Les projets approuvés

Treize écouvillonnages du nez et de la trachée, cinq lavages des bronches, deux ponctions de moelle osseuse et jusqu'à six prises de sang par semaine : 246 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 216 d'entre eux sont infectés par la grippe puis par un pneumocoque et seront tués pour analyse des tissus, les 30 autres pouvant être réutilisés dans d'autres études après récupération et avis vétérinaire. Le porteur décrit une ponction lombaire par macaque, pouvant provoquer un hématome sous-cutané et aller jusqu'à l'hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire, et un hébergement individuel pendant la phase d'infection. Le choix de cette espèce tient, selon lui, à la proximité génétique et physiologique avec l'être humain, à un appareil respiratoire de structure et de dimensions voisines et à un système immunitaire qui réagit de façon similaire.

Objectifs

La grippe constitue un enjeu majeur de santé publique. Des complications sévères peuvent survenir notamment lorsque l’infection par le virus de la grippe est suivie d’une infection bactérienne, appelée « surinfection ». Dans ce cas, les défenses naturelles des poumons sont affaiblies par le virus, ce qui permet à certaines bactéries opportunistes de s’installer plus facilement et d’aggraver la maladie. L’une des bactéries les plus souvent impliquées est Streptococcus pneumoniae, responsable notamment de pneumonies. Les surinfections bactériennes surviennent le plus souvent chez les personnes les plus fragiles, comme celles hospitalisées pour une grippe sévère, les patients en réanimation ou ceux ayant déjà d’autres problèmes de santé. Dans ces situations, la combinaison du virus et des bactéries peut entraîner des formes graves de maladie, avec un risque accru de complications voire de décès. Ce projet cherche à réduire ces complications. L’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements limitant la gravité de la maladie lorsque virus et bactéries sont présents en même temps.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, certaines bactéries, comme Streptococcus pneumoniae, deviennent de plus en plus difficiles à traiter, car elles résistent aux antibiotiques habituellement utilisés, ce qui rend les infections plus difficiles à traiter. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements innovants pour lutter contre les infections à Streptococcus pneumoniae. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’humain, fourniront des connaissances essentielles pour mieux comprendre ces infections et développer de nouveaux traitements. Ils permettront également de proposer des solutions plus efficaces aux patients et d’améliorer globalement leur prise en charge. Ce projet pourrait contribuer à mieux protéger la santé humaine face à un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale : la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupés pour limiter les anesthésies (1 à 7x par semaine, 246 animaux, 30-45 minutes) : Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 6 10 fois par semaine, 246 animaux, 5 minutes). - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (13 fois, 246 animaux, 2 minutes) - Retrait de ganglions lymphatiques, (2 fois maximum, 216 animaux, 20 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (5 fois, 246 animaux, 10 minutes) - Ponction lombaire (1 fois, 216 animaux, 20min) - Moëlle osseuse (2 fois, 246 animaux, 10 minutes) Interventions - Implantation d’une puce de suivi de température (1 fois, 246 animaux, 30 minutes) - Infection par voie respiratoire, (2 fois, 216 animaux, 30 min) - Imagerie in vivo (5 fois, 246 animaux, 45 minutes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (jusqu’à 6 fois, 120 animaux, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Les prélèvements et anesthésies répétés peuvent engendrer une perte d’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, un hématome au niveau du site du prélèvement ou uneinfection au niveau du site de prélèvement dans les jours qui suivent le prélèvement. Après traitement, une réaction locale, des démangeaisons/douleurs dans les heures/jours suivant peuvent apparaitre. L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. Ces symptômes peuvent être augmentés par la surinfection par pneumocoque. L’état des animaux sera observé tous les jours et des points limites sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. L’implantation de puces de télémétrie peut créer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons Les lavages bronchoalvéolaires, peuvent provoquer une toux, ou des difficultés respiratoires légères juste après le geste Les écouvillonnages nasotrachéaux peuvent provoquer un saignement nasal (léger à modéré) Le retrait de ganglions peut engendrer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. La ponction lombaire peut amener à un hématome sous-cutané, pouvant aller jusqu’à l’hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser des dosages et une analyse des tissus. Les autres animaux pourront être inclus dans d’autres études après récupération complète des animaux et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouvelles stratégies de traitements contre des infections respiratoires complexes associant le virus de la grippe et Streptococcus pneumoniae. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire toute la complexité anatomique du poumon humain, notamment les interactions entre les différents types de cellules et tissus, et le fonctionnement du système immunitaire dans son ensemble. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Ce modèle animal permet de reproduire la complexité de l’ensemble des mécanismes biologiques impliqués dans cette double infection et d’évaluer de façon fiable la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements avant toute application chez l’humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Les premières étapes du projet serviront à ajuster les conditions d’infection les plus pertinentes (par exemple la quantité de bactérie utilisée) afin de reproduire de façon la plus fiable les symptômes observés chez l’humain sans multiplier les essais et selon un procédé, étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter de réelles différences entre les groupes tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. L’état général des animaux sera observé quotidiennement. À chaque intervention, l’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille d’observation. Si des signes de maladie apparaissent, le vétérinaire sera immédiatement prévenu afin d’adapter le suivi et les soins. Le recours à des médicaments anti-douleur pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle. Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique sera appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupes avant infection et en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés par 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, pour éviter une contamination croisée et limiter le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique, et physiologique avec l'être humain, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements. Son appareil respiratoire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, aussi bien par sa structure que par ses dimensions. Son système immunitaire réagit de manière similaire, avec une sensibilité aux mêmes types d’infections. De plus, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues quatre semaines en caissons hypoxiques pour développer une hypertension pulmonaire, reçoivent une injection sous-cutanée par jour pendant ces quatre semaines et subissent des mesures de pression cardiaque sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit que les souris deviennent un peu amorphes pendant les premières vingt-quatre heures puis "s'acclimatent ensuite très bien", et qu'aucune méthode ne permet d'étudier autrement les mécanismes de cette maladie, dont la survie humaine à cinq ans atteint 36 % dans les formes sévères. Une nécrose cutanée au point d'injection quotidien entraîne la mise à mort de la souris concernée.

