Depuis 2021, les États membres de l’Union européenne doivent publier sous un format standardisé les résumés non techniques (RNT) des projets d’expérimentation animale autorisés sur leur territoire.
Le système européen ALURES, qui recense ces RNT, est exclusivement en anglais et manque cruellement d’ergonomie (un nouvel outil proposé depuis 2026 résoud partiellement ce problème). L’OXA regroupe donc régulièrement ici les RNT français pour en faciliter l’exploration et la compréhension d’ensemble.
Le contenu des résumés non techniques est rédigé à des fins de communication par les établissements d’expérimentation animale. Ces résumés sont donc soumis, au minimum, au biais de désirabilité sociale, qui peut avoir pour conséquence de mettre en avant de manière détaillée les bénéfices attendus et de limiter les détails et la description des contraintes imposées aux animaux. Par ailleurs, n’étant pas sourcées ni soumises à une relecture par les pairs, les affirmations contenues dans les RNT sur des sujets scientifiques n’ont aucune valeur de preuve, mais fournissent des indications sur le cadre théorique dans lequel les établissements travaillent.
NB. La sélection d’une période temporelle, plutôt que d’une simple date, sera disponible dès que l’extension de filtrage utilisée le permettra.
Documents
Niveau de souffrances
Dernières données ajoutées : projets autorisés en janvier 2026 (02/02/2026)
CONSEQUENCE DU VIEILLISSEMENT HEPATIQUE SUR LES MALADIES LIEES A L’AGE – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Objectifs
Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.
Bénéfices attendus
L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.
Procédures
Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang) (MODIFICATION) - plusieurs lot de souris recevront des doses croissantes de bactéries afin de trouver la dose optimale pour induire une infection non léthal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : * (MODIFICATION) Pour les modèles d'infections bactériennes, les fortes doses peuvent entrainer une mortalité chez une partie des souris. Mais nous avons mis en place un suivi afin de veiller au bien-être animal. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.
Remplacement
Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.
Réduction
Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.
Evaluation de l’efficacité de différents traitements lors de l’interruption du flux sanguin intestinale.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Objectifs
L’ischémie mésentérique aiguë (IMA) ou ischémie intestinale est une urgence médicale grave qui touche les vaisseaux sanguins de l’intestin. Elle survient lorsque le sang ne circule plus correctement vers l’intestin, ce qui peut entraîner sa destruction (infarctus intestinal) en quelques heures. Malgré les progrès de la médecine, cette maladie reste très dangereuse, avec un risque élevé de chirurgie lourde (ablation de l’intestin) et un taux de mortalité important, surtout en dehors des centres spécialisés. Même lorsque le flux sanguin est rétabli, des complications graves peuvent survenir à cause de l’inflammation et des caillots provoqués par ce qu’on appelle le phénomène d’ischémie/reperfusion (I/R). Actuellement, les traitements reposent sur les anticoagulants et les antibiotiques, mais leurs effets sont encore mal compris. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes de cette inflammation pour développer des traitements plus ciblés. Grâce à un modèle expérimental sur la souris, nous testons de nouvelles pistes thérapeutiques pour protéger l’intestin et améliorer le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
Quand une artère se bouche près de l’intestin, il est souvent difficile de rétablir correctement la circulation sanguine dans les petits vaisseaux en aval. Ce projet de recherche cherche à comprendre pourquoi, et à trouver des moyens d’améliorer cette "reperfusion", essentielle pour éviter des lésions graves. Une partie du problème vient de l’inflammation, des caillots (thrombose) et des troubles de la coagulation qui se déclenchent lorsque le sang revient après une interruption. Si on n’agit pas rapidement sur ces mécanismes, les tissus peuvent être irrémédiablement endommagés. Pour limiter ces effets, plusieurs traitements sont en cours d’étude : des anti-inflammatoires ciblés, des anticoagulants, des médicaments qui protègent la paroi de l’intestin, ou encore des antibiotiques pour freiner les infections graves (sepsis). Ces approches pourraient améliorer considérablement le pronostic dans des situations critiques comme l’ischémie mésentérique aiguë, certains chocs en réanimation, ou les greffes intestinales.
Procédures
Dans cette étude, les souris suivront une procédure médicale visant à reproduire une situation grave que l’on retrouve chez l’humain : une interruption temporaire de la circulation sanguine vers l’intestin. Pour cela, un petit clip est placé pendant 1 heure sur l’artère principale qui alimente l’intestin (la durée totale de la chirurgie sera de 1h30). Ensuite, le sang est laissé circuler à nouveau, et différents traitements seront testés par injection (temps d'injection limité à moins de 15 secondes). Certaines souris recevront aussi un traitement antibiotique (ajouté dans l'eau de boisson des animaux pendant 2 semaines) avant l’opération. Des prises de sang seront effectuées avant et après la chirurgie pour mieux comprendre les effets de l’ischémie et des traitements. Tout cela se fera sous anesthésie générale, pour que les animaux ne ressentent aucune douleur pendant les interventions. Après l’opération, les souris seront suivies de près chaque jour. Si un signe de douleur est observé, un antidouleur leur sera injecté. Si la douleur ne peut pas être soulagée, l’animal sera euthanasié dans le respect de son bien-être. Les animaux seront observés pendant 72h maximum avant d'être ré-opéré sous anhestésie générale pour une observation de l'état des vaisseaux alimentant l'intestin. Cette chirurgie terminale durera 20 minutes. En fin d'expérimentation, les animaux seront euthanasiés sans phase de réveil.
