Les projets approuvés

Entraînés au préalable à traverser un tunnel et à marcher sur une plateforme de mesure de force, 40 chats reçoivent onze administrations orales au maximum, puis une solution injectée dans un membre postérieur sous une heure d'anesthésie générale, qui provoque une inflammation et une boiterie d'environ cinq jours. Ils sont hébergés seuls de l'induction jusqu'à sept jours après, subissent une prise de sang par jour, et repassent dans le tunnel jusqu'à cinq fois par mesure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trente et un jours de repos, le protocole entier est recommencé sur les mêmes chats, tous gardés en vie à l'issue. Le porteur précise que le groupe recevant le comprimé placebo est le plus exposé à ce protocole, et que la justification du nombre de chats est demandée au donneur d'ordre, le projet servant à évaluer un candidat médicament vétérinaire félin à trois doses.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer puis de comparer l'efficacité d'un élément d'essai administré à trois doses différentes. L'objectif est de pouvoir démontrer les propriétées anti-inflammatoire et analgésique du produit testé sur un modèle inflammatoire chez le chat. Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (un comprimé placebo). Ce modèle permet de créer une boiterie en induisant réponse inflammatoire au niveau du membre induit. Grâce au modèle boiterie, les propriétées anti-inflammatoire et analgésique des produits testés pourront être évaluées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations orales pour le produit test (sous forme de comprimés), le contrôle négatif (sous forme de comprimé) et le contrôle positif (sous forme orale) . Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 11 administrations seront réalisées. Les administrations commenceront 4 jours avant l'induction de l'inflammation et se poursuivront 6 jours après. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution au niveau du membre sous anesthésie générale. La durée d'induction est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés en deux occasions: juste avant la première administration puis juste avant l'induction puis une fois par jour à jour 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 8 après l'induction. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux passeront de leur plein gré sans laisse ni harnais dans un tunnel pour verifier le temps mis à le traverser puis passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Un harnais et une laisse peuvent être utilisés si besoin pour le passage à la force plate. Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation. Ce protocole expérimental sera réalisé en deux occasions avec une période de repos de 31 jours entre chaque induction.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré , à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Le groupe contrôle négatif sont les animaux les plus exposés à ce modèle. Les effets indésirables liés au modèle lui même sont des gonflements au niveau du membres induit, de la chaleur, parfois rougeur.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

40 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 5 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis trois groupes auront l' élément test à trois doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée au donneur d'ordre. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Ces études ont mis en avant qu'il était necessaire d'avoir des groupes de 6 à 8 animaux. Vu la variabilité du modèle, il ne faut pas déséquilibre les groupes pour avoir des résultats exploitables. Ce projet sera fait en "Cross over" cela signifie que chaque animal recevra en 2 occasions ce protocole expérimental avec une période de repos minimale de 31 jours. Cela permet de réduire la variabilité inter individuelle, d'obtenir la même puissance statistique avec moins d'animaux.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux auront une phase d'entrainement pour le passage dans le tunnel et une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate . Les animaux sont préalablement entraînés à ces exercices à l'aide de renforcement positif. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'induction jusqu'à 7 jours après, temps correspondant à la disparition de la gêne ou boiterie occasionnée. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une douleur ou une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

Jusqu'à seize prélèvements sanguins d'environ un millilitre en sept jours, dont douze sur une seule journée : 150 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie à l'issue et réutilisables dans d'autres projets. Certains subissent aussi une ponction d'urine dans la vessie, éveillés et maintenus sur le dos par contention manuelle, deux fois par vingt-quatre heures au maximum. L'objet du projet est de mesurer le devenir de molécules dans l'organisme du chat pour mettre au point des médicaments destinés à la médecine féline. Le porteur retient cette espèce parce qu'elle est celle à laquelle le médicament est destiné, et précise que les chats utilisés sont de jeunes adultes stérilisés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs et véhicules chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées, sa voie d'administration et sa concentration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution dans l'organisme, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce pour laquelle le médicament est prévu). L'objectif est de pouvoir générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des éléments tests pour pouvoir ensuite générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire principalement destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations uniques ou répétées de molécules tests selon les études (1 administration à 5 administrations espacées d'au moins 1 semaine). Pour cela les animaux seront vigiles et auront une contention manuelle. Cette contention est facilitée par les entrainements réguliers des animaux à tenir ces positions (par exemple: assis sur la table, ouverture de la cavité buccale, tête légèrement orientée vers le haut, allongés sur le dos pour des prélèvements de cystocentèse). La durée d'une administration est inférieure à la minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles. Pour une période de 7 jours, le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum (volume environ égale à 1 mL par temps) et engendrera une période de récupération de 7 jours minimum, la durée du prélèvement est inférieure à la minute. Sur cette période de 7 jours, un total de 12 prélèvements sanguins maximum peuvent être réalisés sur 24h. Certains animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Dans ce cas, cela se fera soit par miction spontanée ne nécessitant pas de manipulation de l'animal. Les animaux sont pour cela mis en hébergement individuel comprenant des bacs à litière spécifique pour le recueil d'urine. La durée de la mise en individuel peut être de 24h, soit le prélèvement urinaire peut se faire par ponction d'urine dans la vessie sur un animal vigile avec une contention manuelle. La durée du prélèvement est de l'ordre de la minute, l'animal est alors allongé sur le dos. Un maximum de deux prélèvements d'urine dans la vessie sur 24h est accepté, espacées d'au moins 6h. Cela se fait sous échographie pour eviter tout risque de blessure.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Malgré un entraînement régulier, toute contention peut engendrer un stress ou un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entraîner un stress, un inconfort si c'est un prélèvement dans la vessie directement. Cela se pratiquera sous échographie pour éviter tout risque de blessure