Objectifs

L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire qui mène régulièrement à la mort du patient. La greffe cœur/poumons est l’ultime recours pour les patients car pas ou peu de traitements pharmacologiques permettent d’améliorer les conditions de vie des malades atteints d’hypertension pulmonaire. Il est ainsi nécessaire d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette maladie pour établir de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, notre objectif est d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l’hypertension pulmonaire

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement efficace ne permet de soigner l’hypertension pulmonaire. Pour cette maladie, 36% de survie des patients à 5 ans pour les formes sévères. Identifier des molécules permettant de soigner l’hypertension pulmonaire est donc une priorité

Procédures

- Hypoxie en continue pendant 4 semaines, - 1 injection quotidienne de 30 sec en sous-cutané, - Mesures de pression cardiaque sous anesthésie (1 minute/mesure)

Impact sur les animaux

- L’induction de l’HTAP nécessite d’héberger les animaux dans des caissons hypoxiques. Le changement d’environnement peut induire un stress sur les animaux. L’induction de l’HTAP rend les souris un peu « amorphe » sur les premières 24h, le temps qu’elles s’adaptent. Elles s’acclimatent ensuite très bien. - Toutes les molécules sont préalablement testées pour éviter des effets indésirables majeurs chez la souris. Seules les molécules montrant pas ou peu d’effets indésirables (toxicité, solubilité, bonne biodisponibilité de la molécule…) seront testées in vivo. - Stress induit par contention quotidienne pour injecter les molécules en sous-cutané pendant 4 semaines. Si une nécrose cutanée apparait, l’animal sera alors mis à mort.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements d’organes et pour analyses fonctionnelles et histologiques

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’étudier les mécanismes de développement de l’HTAP. Le modèle murin d’hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher de la pathologie humaine. Cette approche expérimentale permet ainsi d’étudier, dans un système intégré, les mécanismes impliqués dans le développement de la pathologie et également d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.