Impact sur les animaux
Quand le sang n’arrive plus correctement à l’intestin (on parle d’ischémie mésentérique), cela peut provoquer des lésions irréversibles. Sans intervention rapide, des bactéries provenant du microbiote intestinal peuvent passer dans le reste du corps, entraînant une infection grave (sepsis) et un risque de défaillance des organes vitaux. Après chaque épisode d’ischémie et de rétablissement du flux sanguin (appelé "reperfusion"), les réactions sont très variables. Chez certaines souris, une partie de l’intestin est déjà abîmée pendant l'ischémie, alors que chez d’autres, les lésions apparaissent après la reprise de la circulation. Lors d’expériences sur la souris, plusieurs signes peuvent apparaître après une heure d’ischémie et pendant la reperfusion : perte de poids importante, douleurs, baisse d’appétit, faiblesse générale, déshydratation ou irritation au niveau des sutures. Pour observer ce qui se passe dans l’intestin, des techniques comme l’imagerie laser sont utilisées de façon brève et ciblée afin de ne pas causer d’effets secondaires. Ces observations sont bien tolérées, comme l'ont montré nos études précédentes.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion mésentérique est une maladie rare mais extrêmement grave. Elle survient lorsque la circulation sanguine vers l’intestin est interrompue, puis rétablie. Ce phénomène peut entraîner de lourdes complications, comme des infections généralisées (sepsis), et un taux de mortalité très élevé, pouvant atteindre 80 % chez l’humain. C’est une maladie complexe, encore mal connue, qui touche à la fois les artères, les veines, l’intestin et le système immunitaire. Elle varie beaucoup d’une personne à l’autre, ce qui rend son étude encore plus difficile. À cause de cette complexité, il n’est pas possible de la modéliser correctement en laboratoire à l’aide de cellules seules (modèles in vitro) ou d’ordinateurs (modèles numériques). C’est pourquoi les chercheurs utilisent un modèle animal, notamment la souris, pour mieux comprendre les mécanismes en jeu et tester de nouveaux traitements. C’est aujourd’hui la méthode la plus fiable pour faire avancer la recherche sur cette pathologie.
Réduction
Dans notre recherche, nous utilisons 10 souris par groupe. Ce nombre a été soigneusement calculé : il s'agit du minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et scientifiquement valides. Cela nous permet de prendre en compte les différences naturelles entre les animaux, car les effets de l’ischémie intestinale ne sont pas toujours identiques d’un individu à l’autre. Pour comparer les effets des traitements, nous utiliserons des outils statistiques reconnus. Cela nous aidera à savoir si les différences observées entre les groupes sont vraiment dues au traitement ou simplement au hasard. Nous testerons d’abord deux doses pour chaque traitement, sur une courte durée (1 heure), afin de choisir la plus efficace. Seule cette dose sera ensuite utilisée pour les tests plus longs. Enfin, pour limiter le nombre d’animaux, les groupes témoins seront mutualisés dès que cela est possible, notamment lorsque plusieurs traitements ont le même placebo.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période de repos et d’adaptation de 7 à 10 jours avant toute intervention. Pendant ce temps, ils vivent dans un environnement confortable avec de la nourriture et de l’eau à volonté, ainsi que du matériel pour faire leur nid et jouer, afin de limiter le stress. Les animaux sont observés chaque jour par le personnel animalier, en plus de la surveillance régulière de l’expérimentateur. Si un signe inhabituel ou inquiétant est détecté, une intervention immédiate est prévue. En cas de douleur légère (même si elle ne dépasse pas le seuil critique), la surveillance est renforcée deux fois par jour. Pour améliorer leur confort, des croquettes humidifiées sont ajoutées dans la cage, et un antidouleur est administré une fois par jour par une petite injection, avec une aiguille fine, afin de soulager efficacement la douleur.
Choix des espèces
Notre laboratoire a une grande expérience dans le travail avec les souris, à chaque étape : soins avant les expériences, gestion du stress, anesthésie, chirurgie, suivi de l’état de santé, soulagement de la douleur et, si nécessaire, euthanasie dans le respect du bien-être animal. Pour observer les vaisseaux sanguins dans l’intestin à l’aide d’un microscope spécialisé (microscopie intravitale), nous utilisons de jeunes souris males ou femelles d’environ 7 semaines et pesant 20 g. Ce choix permet une observation claire, car au-delà de ce poids, la graisse empêche de bien voir les vaisseaux. Les résultats obtenus grâce à ce modèle permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques, en particulier ceux liés à l’inflammation ou à de nouveaux traitements. Ces données sont utiles pour la recherche médicale humaine, car de nombreuses réactions sont similaires entre la souris et l’humain.
Utilisation de souris transgéniques pour étudier des intéractions protéiques lors de la mobilisation des graisses – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Objectifs
Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.
Procédures
Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. MODIFICATION : durée du régime réduite à 9 jours. Les animaux seront pesés chaque semaine. MODIFICATION : pesée des animaux tous les jours. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. MODIFICATION : mesure de la glycémie tous les 2 jours. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.
Impact sur les animaux
Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. MODIFICATION : le régime cétogène peut induire une diminution de la prise alimentaire conduisant à une réduction de la mobilité. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude de la physiopathologie hépatique à l’aide de modèles murins MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Objectifs
Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie. MODIFICATION : L’ajout d’un geste technique sur certains animaux pour étudier l'activité traductionnelle implique une modification du projet initial sans ajout d’animaux.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.
Procédures
1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection unique de virus sous anesthésie générale en 30 secondes b) une injection unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes c) une injection unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30 secondes (pendant 2 mois maximum) d) une injection unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30 secondes MODIFICATION 3) certains animaux pourront recevoir une injection d'antibiotique modifié permettant de mesurer l'activité de traduction, 4) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections d'anti-oestrogènes, d'anticorps, d'antibiotique ou de toxine peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille. L'injection répétée d'anticorps peut conduire à des péritonites ou infections.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.
Rôle de la sécrétion des plaquettes sanguines dans les maladies métaboliques hépatiques (EU (2/2))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Objectifs
Les maladies du foie liées au métabolisme, appelées maladies hépatiques métaboliques sont des atteintes du foie qui apparaissent dans le cadre du syndrome métabolique. Ce syndrome correspond à l’association de plusieurs troubles liés à l’obésité, comme une augmentation de la graisse abdominale, un diabète, une hypertension ou des anomalies des graisses dans le sang. Ces maladies du foie peuvent rester longtemps silencieuses, mais elles peuvent aussi évoluer vers des formes graves comme la cirrhose ou le cancer du foie. Dans ce dernier cas, le pronostic est très sombre, avec un taux de survie d’environ 10 % à 5 ans. Atteignant plus de 30 % de la population dans les pays occidentaux, ces maladies hépatiques représentent un véritable enjeu de santé publique. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) les considère désormais comme la première cause de maladies du foie dans ces pays. Même si ces maladies sont souvent associées à l’obésité et au syndrome métabolique, leur origine exacte varie selon les patients et reste encore mal comprise. Cela rend leur prévention et leur traitement particulièrement difficiles. L’une des questions importantes et encore peu explorées concerne le rôle des plaquettes sanguines. Les plaquettes sont de petites cellules du sang qui permettent d’arrêter les saignements et de maintenir l’intégrité des vaisseaux sanguins. Comprendre comment elles pourraient influencer l’apparition ou l’évolution des maladies hépatiques métaboliques ouvre une nouvelle piste de recherche très prometteuse. Ce travail s’inscrit dans une approche globale en tenant compte de l’ensemble du fonctionnement du corps, des organes et de leurs interactions. Cette vision globale est essentielle pour comprendre ces maladies complexes et multifactorielles. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU) différents (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.
