluoxetine ou de saline de la mère (1x 10 sec injection ip x 6jrs) soit un stress postnatal dû aux injections d’antidépresseur des nouveaux nés ( 1X 10 sec d’injection sous cutanéex 3jrs puis 1x 10sec d’injection ip x 3jrs) .
Impact sur les animaux
Les souriceaux subiront après la naissance une contention pour permettre un tatouage des coussinets des phalanges et un prélèvement à la queue qui peuvent entrainer un stress et une douleur légers. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. A noter que l'étape d’anesthésie en elle-même peut également provoquer un stress chez l’animal. Pour réaliser l’enregistrement des vocalisations, certains souriceaux devront être isolés pendant 2 fois 5min , ce qui est une source de stress. De même, les tests comportementaux successifs adultes sont une source de stress, notemment les tests d’inhibition du réflexe de sursaut ou de conditionnement par la peurqui imposent aux animaux de subir des sons à très hauts décibels (110db) et des chocs électriques sur les pattes, qui même si modérés, induisent une réaction de stress notable (posture de freezing). Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique, certaines femelles gestantes subiront un stress répété par contention. Afin de marquer les astrocytes, certaines autres gestantes subiront une analgésie (voie sous-cutanée) et une anesthésie générale profonde (par voie respiratoire) de 45 minutes, suivies d’un acte chirurgical comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures, puis des injections sous cutanées d’analgésique d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Aucun phénotype dommageable n’a été observé ou décrit dans la littérature pour les génotypes décrits.Modification : Les animaux réalisant les tests comportementaux subiront un stress additionnel à la fin pour étudier leur hyperlocomotion induite par l’exposition à la d-amphétamine. Pour l'étude des conséquences du stress prénatal sur l'épigénétique certaines femelles subiront soit un stress prénatal de contention maternelle (3x45min x6jrs) ou un stress dû aux injections répétées d’antidépresseurs. De même, pour l’étude des conséquences du stress postnatal, les souriceaux subiront un stress lié aux injections répétées d’antidépresseurs.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le cadre de l'étude seront mis à mort, soit à des fins d'études histologiques (lot 2, 384 animaux; lot 4, 368 animaux), épigénétiques (lot 5, 224 animaux), électrophysiologiques (Lot 1b, 384 animaux) ou comportementales (lot 3, 384 animaux), soit après avoir achevé leur rôle de reproduction (lot 1a, 1680 animaux). Modification : le lot 5 comprend maintenant 675 animaux qui seront mis à mort à des fins d'études épigénétiques.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité du cortex en développement et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part, ce qui rend l’utilisation d’un modèle murin indispensable à la réalisation de ce projet. Notamment, les effets du stress périnatal impliquent des interactions précises, transitoires et adaptatives entre les hormones, les neurotransmetteurs et les neuro-modulateurs, mais aussi avec les systèmes inflammatoires, digestifs et sanguins qui sont encore mal connues et ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous optimisons les croisements des lignées transgéniquespour obtenir un pourcentage maximal d’animaux d’intérêt et nous optimisons au maximum les échantillons obtenus en réalisant plusieurs séries de coupes par cerveau pour réaliser plusieurs marquages différents sur un même cerveau. Pour les études histologiques, un test de puissance G réalisé à partir de résultats antérieurs sur un autre modèle de souris nous préconise une taille de groupe de 6 individus par genre. Pour les études comportementales, nos résultats antérieurs préconisent une taille de groupe de 12 individus. Les analyses statistiques seront réalisés par un test adapté.
Raffinement
Des points limites strictes et spécifiques à chaque procédure sont appliqués. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton de nidification et bâtonnet de bois) et sont regroupés en groupes sociaux de 2 à 6 individus par cage. La mise à mort par perfusion de paraformaldéhyde est réalisée sous anesthésie générale profonde et après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine. La chirurgie d’électroporation in utero est réalisée sous anesthésie profonde préalable par l’isoflurane (4% pour l’induction et 2% pour le maintien de l’anesthésie) et sur une plaque chauffante (37°C), et ce après une injection sous-cutanée de l’analgésique buprénorphine, la désinfection du site d’incision et l’ajout d’une gel ophtalmique pour la protection des yeux. Après l’opération, l’animal reçoit à 24 et 48h l’analgésique Meloxicame en sous-cutané.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. En effet, seuls les Mammifères présentent un néocortex organisé en couches inversées, grâce à la présence précoce des cellules sécrétant notre protéine d’intérêt à la surface du cortex. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés sont disponibles chez la souris. Le génotypage et les prélèvements seront réalisés sur les souriceaux entre 4 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges sans douleur. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Pour étudier les rôles des sous-populations cellulaires sources de Reln dans la formation des couches corticales nous allons étudier les stades embryonnaires E12.5, E14.5 et E16.5, puis les stades postnataux P0 et P25. En effet, les neurones corticaux sont générés entre E12.5 et E16.5, atteignent majoritairement leur position à P0 mais continuent à migrer et à se différencier dans les couches corticales jusqu’à P25. Les effets des quantités de Reln sur la prolifération et la maturation des astrocytes seront analysés aux stades post-nataux P4 et P7 (avant et après la phase de prolifération) et P25 (pour pouvoir visualiser une arborescence mature). Les effets du stress prénatal sur l’expression de Reln seront évalués à P0, quand les deux sources principales de Reln corticale sont simultanément présentes. Enfin les rôles spécifiques des sous-populations sur le comportement seront analysés à P6 pour les vocalisations néonatales (âge du pic de vocalisation induite par l’isolation) et à l’âge adulte (P60-P120) pour les autres tests comportementaux qui nécessitent une maturation achevée des circuits. Modification : Afin de différencier les effets du stress postnatal de ceux du stress prénatal, nous analyserons aussi des animaux à P8, quand les deux sources sont encore simultanément présentes.