Réduction

Nous avons fait une sélection in vitro des molécules à tester pour réduire l’expérimentation animale. Comme toutes les molécules sélectionnées sont solubles, le solvant sera identique pour tous les tests. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les groupes contrôles. Nous utiliserons un test statistique ANOVA (Prism, GraphPad) pour interpréter nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Les cages des animaux sont enrichies avec des frisottis et des bâtonnets en bois. Les traitements dureront 4 semaines avec des injections quotidiennes en sous-cutanée par contention douce. Nous injecterons à différents endroits pour éviter l’apparition de lésions cutanées.

Choix des espèces

Le modèle murin soumis à une hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher le plus de la pathologie humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Pour étudier le potentiel thérapeutique des molécules, nous devons travailler avec un système pulmonaire et hémodynamique mature.

Toutes tuées après des évaluations fonctionnelles terminales, sans qu'aucune soit maintenue en vie ni réutilisée, 818 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection intrapleurale d'un traceur, puis une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes sous anesthésie générale ouvrant l'accès à la moelle épinière cervicale, où sont injectés des pièges extracellulaires produits en laboratoire. La perte de poids attendue va jusqu'à 10 % du poids initial dans la semaine suivant l'opération, y compris chez les souris du groupe témoin, opérées sans injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'observer à la fois ces pièges dans la moelle épinière, leur effet sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme et les conséquences musculaires dans un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment une inflammation générale dans l’organisme peut aussi provoquer une inflammation de la moelle épinière et perturber le fonctionnement des muscles, en particulier ceux impliqués dans la respiration. Parmi les mécanismes étudiés figurent les « pièges extracellulaires », des structures libérées par certaines cellules immunitaires. Ces structures jouent normalement un rôle de défense, mais lorsqu’elles sont produites en excès, elles peuvent entretenir l’inflammation et endommager les tissus. L’objectif est de déterminer si la présence de ces pièges extracellulaires dans la moelle épinière peut, à elle seule, provoquer une inflammation locale et altérer la fonction neuromusculaire. Pour cela, des pièges extracellulaires produits en laboratoire à partir de différentes cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages et microglies) seront injectés dans la moelle épinière de souris saines. Cela permettra de comparer leurs effets respectifs sur l’inflammation et sur le fonctionnement des muscles respiratoires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre une inflammation générale de l’organisme, l’inflammation de la moelle épinière et l’apparition de troubles musculaires et respiratoires. Nos premiers résultats suggèrent que les « pièges extracellulaires », produits par certaines cellules immunitaires, pourraient jouer un rôle dans ces altérations, mais leur effet exact reste encore mal connu. Ce projet permettra de déterminer si la présence de ces structures dans la moelle épinière est suffisante pour provoquer à elle seule une inflammation locale et perturber le fonctionnement neuromusculaire, en particulier celui du diaphragme, principal muscle respiratoire. Il permettra aussi de comparer les effets de pièges extracellulaires provenant de différents types cellulaires, afin de mieux comprendre si certains ont des effets plus délétères que d’autres. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour limiter les conséquences neurologiques, musculaires et respiratoires associées à une inflammation systémique, notamment dans certaines maladies graves comme le sepsis.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant d’atteindre la moelle épinière cervicale et d’y injecter des « pièges extracellulaires » produits par des cellules en laboratoire. Cette chirurgie sera précédée de quelques jours par une injection intrapleurale quasi non-invasive (5 minutes) d’un traceur moléculaire permettant d’identifier les cellules permettant la contraction du muscle diaphragmatique, et localisées dans la moelle épinière cervicale. Ces souris seront ensuite soumises à des tests fonctionnels terminaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration du traceur en intrapleuraléritonéal. - Perte de poids jusqu’à 10% du poids initial durant la première semaine après la chirurgie et l’injection dans la moelle épinière des pièges extracellulaires. Les animaux du groupe contrôle pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à la chirurgie contrôle sans injection de pièges extracellulaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure, après les évaluations fonctionnelles terminales. Les tissus et organes d’intérêt, notamment la moelle épinière cervicale, le diaphragme et, selon les analyses prévues, d’autres tissus associés, seront ensuite prélevés pour des analyses histologiques, immunohistochimiques, cytométriques et moléculaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie ou réutilisé à l’issue de la procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant d’étudier en même temps les effets des pièges extracellulaires dans la moelle épinière, leur impact sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme, et les conséquences sur le fonctionnement musculaire. Les études réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et les muscles dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour répondre à cette question de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. L’organisation de l’étude repose sur l’expérience du laboratoire, sur des données préliminaires, et sur les analyses prévues à la fin des expériences. Le choix de plusieurs groupes et de plusieurs temps d’observation est nécessaire pour comparer correctement les effets étudiés, mais a été limité afin d’éviter toute utilisation excessive d’animaux. Cette stratégie permet d’obtenir des résultats exploitables tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur et l’inconfort. Les conditions opératoires seront soigneusement contrôlées afin de réduire au maximum les risques liés aux injections et aux manipulations. Après chaque intervention, les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière pendant toute la durée de l’étude. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés à l’aide de grilles de suivi. Si nécessaire, les animaux seront pris en charge de manière adaptée. L’isolement (dans un environnement enrichit) ne sera utilisé qu’en cas de besoin lié aux soins ou à l’état de l’animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est une espèce largement utilisée en recherche biomédicale pour étudier les interactions entre inflammation, système nerveux et fonction musculaire. Les modèles murins de neuroinflammation sont bien connus et permettent d’obtenir des résultats comparables à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques utilisées dans ce projet, comme les injections dans la moelle épinière, le marquage de certaines cellules nerveuses et les analyses des tissus en fin d’expérience. Sa petite taille, son cycle de vie court et la disponibilité de lignées élevées dans des conditions standardisées permettent de bien contrôler les conditions expérimentales et de limiter la variabilité entre animaux. De plus, la souris partage avec l’humain plusieurs caractéristiques importantes du fonctionnement des systèmes nerveux, musculaire et immunitaire, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de recherche. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés d’au moins 8 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance et au développement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi d’étudier ces mécanismes dans une situation plus proche de celle observée chez l’adulte humain.