Procédures
La souris sera soumise à différents régimes alimentaires riches en lipides de 1, 8, 12, 16 ou 52 semaines en fonction du régime utilisé et du stade de la maladie étudié. La souris sera soumise à des procédures avec des injections (intra-orbitaire : 1 injection de 15 sec, intra-péritonéale : 1 à 2 injections de 15 sec et sous-cutané : 1 injection de 15 sec). 7 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris vigile ou 1 prélèvement sanguin terminal de 1-2 minutes sur souris anesthésiée seront réalisés. La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance. Pour une procédure, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h. Pour une procédure, une perfusion intra-cardiaque (1 minute) sera réalisée suite à une anesthésie générale et une antalgie locale.
Impact sur les animaux
La mise en régime riche en lipides chez la souris induit différents effets indésirables telles qu’une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe ou un cancer du foie. Les animaux utilisés dans ce projet pourront éprouver un stress modéré et un inconfort à cause d'injections, de mise à jeun et de mise en isolement.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement sanguin (1 ml de sang) et d’organes pour les procédures 1 et 3. Pour la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort ne pouvant pas etre utilisés pour d’autres procédures dû au stress après isolement de 72h.
Remplacement
Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. A ce jour, aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme. L’expérimentation animale reste donc, à ce jour, la seule méthode permettant d’étudier cette maladie dans toute sa complexité.
Réduction
Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.
Raffinement
Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur. De l’aliment hydratée pourra être mise à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Si des plaies apparaissent, des soins/désinfections seront prodigués à la souris. En fonction de son état, la souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation. Si des signes décrits dans la grille de score apparaissent, le zootechnicien ou l’experimentateur doivent se referrer à cette grille de score et agir avec l’accord du responsable du projet. Au bout de 48h si les signes persistentet les points limites atteints, la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mécanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).
Etude des mécanismes et réponses immunitaires des allergies alimentaires chez la souris, test de candidats médicaments et thérapies innovantes
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Objectifs
Les allergies alimentaires et les réactions graves qu’elles peuvent provoquer, comme l’anaphylaxie (une réaction très rapide pouvant mettre la vie en danger), constituent aujourd’hui un important problème de santé publique. Leur fréquence augmente et elles peuvent être très sévères. En Europe, on estime que 3 à 6 % des adultes et 6 à 13 % des enfants sont concernés. L’allergie à l’arachide est l’une des plus redoutées. Lorsqu’une personne allergique en consomme, elle peut développer des symptômes digestifs (vomissements, diarrhée, douleurs au ventre), cutanés (gonflements), respiratoires (difficultés à respirer) et cardiovasculaires (baisse de la tension), pouvant aller jusqu’à la perte de connaissance et, dans de rares cas, au décès. Pour mieux comprendre ces allergies et développer de nouveaux traitements, les chercheurs utilisent des modèles animaux, notamment des modèles chez la souris. Cela permet d’étudier de près les mécanismes biologiques qui déclenchent l’allergie et l’anaphylaxie. L’objectif de ce projet est de créer et d’analyser un modèle de souris allergiques à l’arachide (par exemple au beurre d’arachide). Ce modèle aidera à mieux comprendre comment l’allergie se développe, comment la réaction allergique survient et quels sont les mécanismes immunologiques impliqués. À terme, il servira aussi à tester de nouveaux médicaments ou stratégies thérapeutiques contre l’allergie à l’arachide. Le projet se déroule en trois procédure autour des objectifs spécifiques suivants : 1. Développer le modèle d’allergie alimentaire o Mettre au point un protocole reproductible pour rendre les souris allergiques à l’arachide et déclencher une réaction allergique. o Déterminer les doses, la fréquence et les conditions qui provoquent une réaction allergique fiable et spécifique. 2.Tester des composés à visée thérapeutique o Évaluer l’efficacité de candidats médicaments pour réduire ou prévenir la réaction allergique. 3. Etudier les mécanismes biologiques impliqués o Analyser les voies de signalisation et les réponses immunitaires activées dans ce modèle.
Bénéfices attendus
L’allergie à l’arachide est l’une des allergies alimentaires les plus graves. Elle peut durer toute la vie et provoquer des réactions très violentes, comme le choc anaphylactique, qui peut être mortel. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement pour guérir cette allergie : la seule solution est d’éviter complètement l’arachide et de savoir réagir en cas d’urgence. Ce projet vise plusieurs objectifs importants : • Mieux comprendre comment et pourquoi le corps devient allergique à l’arachide, en étudiant les mécanismes du système immunitaire impliqués dans ces réactions. • Créer un modèle animal fiable pour pouvoir tester de nouveaux médicaments, des méthodes pour rendre les patients moins sensibles à l’arachide, ou de nouvelles formes d’immunothérapie. • Identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la gravité de l’allergie ou la manière dont un patient répondra à un futur traitement. Ces avancées permettront d’améliorer la prise en charge des personnes allergiques, de réduire le nombre d’hospitalisations dues aux réactions graves, et de favoriser le développement de traitements plus ciblés et mieux tolérés à l’avenir.
Procédures
L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire (5x maximum, et 1x/semaine) peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance.
Impact sur les animaux
Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie par exemple diarrhée, douleurs abdominales comme chez l’homme. La douleur pourra générer une hypothermie et/ou une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. Nous proposons donc une procédure de suivi utilisant une grille de score. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux infections, car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Si nous sommes amenés à en utiliser, elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes manipulations pendant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris s'il y a lieu).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à la validation du modèle et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.
Remplacement
La mise en place d’un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide implique nécessairement l’utilisation d’un organisme entier. En effet, les mécanismes allergiques requièrent une complexité physiologique et immunologique qui ne peut être reproduite in vitro à ce jour. Néanmoins, une stratégie active de remplacement partiel a été intégrée dans la conception du projet : • Avant de démarrer les phases in vivo, une caractérisation biochimique poussée des extraits /ou beurre d’arachide est effectuée in vitro, afin de valider les lots expérimentaux et limiter les tests sur animaux. • Des cultures cellulaires primaires ou lignées humaines sont utilisées pour tester in vitro la réactivité aux extraits. Ces approches permettent d’optimiser la qualité des extraits et de prédire leur capacité à induire une réponse immunitaire. Cependant, le déclenchement et l’étude fine de la réaction allergique, de l’inflammation intestinale in situ et des paramètres cliniques systémiques nécessitent une approche in vivo. Aucun substitut ne permet actuellement d’évaluer de manière fiable les conséquences physiopathologiques complètes d’une exposition répétée à un allergène alimentaire chez l’humain.
Réduction
Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés tout au long du projet. Cette réduction repose sur une planification expérimentale rigoureuse, sur l’analyse statistique en amont, et sur l’exploitation optimale des données récoltées. Plusieurs mesures concrètes de réduction sont mises en œuvre : 1. Tests pilotes préalables : Un petit nombre d’animaux (n < 10) sera utilisé dans une phase préliminaire pour identifier les doses optimales d’allergène, les modalités de sensibilisation et les fenêtres de provocation les plus pertinentes. Cela évitera les essais multiples à grande échelle. 2. Calcul de puissance statistique : Les effectifs animaux par groupe sont justifiés par une analyse de puissance (power analysis) permettant d’atteindre une significativité statistique avec un minimum d’animaux (généralement 6 à 10 par groupe selon les variables mesurées). 3. Utilisation de groupes partagés : Certains groupes témoins (souris naïves ou sensibilisées mais non provoquées) peuvent être communs à plusieurs sous-expériences si les conditions restent identiques. Cela limite le nombre total de groupes expérimentaux.
Raffinement
Le projet intègre de nombreuses mesures de raffinement visant à minimiser la douleur, le stress, et les souffrances potentielles des animaux, tout en améliorant la qualité des données scientifiques obtenues. Les mesures principales ci-dessous listées seront mises en œuvre : Sélection des méthodes les moins invasives possibles : o La voie intragastrique est privilégiée à la voie intrapéritonéale lorsque possible. o L’utilisation d’aiguilles fines, la réduction du nombre d’injections, et le recours à des formulations douces sont privilégiés. Nous n'envisageons pas de faire un apprentissage d'administration du beurre d'arachide de manière volontaire sans passer par l'administration intragastrique car cela demande une étape d'entrainement importante avant de pourvoir réaliser ce geste et de garantir la quantité prise par administration.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet en raison de sa réponse immunitaire bien caractérisée et de sa forte sensibilité aux allergènes alimentaires. Les souris de différentes lignées classiques sont particulièrement adaptées pour modéliser la sensibilisation à l’arachide et les réactions allergiques. La souris permet une reproductibilité expérimentale élevée, un suivi longitudinal individuel, et offre un accès à de nombreux outils immunologiques et génétiques (anticorps, lignées transgéniques). Les animaux sont utilisés au stade adulte, de 7 à 16 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Travaux pratiques de Biologie et Physiologie de la Cellule Animale dans le cadre de la formation initiale d’étudiants de licence 3 : préparation d’hépatocytes isolés pour l’étude de la dédifférenciation cellulaire.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Objectifs
Les hépatocytes (qui représentent 60% des cellules du foie) cultivés in vitro sont un puissant outil permettant d’étudier le fonctionnement du foie. Malheureusement, le geste technique permettant leur préparation mais également leur maintien en culture a été montré comme étant très difficiles. En effet, des conditions de culture ordinaires ou mal contrôlées conduisent à la transformation (dédifférenciation) des hépatocytes produisant un rapide changement de leur morphologie et une réduction significative de leurs fonctions biologiques spécifiques. Le but de cet enseignement pratique de physiologie animale est de présenter aux étudiants cette notion de transformation des hépatocytes issus d’une préparation et mise en culture, ainsi que d’étudier avec eux des conditions de culture cellulaire permettant de la limiter ces modifications de forme et de fonctions de ces cellules du foie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont d’ordre pédagogiques. En effet, cet enseignement pratique de physiologie animale vise à rendre « concret » ce concept étudié en travaux dirigés qu’est la dédifférenciation des hépatocytes. Ainsi, les étudiants, via l’utilisation d’une culture primaire d’hépatocytes de rat, étudieront des conditions de culture cellulaire (composés solubles et insolubles dans le milieu de culture) permettant de limiter la dédifférenciation des hépatocytes.
Procédures
Aucun traitement/intervention ne sera effectué en amont de la séance de travaux pratiques. Ainsi, aucune douleur n’est attendue durant leur hébergement en zone conventionnelle. Suite à la pose du cathéter dans la veine porte, la perfusion du foie est immédiatement débutée (ce qui entraine la mort instantanément de l’animal) pour une durée de 2 à 3 minutes ; temps nécessaire pour exciser le foie de la cavité abdominale du rat afin de poursuite la perfusion « ex vivo ».
Impact sur les animaux
La douleur et la souffrance potentielles du rat seront réduites à celle de l’introduction d’une aiguille 26G dans l’abdomen de l’animal lors de son anesthésie. Afin de minimiser son angoisse, celui-ci sera anesthésié dans une salle d’opération de l’animalerie (proche de la salle d’enseignement pratique) pour ne pas être en présence de « nombreux » étudiants pouvant le stresser. De plus, l’acte sera réalisé par l’enseignant expérimenté pour cette procédure expérimentale et possédant l’expérimentation animale niveau concepteur avec une formation en chirurgie expérimentale sur rongeurs.
Devenir
Tous les rats de ce projet seront mis à mort suite à la perfusion de leur foie via la veine porte. En effet, suite à la pose du cathéter dans la veine porte, la perfusion du foie est immédiatement débutée ce qui entraine la mort instantanée de l’animal permettant d’exciser le foie de la cavité abdominale du rat afin de poursuite la perfusion « ex vivo ».
Remplacement
L’enseignement de la dédifférenciation des hépatocytes et l’étude de conditions de culture cellulaire permettant de limiter cette dernière, nous oblige à avoir recours à l’animal pour réaliser une primo-culture hépatocytaire. En effet, il n’existe actuellement pas de méthode ou de modèle de substitution permettant d’étudier ce phénomène de mise en place de la dédifférenciation qui ne peut pas être observé sur des lignées cellulaires établies. Nous utiliserons le rat comme modèle animal car il serait nécessaire d’avoir recours à beaucoup plus d’animaux si nous avions opté pour le modèle souris.