Une substance qui provoque une fibrose pulmonaire est administrée directement dans les voies respiratoires par incision de la trachée, en cinq à sept minutes par souris sous anesthésie. 256 souris vont être utilisées, toutes tuées pour le prélèvement des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fois la fibrose installée, elles reçoivent au niveau des cordes vocales un vecteur qui active un gène favorisant le cancer, puis quatre injections dans la cavité abdominale sur animal réveillé. Le porteur annonce essoufflement, fatigue et perte de poids, et affirme que l'impact du cancer "reste ici limité" parce que l'étude s'achève au vingt-huitième jour, avant que la maladie ne soit trop avancée.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie où les poumons s'abîment et se couvrent de cicatrices, ce qui rend la respiration très difficile. C'est une maladie grave et, malheureusement, les personnes qui en souffrent développent souvent aussi un cancer du poumon. Soigner ces patients est un vrai défi pour les médecins. Comme leurs poumons sont déjà très fragiles, ils supportent mal les traitements habituels comme la chirurgie ou les médicaments contre le cancer, qui peuvent parfois aggraver leur état. Aujourd'hui, il existe de nouveaux médicaments pour ralentir la fibrose, mais le cancer reste un grand danger. On ne sait pas encore exactement pourquoi ces tumeurs apparaissent. Notre idée est que le changement profond de la structure du poumon à cause de la fibrose finit par « réveiller » des signaux qui poussent les cellules à devenir cancéreuses. Nous pensons que ce type de cancer est particulier et différent des autres. En comprenant mieux ces mécanismes, nous espérons trouver des solutions mieux adaptées pour protéger et soigner ces patients.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est l'un des plus fréquents et des plus graves au monde. Notre étude se concentre sur un groupe de patients très précis : ceux qui développent une tumeur alors qu'ils souffrent déjà d'une fibrose pulmonaire. L'objectif est de comprendre comment ce tissu pulmonaire déjà abîmé influence la croissance du cancer. En décryptant mieux le fonctionnement de cette maladie chez ces patients particulièrement fragiles, nous espérons ouvrir la voie à des traitements plus ciblés et mieux adaptés. Nous allons notamment tester si le blocage de certains mécanismes du processus inflammatoire pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique prometteuse pour améliorer leur prise en charge.

Procédures

Dans ce projet, les souris seront soumises à des interventions réalisées sous anesthésie générale afin de limiter toute douleur ou stress. Les animaux recevront une seule administration par voie chirurgicale, d’une substance utilisée pour provoquer une fibrose pulmonaire, directement dans les voies respiratoires (via une incision de la trachée). Cette administration sera réalisée chez des animaux endormis permettant une diffusion homogène dans les poumons. La procédure d’injection dure entre 5 et 7minutes par souris. Une fois la fibrose établie, les animaux recevront une seule administration dans les voies aériennes (au niveau des cordes vocales) d’un vecteur permettant l’activation d’un gène favorisant le cancer. Cette étape dure environ 5 minutes. Ils recevront ensuite une injection dans la cavité abdominale d’une molécule pour regarder son effet sur le développement tumoral dans le contexte de la fibrose pulmonaire (4 injections espacées de 48h sur animal réveillé). Ce geste dure moins de 1 minute.

Impact sur les animaux

Le déclenchement de la fibrose pulmonaire chez la souris peut provoquer un essoufflement, une fatigue générale et une perte de poids. Bien qu'il n'existe pas encore de données publiées sur l'influence exacte de la fibrose sur le développement des tumeurs dans ce modèle précis, nos premières observations montrent une augmentation des lésions précoces au bout de deux semaines. Même si le cancer peut affecter le quotidien des animaux, son impact reste ici limité car l'étude se termine volontairement au 28ème jour, bien avant que la maladie ne soit trop avancée. Les effets indésirables du cancer peuvent ainsi comprendre une modification de l’apparence, du comportement, fatigue, perte de poids et difficultés respiratoires.

Devenir

Les poumons seront prélevés après l’euthanasie de l’animal.

Remplacement

Pour l'instant, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire fidèlement la réaction d'un poumon entier en cas de fibrose pulmonaire. En effet, pour bien comprendre comment le système immunitaire réagit dans les poumons, il est indispensable d'observer comment les cellules de défense arrivent d'autres parties du corps par le sang, un mécanisme impossible à simuler totalement de manière artificielle. Ce constat s'appuie sur des échanges réguliers avec d'autres experts lors de congrès internationaux, ainsi que sur une analyse très poussée des recherches publiées entre 2010 et 2025 dans les bases de données scientifiques de référence. Bien que notre laboratoire utilise déjà des techniques innovantes, comme des mini-organes créés en éprouvette ou des fragments de tissus humains, ces modèles ont leurs limites : ils ne possèdent pas encore de système immunitaire complet et ne peuvent pas montrer le mouvement des cellules dans l'organisme, ce qui nous oblige à maintenir ces études pour obtenir des réponses précises. Pour toutes ces raisons, il est nécessaire de recourir à un organisme entier vivant.

Réduction

Des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation de cellules vivantes extraites des tissus pulmonaires et modélisation informatique. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Pour garantir la fiabilité des résultats, des méthodes de contrôle seront appliquées : la répartition aléatoire (randomisation), qui consiste à distribuer les souris au hasard dans les groupes pour qu’ils soient parfaitement comparables, et l’analyse en aveugle, où le chercheur évalue les échantillons sans connaître le traitement reçu par l’animal. Ces précautions assurent une neutralité totale et évitent que des attentes personnelles ou des différences individuelles n’influencent involontairement les conclusions de l’étude.