Réduction
40 à 60 millions d’hépatocytes par gramme de foie de rat pouvant être recueillis grâce à cette méthode, un seul rat ayant un foie d’environ 20g est par conséquent amplement suffisant pour chaque séance de travaux pratiques regroupant une douzaine d’étudiants permettant ainsi de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser au maximum l’angoisse du rat, celui-ci sera anesthésié dans une salle d’opération de l’animalerie (proche de la salle d’enseignement pratique) pour ne pas être en présence de « nombreux » étudiants pouvant le stresser. Dans l’objectif de réduire au maximum tout inconfort chez le rat durant la procédure expérimentale, la perfusion du foie de l’animal sera réalisée par l’enseignant maitrisant parfaitement le geste technique sous anesthésie profonde. De plus, en amont de la séance de Travaux Pratiques (TP), les étudiants auront, durant 2h de travaux dirigés, un enseignement leur présentant non seulement les objectifs pédagogiques et scientifiques de la séance de TP mais également une forte sensibilisation au bien-être animal, au respect de la règle des 3R et à la réglementation en vigueur relative à l’expérimentation animale. En effet, seront détaillées les différentes étapes pratiques mises en place pour la réduction au maximum de la douleur lors de la perfusion du foie de l’animal avec une anesthésie profonde ainsi qu’une analgésie pour la réalisation de cette perfusion. Enfin, la procédure étant un prélèvement sur animal anesthésié profondément puis mis à mort sans réveil, il n’est pas défini de points limites.
Choix des espèces
Dans un souci pédagogique, le rat est préférentiellement utilisé pour que le geste technique réalisé au niveau de la veine porte (permettant la perfusion du foie) puisse être observé par l’ensemble des étudiants de la séance (12 étudiants environ). Chez la souris, ce geste technique ne peut se faire qu’en ayant recours à une loupe binoculaire et représente un risque d’échec entrainant le recours à plus d’animaux. Des rats mâles adultes de 4 mois (des géniteurs réformés) seront utilisés. En effet, pour cette étude l’animal doit avoir un métabolisme hépatique mature mais pas encore impacté par un éventuel effet de l’âge.
Rôle de la sécrétion des plaquettes sanguines dans les maladies métaboliques hépatiques (EU (1/2))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Objectifs
Les maladies du foie liées au métabolisme, appelées maladies hépatiques métaboliques sont des atteintes du foie qui apparaissent dans le cadre du syndrome métabolique. Ce syndrome correspond à l’association de plusieurs troubles liés à l’obésité, comme une augmentation de la graisse abdominale, un diabète, une hypertension ou des anomalies des graisses dans le sang. Ces maladies du foie peuvent rester longtemps silencieuses, mais elles peuvent aussi évoluer vers des formes graves comme la cirrhose ou le cancer du foie. Dans ce dernier cas, le pronostic est très sombre, avec un taux de survie d’environ 10 % à 5 ans. Atteignant plus de 30 % de la population dans les pays occidentaux, ces maladies hépatiques représentent un véritable enjeu de santé publique. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) les considère désormais comme la première cause de maladies du foie dans ces pays. Même si ces maladies sont souvent associées à l’obésité et au syndrome métabolique, leur origine exacte varie selon les patients et reste encore mal comprise. Cela rend leur prévention et leur traitement particulièrement difficiles. L’une des questions importantes et encore peu explorées concerne le rôle des plaquettes sanguines. Les plaquettes sont de petites cellules du sang qui permettent d’arrêter les saignements et de maintenir l’intégrité des vaisseaux sanguins. Comprendre comment elles pourraient influencer l’apparition ou l’évolution des maladies hépatiques métaboliques ouvre une nouvelle piste de recherche très prometteuse. Ce travail s’inscrit dans une approche globale en tenant compte de l’ensemble du fonctionnement du corps, des organes et de leurs interactions. Cette vision globale est essentielle pour comprendre ces maladies complexes et multifactorielles. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU) différents (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.
Procédures
La souris sera soumise à différents régimes alimentaires riches en lipides de 1, 8, 12, 16 ou 52 semaines en fonction du régime utilisé et du stade de la maladie étudié. La souris sera soumise à des procédures avec des injections (intra-orbitaire : 1 injection de 15 sec, intra-péritonéale : 1 à 2 injections de 15 sec et sous-cutané : 1 injection de 15 sec). 7 prélèvements sanguins de 15 sec sur souris vigile ou 1 prélèvement sanguin terminal de 1-2 minutes sur souris anesthésiée seront réalisés. La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance. Pour une procédure, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h. Pour une procédure, une perfusion intra-cardiaque (1 minute) sera réalisée suite à une anesthésie générale et une antalgie locale.
Impact sur les animaux
La mise en régime riche en lipides chez la souris induit différents effets indésirables telles qu’une prise de poids et une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation de l’organe ou un cancer du foie. Les animaux utilisés dans ce projet pourront éprouver un stress modéré et un inconfort à cause d'injections, de mise à jeun et de mise en isolement.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement sanguin (1 ml de sang) et d’organes pour les procédures 1 et 3. Pour la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort ne pouvant pas etre utilisés pour d’autres procédures dû au stress après isolement de 72h.
Remplacement
Les processus qui contrôlent les plaquettes sanguines et les maladies du foie font intervenir de nombreux types de cellules et plusieurs organes, comme le foie, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux ou encore l’intestin. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire capable de reproduire fidèlement toutes ces interactions complexes. A ce jour, aucun système expérimental ne permet d’imiter un foie complet avec ses différents types de cellules et ses vaisseaux et de modéliser ses échanges avec d’autres organes. Notre projet étudie une maladie du foie qui résulte de plusieurs problèmes combinés : des troubles du métabolisme des graisses, de l’inflammation et des anomalies des vaisseaux sanguins. Pour comprendre ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des échanges métaboliques, hormonaux et immunitaires d’un organisme. L’expérimentation animale reste donc, à ce jour, la seule méthode permettant d’étudier cette maladie dans toute sa complexité.
Réduction
Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.
Raffinement
Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur. De l’aliment hydratée pourra être mise à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Si des plaies apparaissent, des soins/désinfections seront prodigués à la souris. En fonction de son état, la souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation. Si des signes décrits dans la grille de score apparaissent, le zootechnicien ou l’experimentateur doivent se referrer à cette grille de score et agir avec l’accord du responsable du projet. Au bout de 48h si les signes persistentet les points limites atteints, la souris sera mise à mort.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mécanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).
Etude de l’implication des voies de régulation immunitaire de l’hépatite auto-immune dans un modèle murin préclinique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Objectifs
L’hépatite auto-immune est une pathologie dont les causes restent méconnues. L’ L’hépatite auto-immune est caractérisée par une attaque immunitaire du foie conduisant à des niveaux élevés des enzymes hépatiques et des anticorps notamment des auto-antigènes. Les patients répondent pour la plupart bien aux traitements immunosuppresseurs non spécifiques; Toutefois, ces traitements à long terme ne sont pas sans effets délétères. Les cellules immunitaires sont classiquement considérées comme responsables des lésions hépatiques, mais les mécanismes cellulaires, notamment les antigène-spécifiques impliqués restent largement incompris. Notre équipe a mis en place des modèles murins ressemblant à l’hépatite auto-immune qui permettent d’étudier le rôle des cellules immunitaires spécifiques d’un antigène exprimé dans le foie. De nombreux outils sont disponibles pour l’expression et l’étude de cet antigène, permettant ainsi de suivre les réponses immunitaires spécifiques associée à l’antigène après expression de celui-ci dans le foie. Avec ce système, notre équipe a pu montrer que l’expression de l’antigène dans le foie des souris est tolérée et n’induit pas de réponse spécifique contre celui-ci, de plus que l’accumulation de cellules immunitaires dans le foie des souris dépend d’une immunisation préalable contre l’antigène et l’expression de celui-ci au niveau du foie. Nous avons également montré que les cellules immunitaires spécifiques de l’antigène ressemblaient aux cellules immunitaires auto-réactives chez les patients et que le blocage transitoire des molécules immunitaires inhibitrices perturbe le contrôle de cette réponse . Cependant, l’hépatite induite est peu détectable/minime et se résorbe rapidement ce qui diffère de la maladie chez l’homme. Notre hypothèse est que l’évolution chronique d’une auto-immunité dans le foie dépend d’une dérégulation de ces voies immunitaires inhibitrices sur le long terme. Dans cette mesure, nous souhaitons invalider, spécifiquement dans les hépatocytes, les gènes codant pour ces molécules inhibitrices et évaluer leur impact à court et long terme, ce qui permettrait une compréhension des mécanismes impliquées dans la maladie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront de mettre en évidence comment l’environnement hépatique joue un rôle dans les réponses inflammatoires locales contre un auto-antigène hépatique, en identifiant des voies de signalisations essentielles au contrôle de ces réponses sur le long terme. Les résultats de nos travaux devraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques plus spécifiques contre la pathologie.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs actes en fonction du protocole appliqué. Acte 1 : Les animaux recevront, des injections (durée de l’acte : 1 minute, animal anesthésié et analgésié localement). Cette injection sera réalisée dans tous les groupes une fois et un seul groupe recevra 3 injections supplémentaires une semaine après (1 jour d’intervalle/injection). Acte 2 : Les animaux recevront 5 injections (durée : 30 secondes, animal vigile), à 2 ou 3 jours d’intervalle. Acte 3 : Prélèvement sanguin (durée : 2 minutes, animal anesthésié et analgésié localement) une première fois durant le protocole et une dernière fois en fin de protocole.Acte 4 : Les animaux recevront, 1 injection / patte soit deux injections par souris (1 minute, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des gestes plus ou moins douloureux au cours des différentes procédures. Une procédure d’injection répétée cinq fois en deux semaines pourra entrainer un inconfort local et transitoire au moment de l’injection dû au passage de l’aiguille dans la peau qui s’estompera 5 min après la procédure. . La vaccination des souris sera réalisée au niveau des deux pattes arrière qui entrainera un étirement local du muscle. Cette gêne temporaire associée à un gonflement du muscle durera entre 12h et 24h. La gêne disparait généralement 24h post injection. Lors des prélèvements sanguins un inconfort durant ces gestes est estimé à 1min correspondant au temps nécessaire à la réalisation du prélèvement. L’animal pourra également ressentir pendant 30 secondes une gêne lors de la réalisation du geste de compression pour arrêter le saignement éventuel post prélèvement. Les prélèvements et injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse pouvant entrainer une phase de stress pour l’animal pendant environ 30 secondes avant la phase d’endormissement . De plus la phase de réveil avec le reprise de conscience sera également un facteur de stress qui durera environ 1min pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de récupérer différents tissus (sang, foie et rate) indispensables pour mener diverses analyses d’histologie, de biologie cellulaire, de biologie moléculaire, de biochimie et d’immunologie.
Remplacement
Dans ce projet, nous interrogeons les voies de régulations de l’auto-immunité dans le foie. Cet aspect ne peut être étudié chez le patient humain car le diagnostic de l’hépatite auto-immune est très tardif et les échantillons (biopsies) sont rares et de petites tailles. Par ailleurs, l’étude des mécanismes immunologiques dictant le développement de la pathologie n’est pas réalisable à l’échelle cellulaire et, à nos connaissances, il n’existe pas de système pertinent de remplacement. Ainsi, dans notre projet l’étude in vivo chez l’animal est indispensable car cela permet d’avoir accès à des échantillons de l’organe cible de la pathologie, le foie. Cela permet d’une part de mesurer les dommages hépatiques et d’autre part d’étudier l’environnement immunologique dans l’organe.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 1536 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Pour cela, le calcul des effectifs a été réalisée par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Durant le projet, une réduction du nombre d’animaux pourra être envisagée en fonction des résultats expérimentaux obtenus. Nous pourrons être amenés à manipuler moins d’animaux si l’effet de certains composés s’avère significatif au cours des premières expériences. A l’inverse, si l’effet d’un composé rejette l’hypothèse émise dès les premières expériences, le composé sera exclu des prochaines expérimentations afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans le but d’extraire le maximum de données de chaque animal, plusieurs tissues seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les utilisateurs passeront régulièrement du temps avec les animaux avant les procédures et en dehors des jours d’expérimentation pour limiter leur stress et les habituer à être manipulés. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toute manipulation, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un symptôme réversible sera signalé, l’animal recevra les soins nécessaires. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
L’étude chez l’animal étant indispensable dans notre projet, nous travaillerons avec la souris (Mus musculus) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. A nos connaissances, il n’existe pas de modèle pertinent pour étudier le développement de l’auto-immunité dans le foie utilisant une autre espèce animale. De plus, le modèle murin utilisé au cours de ce projet, et développé au sein du laboratoire, a déjà démontré sa pertinence pour étudier une réponse spécifique d’un antigène hépatique. Nous travaillerons avec des souris adultes de 8 à 12 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité au cours des expérimentations.