Raffinement

Pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l'étude, nous veillons avant tout à respecter leur nature sociale en évitant de les isoler ; ils resteront donc en groupe dans leurs cages pour limiter le stress. Lors des interventions techniques, comme les injections dans les voies respiratoires, les animaux sont systématiquement placés sous anesthésie profonde pour qu'ils ne ressentent aucune douleur. De plus, un médicament antidouleur leur est administré en amont de la procédure afin d'assurer un réveil et une récupération dans les meilleures conditions possibles. Enfin, leur cadre de vie est amélioré par ce qu'on appelle l'enrichissement du milieu : ils disposent de coton pour nicher, de tunnels pour se cacher et d'une alimentation spécifique sous forme de gel, très nutritive et facile à consommer, afin de favoriser leur confort quotidien. L'équipe de recherche et le personnel de l'animalerie assurent une attention constante aux animaux en vérifiant chaque jour leur apparence physique et leur capacité à se déplacer normalement. Dès leur réveil après une intervention et jusqu'à la fin de l'étude, les animaux font l'objet d'un suivi rigoureux et quotidien. Pour garantir une évaluation objective, les chercheurs utilisent une grille de critères précis qui passe en revue l'aspect des yeux ou du pelage, le comportement social, la respiration, ainsi que l'évolution du poids. En cas d’altération de l’état générale de la souris selon les critères observées, la surveillance est renforcée pendant 24h. Si aucune amélioration n’est constatée, l’animal est euthanasié.

Choix des espèces

D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 12 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

8 chevaux atteints d'asthme sévère, appartenant à des particuliers, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant trois mois, chacun reçoit d'abord des pellets de foin, puis du foin sec pendant douze jours, exposition dont le porteur attend une toux, un jetage ou une gêne respiratoire modérée, avant dix jours de corticoïdes qui peuvent entraîner une fourbure ou une surinfection respiratoire. Cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires sous sédation, environ 45 minutes par cheval et par série, servent à chercher des exosomes susceptibles de renseigner sur l'inflammation pulmonaire. Aucun cheval n'est tué, les huit retournent à leur lieu de vie d'origine à la fin du protocole.

Objectifs

L’asthme équin regroupe plusieurs maladies respiratoires inflammatoires non infectieuses, récurrentes ou chroniques, qui altèrent durablement le confort et les performances du cheval. Parmi elles, l’asthme équin sévère concerne une part importante de la population équine, en particulier les chevaux adultes et âgés. Aujourd’hui, son diagnostic repose principalement sur l’examen clinique et sur l’analyse du lavage bronchoalvéolaire, qui permet d’évaluer l’inflammation dans les voies respiratoires profondes. Cependant, cet examen de référence n’est pas toujours réalisable, notamment lorsque l’animal présente une crise respiratoire. En outre, il reste difficile de distinguer avec précision un cheval asthmatique en rémission d’un cheval atteint d’une forme modérée ou d’un cheval sain. Ce projet propose d’explorer une piste innovante : l’étude des exosomes, de très petites vésicules libérées par les cellules, présentes notamment dans le sang et dans les fluides respiratoires. Ces structures jouent un rôle majeur dans la communication cellulaire et pourraient refléter fidèlement les mécanismes à l’œuvre dans les poumons au cours de l’asthme. En analysant de manière large leur contenu biologique, le projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de l’asthme équin sévère, à identifier de nouveaux biomarqueurs et, à plus long terme, à ouvrir la voie vers des outils diagnostiques plus simples et des approches thérapeutiques mieux ciblées. L’enjeu est important : mieux détecter, mieux suivre et, demain, mieux traiter cette affection respiratoire fréquente en médecine vétérinaire équine.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu est une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’asthme équin sévère. Cette avancée est essentielle, car une meilleure connaissance de la maladie constitue la base d’une prise en charge plus précise, plus précoce et plus adaptée aux chevaux atteints. En médecine vétérinaire équine, où les outils diagnostiques restent parfois limités, tout progrès dans la compréhension fine de la maladie peut avoir un impact direct sur la qualité du suivi clinique. Le projet doit également permettre d’établir un véritable “profil” des exosomes et de leur contenu selon deux paramètres majeurs : le type d’exposition étudié et la réponse au traitement par corticoïdes. Cette approche pourrait aider à identifier des signatures biologiques utiles pour mieux repérer les phases d’aggravation, objectiver l’amélioration sous traitement et, à terme, affiner le pronostic et le suivi des chevaux asthmatiques. Il s’agit donc d’une recherche à fort potentiel translationnel, c’est-à-dire susceptible de déboucher sur des applications concrètes pour la pratique vétérinaire. Enfin, le projet doit aussi préciser si l’alimentation à base de pellets de foin peut être considérée comme sûre sur le plan respiratoire chez les chevaux souffrant d’asthme. Cet aspect présente un intérêt très concret, car la gestion de l’environnement et de l’alimentation fait partie intégrante de la prise en charge de cette pathologie. Si leur innocuité est confirmée, ces aliments pourraient représenter une solution pratique et sécurisée pour limiter l’exposition à des facteurs aggravants, tout en facilitant la conduite quotidienne des chevaux asthmatiques.

Procédures

Sur une période de trois mois, huit chevaux atteints d’asthme équin sévère seront suivis au cours de plusieurs phases successives. Ils seront d’abord exposés à une alimentation sous forme de pellets, puis à du foin sec, chaque période durant douze jours, avant de recevoir un traitement corticoïde pendant dix jours. Au cours de cette étude, cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires de seront réalisés chez chaque cheval, après sédation, afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses. Chaque série de prélèvements (sang + LBA) durera environ 45 minutes par cheval.

Impact sur les animaux

L’exposition au foin sec pendant deux semaines peut entraîner chez certains chevaux une réaction clinique modérée et transitoire, avec apparition possible de toux, de jetage ou de gêne respiratoire modérée. Cette aggravation reste réversible et fera l’objet d’une surveillance attentive dans le cadre du protocole. Elle est précisément étudiée, car elle permet de mieux comprendre les facteurs susceptibles de déclencher ou d’entretenir l’asthme équin sévère. La réalisation des lavages bronchoalvéolaires peut provoquer une toux passagère lors du passage de l’endoscope, malgré l’ensemble des précautions prises. Les prises de sang et la sédation peuvent aussi s’accompagner d’effets secondaires limités, tels qu’un hématome local ou, de manière transitoire, une ataxie, une bradycardie ou une hypotension. Un risque d’hémorragie existe également lors du lavage bronchoalvéolaire si une zone fragile est touchée, mais ce risque reste limité par l’utilisation d’un endoscope. Dans les minutes suivant la sédation, un risque de fausse déglutition est aussi pris en compte. Enfin, l’administration de corticoïdes peut comporter un risque potentiel de fourbure ou de surinfection respiratoire. L’ensemble de ces effets indésirables est connu, anticipé et encadré par des mesures de prévention adaptées. Le protocole a donc été construit de manière à concilier l’intérêt scientifique du projet avec un niveau élevé de vigilance vis-à-vis du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux sont maintenus en vie à l'issue de la procédure, et pourront ainsi retourner à leur milieu de vie d'origine.