Etude de l’inflammation systémique en imagerie à particules magnétiques (MPI) dans un modèle de sépticémie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle méthode d’imagerie médicale permettant de repérer très tôt les signes d’inflammation généralisée causée par une septicémie. La septicémie est une réaction inflammatoire importante de tout l’organisme en réponse à une infection grave, pouvant entraîner des complications vitales si elle n’est pas détectée rapidement. Pour cela, nous utiliserons un agent de contraste expérimental constitué de petites particules capables de se fixer sur certaines structures présentes à la surface des vaisseaux sanguins lorsqu’une inflammation apparaît. Les premiers essais ont montré que cet agent permet d’obtenir des images plus sensibles que les techniques classiques. Il est bien toléré, se dégrade naturellement et cible spécifiquement les zones où les vaisseaux sont activés par l’inflammation. Ainsi, cette approche pourrait devenir un outil précieux pour détecter précocement la septicémie et en suivre l’évolution. Dans ce projet, nous prévoyons de tester cette méthode dans un modèle murin afin d’évaluer sa capacité à identifier rapidement une inflammation généralisée.
Bénéfices attendus
Nous développons dans notre laboratoire un nouvel agent de contraste expérimental qui pourrait améliorer la manière de détecter les inflammations dans le corps. Grâce à ses propriétés magnétiques, il permet d’obtenir des images très précises avec une technologie d’imagerie innovante basée sur la détection directe de particules magnétiques. Nous pensons que cette méthode permettra d’identifier très tôt et avec une grande précision l’inflammation provoquée par la septicémie. La septicémie est une infection grave qui entraîne une réaction inflammatoire généralisée pouvant endommager plusieurs organes si elle n’est pas traitée rapidement. Aujourd’hui, il est difficile pour les médecins d’évaluer rapidement le degré d’inflammation chez un patient sepsique, ce qui complique le choix du traitement et du moment où l’administrer. Cette nouvelle approche d’imagerie pourrait permettre de connaître rapidement l’état inflammatoire d’un patient, facilitant l’adaptation du traitement à chaque situation. À terme, elle pourrait améliorer la prise en charge des personnes atteintes de septicémie et augmenter leurs chances de guérison.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : (i) Induction du modèle inflammatoire par chirurgien (ii) Pesée lors des manipulations (iii) 2 Poses d’un cathéter sous anesthésie profonde (iv) 2 Imageries MPI avec injection de produit de contraste à 24h et 72h post chirurgie.
Impact sur les animaux
Le modèle de septicémie par ligature et ponction cæcale (CLP) peut induire plusieurs effets indésirables sur les animaux. Cette intervention chirurgicale provoque une péritonite polymicrobienne entraînant une réponse inflammatoire systémique importante, qui peut se traduire par de la douleur post-opératoire, de la prostration, une diminution de l’activité spontanée dans la cage, un arrêt ou une réduction de la prise alimentaire et hydrique, ainsi qu’une perte de poids. Dans certains cas, une hypothermie, une déshydratation ou une défaillance multiviscérale peuvent survenir, et le modèle présente un risque de mortalité qui doit être étroitement surveillé. Lors du protocole d’imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux. La pose du cathéter veineux pour l’administration de l’agent de contraste peut provoquer localement un hématome ou une gêne transitoire.
Devenir
Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures en raison de la sévérité du modèle de septicémie induite par CLP, incompatible avec le maintien en vie ou la réutilisation des animaux. La mise à mort est également nécessaire à la réalisation des analyses terminales (perfusion intracardiaque et prélèvements tissulaires) indispensables à la validation des données expérimentales.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés avec notre agent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de « fantômes ») et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d’estimer l’affinité de notre agent de contraste pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et sa détectabilité de notre agent de contraste en imagerie MPI lorsqu’il est dans un organisme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures qui avaient employé des protocoles d’imagerie similaires pour évaluer l’inflammation dans d’autres tissus à l’aide de microparticules magnétiques. Ces études ont montré que 5 animaux par groupe permettaient déjà de mettre en évidence une différence significative de signal. Afin de renforcer la robustesse statistique de nos résultats, nous avons retenu un effectif de 10 animaux par groupe.
Raffinement
Des mesures spécifiques seront mises en place tout au long du projet afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général, et des interventions adaptées seront réalisées si nécessaire afin de préserver leur bien-être. Lorsque l’état de santé d’un animal se détériore de manière incompatible avec la poursuite de l’étude, des mesures appropriées seront appliquées conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation. Le stade de développement des animaux est de 8 à 10 semaines soit un poids de 35-40g. Nous effectuons donc notre modèle sur des jeunes adultes.
Induction de la cholestase chez le modèle de rat de la myopathie myotubulaire, et son évolution dans le contexte des thérapies géniques visant à guérir la maladie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie génétique rare et très grave qui touche surtout les garçons. Elle provoque une forte faiblesse des muscles, y compris ceux qui servent à respirer, et entraîne souvent le décès avant l’âge d’un an. Elle est causée par une mutation du gène MTM1, indispensable au bon fonctionnement musculaire. Un essai clinique appelé ASPIRO teste une thérapie génique : un virus inoffensif est utilisé pour apporter une copie normale du gène dans les muscles. Quatre patients, qui présentaient déjà des signes de mauvais fonctionnement du foie, sont décédés d’une insuffisance cholestatique. Chez ces patients, la bile ne parvient plus à s’écouler vers l’intestin et s’accumule dans le foie, endommageant l’organe jusqu’à sa défaillance. Chez le rat, modèle de la maladie, la faiblesse musculaire et respiratoire est très proche de celle des patients. En revanche, les rats ne développent pas de cholestase, probablement grâce à la composition moins toxique de leur bile. Mais ils présentent déjà certains signes de mauvais fonctionnement du foie liés au manque de myotubularine. Notre projet consiste à modifier l’alimentation des rats pour changer la composition de leur bile et la rendre plus proche de celle des humains. Cela devrait provoquer une cholestase et donc mieux reproduire les atteintes observées chez les patients. Nous pourrons alors tester si, dans ces conditions, la thérapie génique aggrave les troubles du foie comme chez les enfants. Ce modèle permettrait d’anticiper les risques et de rendre les futurs essais cliniques plus sûrs.
Bénéfices attendus
Des troubles hépatiques avaient été détectés pour un percentage des patients sélectionnés pour participer à l’essai clinique visant à guérir la myopathie myotubulaire par thérapie génique. Ces conditions n’impliquaient pas une raison d’exclusion de l’essai clinique, et beaucoup des patients ont vu leur état amélioré après le traitement. Néanmoins, certains sont décédés à cause des complications hépatiques. Avec ce travail, nous cherchons à créer chez le modèle de myopathie myotubulaire une condition hépatique, appelé cholestase, qui nous permettra à approcher les caractéristiques du modèle à celles des patients. De cette façon, de nouvelles thérapies pourraient être testés dans des conditions similaires à la réalité des patients de myopathie myotubulaire avec complications hépatiques, ce qui nous aiderait à réduire les effets indésirables.
Procédures
Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rat, entre 1 et 4 fois en fonction de la durée de l’étude. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 1 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 1 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que les animaux utilisés dans cette étude peuvent rencontrer sont liées à trois circonstances : - Le phénotype délétère lié au manque d’expression de la protéine myotubularine. Les mâles Mtm1-KO développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leurs déplacements et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Cette condition amène les rats vers une condition sévère. - Les prélèvements du sang seront réalisés par la veine caudale ou par voie intra orbital (ce qui provoque une douleur légère), à une fréquence de 1 à 4 reprises, entre 3 semaines et l’euthanasie. - Les traitements seront appliqués par injection (ce qui provoque une douleur légère), et ils risquent d’exacerber les problèmes hépatiques (interruption du flux biliaire vers le système digestif) chez les rats qui seront nourris avec un régime visant à changer la composition de la bile provoquant ainsi des douleurs modérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer les effets des régimes alimentaires seuls ou en combinaison avec la thérapie génique.
Remplacement
Le modèle de rat utilisé dans ce projet reproduit la myopathie myotubulaire avec fidélité, et grâce aux régimes alimentaires particuliers, nous visons à reproduire aussi les troubles hépatiques qu’on retrouve chez certains patients. Ces troubles, impliquant plusieurs organes du corps, ne peuvent pas être étudiés avec des cellules et nécessitent l’utilisation d’un animal. L’évaluation de l’état du foie dans le contexte de cette maladie et l’impact que la thérapie génique peut avoir sur lui n’est pas réalisable avec les modèles en laboratoire, car nous avons besoin d’étudier le métabolisme de la bile et le structure et l‘organisation des tissus hépatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de références bibliographiques permettant de déduire le nombre minimal d’animaux pour observer les effets des régimes alimentaires sur le foie des animaux sains et des animaux malades. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’impact de deux régimes différents sur l’état de santé du foie par rapport à un régime contrôle. Si cet effet est avéré, nous allons les tester dans le contexte des thérapies géniques, afin d’observer si nous observons les mêmes effets que chez les patients. Si un des deux régimes testés ne nous permets pas de nous rapprocher du phénotype du foie des patients, il ne sera pas testé dans le contexte de la thérapie génique.
Raffinement
Afin de garantir qu’ils puissent se nourrir correctement, la nourriture (pro-cholestase ou pas) sera placée au sol de la cage pour garantir son accessibilité, pour que les animaux malades (qui ont des problèmes musculaires qui les empêchent de se relever ou de bien ronger) puissent le manger facilement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites et un l’arbre décisionnel ont été établis, décrivant les actions adaptées à réaliser en fonction de l’état des animaux. En cas d’appréciation de manque des interactions grégaires ou d’apathie, des conditions d'hébergement particulières seront appliquées garantissant ainsi leur survie et leur bien-être (inclusion de cylindres en carton). Les animaux seront traités avec de la crème soulageant et des pansements en cas de démangeaisons. Des soins particuliers seront administrés en cas de besoin des animaux : désinfection locale de la peau, des soins dentaires et des soins oculaires.
Choix des espèces
Le rat a été choisi comme animal modèle pour les raisons suivants: 1) Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et il reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine. 2) Les rats Mtm1-KO montrent une atteinte au niveau du foie. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les animaux utilisés seront tous des mâles, pour se rapprocher de la clinique, car seulement les garçons sont touchés par la maladie. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du cancer de foie pédiatrique grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) et notamment le cancer pédiatrique (hépatoblastome) sont des pathologies complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance aux traitements. A ce jour le seul traitement pour l’hépatoblastome est la chimiothérapie avec une efficacité limitée et des effets secondaires et une toxicité non-négligeable. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du cancer du foie pédiatrique. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en cancer du foie, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en exprimant dans les cellules du foie les différents gènes d’intérêt. Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs pédiatriques dans un foie sain et d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques pédiatriques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population pédiatrique atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire la mortalité et morbidité de ce cancer. Nous prévoyons de faire un maximum de 2 études de nouveaux candidats par an, soit 10 nouveaux candidats médicaments sur 5 ans.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides (qui véhiculent nos gènes d’intérêt) dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées en état vigile, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine) pour une durée approximative d’entre 15 et 30 jours. Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique d’injection est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. Les nuisances attendues sont : 1) Nuisance globale de l'expérience d'injection qui n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Au-delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial du développement de la tumeur, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux ; 2) l’administration d’agents médicamenteux pourrait entraîner une douleur légère pendant quelques secondes au moment de l’injection. ; 3) Formation et évolution des tumeurs pourrait entrainer des malaises pour la souris, d’où l’importance d’un suivi quotidien avec une grille de score qui tient compte des différents signes de souffrance pour y remédier; 4) Injection du réactif pour imagerie, peut induire une doleur légère temporaire au cours de l’administration ; 5) Anesthésie volatile pour les techniques d'imagerie. Un petit groupe de souris sera concerné para les nuisances liées à la biopsie pour le génotypage : douleur temporelle de quelques secondes pendant le prélèvement sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Dans cette étude, quand possible nous utiliserons l’imagerie in vivo (échographe) similaires aux appareils utilisés chez les patients, mais adaptés à la taille de notre modèle rongeurs. Ces imageries nous permettent de suivre l’évolution des animaux, en particulier la croissance tumorale, sur plusieurs semaines et de réaliser plusieurs types de mesures, ce qui nous permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats utilisables. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé au maximum tout assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé qu'un effectif maximum de 10 animaux par groupe serait suffisant pour les expérimentations d’efficacité et 6 animaux par groupe pour les expériences de toxicité. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. De plus, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses post-mortem sur les tissus récupérés (foie, tumeurs, poumons, rate, sang, moelle osseuse). En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Nous envisageons de mutualiser des groupes contrôles pour les différents tests, lorsque ce sera possible. Par exemple : 1) le groupe "plasmide contrôle" dans le cas où le même vecteur est injecté, 2) dans le cas d'injection
Raffinement
L'état de santé des souris sera quotidiennement surveillé ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de garantir le bien-être chez l’animal. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie au cours du temps par imagerie non invasive. En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés. Tout signe et/ou comportement anormal sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent l’animal sera sorti du protocole. Les conditions d’hébergement classiques seront enrichies en alternance par afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade jeune (moins de 2 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus pédiatriques, pour récapituler le contexte de l’hépatoblastome.