Remplacement

L’étude de l’asthme équin sévère nécessite d’observer une maladie respiratoire complexe dans l’organisme entier, avec l’ensemble des interactions entre les voies respiratoires, le système immunitaire et les autres organes. À ce jour, cette réalité biologique ne peut pas être reproduite de manière complète par des modèles alternatifs seuls. C’est pourquoi l’utilisation de chevaux est nécessaire pour répondre de façon pertinente aux objectifs principaux du projet. Toutefois, les prélèvements réalisés ne serviront pas uniquement à l’analyse in vivo. Ils permettront aussi de mener des investigations ex vivo afin d’explorer plus finement le rôle potentiel des exosomes et les réponses cellulaires associées. Cette stratégie permet de tirer le meilleur parti possible des échantillons recueillis et de produire des connaissances qui pourront, à terme, préparer le développement de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit l’étude de huit chevaux asthmatiques, sans ajout d’un groupe contrôle distinct. Ce choix permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives sur les paramètres étudiés. Il s’appuie en outre sur des travaux antérieurs, qui ont déjà apporté des éléments concernant la tolérance respiratoire de l’alimentation administrée. Par ailleurs, chaque cheval représentera son propre contrôle lors des différentes étapes du protocole. Cette approche est particulièrement pertinente, car elle réduit la variabilité entre individus et permet d’obtenir des résultats robustes avec un effectif restreint. Elle contribue ainsi à répondre à une double exigence : produire des données scientifiques solides tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Afin de « limiter » l’impact d’une éventuelle dégradation clinique des chevaux asthmatiques sévères sur le déroulé du projet, l'ordre des phases d’exposition ne sera pas aléatoire. En effet, chaque cheval recevra initialement les pellets, et ne recevra le foin sec que lors de la phase suivante. Par ailleurs, les différents chevaux recevront systématiquement un traitement par corticoïdes à l’issue du projet. Également, le rassemblement des différents chevaux (appartenant à des particuliers volontaires pour participer à ce projet de recherche) se fera par étapes successives (espacées de 24 à 48h) afin de limiter le stress lors de la mise en lot. Ainsi, les 8 chevaux seront tous ensemble dans la pâture à partir de J-21 (début du maintien dans l'environnement "faible en poussière"). Celle-ci sera de dimension suffisante (10 hectares) et localisée au plus "proche" de leurs lieux respectifs de stationnement habituel. Une personne attitrée prendra soin et manipulera quotidiennement les différents chevaux tout au long de la procédure, afin de pouvoir mettre en place un climat de confiance auprès de chaque cheval. Une sédation est prévue préalablement à la réalisation des prélèvements, ainsi que l'utilisation d'un anesthésique local au préalable dans la trachée et les bronches principales afin de limiter l'inconfort et la réaction de toux lors du passage de l'endoscope. À lissue des prélèvements, les chevaux seront équipés d'un panier de jeûne et temporairement placés dans un paddock individuel, délimité dans la pâture proprement dite, et donc à proximité immédiate des différents congénères. Une surveillance visuelle sera mise en place pendant cette période, et le cheval ultérieurement libéré de son panier et relaché dans le pré une fois dissipés les effets de la sédation.

Choix des espèces

Les travaux menés ont pour espèce cible le cheval, et ses spécificités intrinsèques en termes de gestion alimentaire et environnementale. Critères d’inclusion des animaux dans le projet : chevaux adultes (> 6 ans ; > 400 kg) ; préalablement diagnostiqués comme asthmatiques sévère. Critère d’exclusion des animaux dans le projet : Présenter des signes cliniques (autres que respiratoires), ou toute anomalie aux examens complémentaires (prise de sang, endoscopie et prélèvements des voies respiratoires)

264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, foie, rate, cerveau et ganglion médiastinal. Les souris reçoivent une puce d'identification, une infection intranasale par Mycobacterium bovis sous anesthésie, puis une prise de sang par semaine et deux pesées hebdomadaires. Parmi les bénéfices attendus, le porteur place la mise au point d'une vidéosurveillance des animaux infectés en isolateur, présentée comme un moyen de détecter plus tôt les comportements annonçant les points limites. Il indique partir de vingt-quatre souris pour en conserver six au dernier jour du protocole, un quart des animaux contrôlant l'infection en formant des granulomes, les dix-huit ou dix-neuf autres se dégradant jusqu'aux points limites et étant tués entre le vingt et unième et le trente-cinquième jour.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.