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet et de chaque protocole en accord avec le vétérinaire responsable. Les animaux pourront être réutilisés dans le cadre d'autres projets.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. La possibilité de mettre en place ces techniques de remplacement seront évaluées avant la mise en place de chaque projet.

Réduction

150 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 2 ans. Cela représente en moyenne 75 animaux par an soit en moyenne 7 études par an comprenant une moyenne de 10 à 12 individus par protocole. Un délai minimum de 4 semaines sera respecté entre chaque étude. Si aucune approche statistique n'est réalisée par le Donneur d'Ordre, on calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus, un minimum de 3 animaux par produit est nécessaire pour une interprétation des résultats exploitables. Ce nombre peut être augmenté pour obtenir une meilleure fiabilité des résultats, palier à une grande variabilité inter-individuelle ou être homogène dans le sex-ratio des animaux.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 à 4 animaux par groupe, par sexe et par affinité dans le respect du plan d'hébergement et de la règlementation en vigueur. De l'enrichissement du milieu (exemple: griffoir, coussin,plateformes à différentes hauteurs, balles ou cordelettes) est présent dans chaque box. Un suivi quotidien est mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...). Une visite hebdomadaire par le vétérinaire désigné ou son suppléant est réalisée pour évaluer la stabilité et l'équilibre social de tous les groupes de chats.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires. Jeunes adultes stérilisés ayant atteint leur taille adulte et un système immunitaire et métabolique mature.

300 animaux sur 3 990 pourront être gardés en vie et renvoyés en hébergement hors étude après avis vétérinaire, les autres seront tués pour le prélèvement d'organes et de fluides. 3 300 rats et 690 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets de candidats-médicaments commandés par des donneurs d'ordre. Certains reçoivent un cathéter intraveineux implanté à demeure sous anesthésie, portent une veste à capteurs jusqu'à dix-neuf heures, passent jusqu'à sept heures trente dans une enceinte respiratoire ou jusqu'à six heures dans une enceinte à diurèse sans eau ni nourriture, et subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par séance. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet de mesurer ces effets sur un "organisme entier" et revendique la "nécessité" d'accéder à l'animal dans son entièreté.

Objectifs

Les études de pharmacologie de sécurité chez les rongeurs visent à évaluer les effets d'un candidat-médicament en développement sur les grandes fonctions physiologiques et sont des prérequis réglementaires précliniques permettant à un donneur d’ordre d'initier des études cliniques pour un candidat-médicament destiné à l'Homme. Selon le candidat-médicament, l’établissement utilisateur évalue la procédure à effectuer, sachant que plusieurs procédures peuvent être combinées au sein d’une même étude (par exemple : étude combinant l’évaluation des fonctions respiratoire et neurologiques). Chaque animal est traité par un placebo ou une dose de candidat-médicament selon la voie d'administration prévue chez l'Homme. Les effets du candidat-médicament sont évalués sur une fonction physiologique données (neurologique, respiratoire, gastro-intestinale, rénale ou cardiovasculaire) à l'aide de capteurs et de logiciels enregistrant, en continu, le signal physiologique (fonctions respiratoire et cardiovasculaire), de tests spécifiques (fonctions neurologiques) ou de prélèvements d'organes/fluides biologiques (fonctions gastro-intestinale et rénale) effectués à un ou plusieurs temps après traitement, et dont l'analyse génère des valeurs quantitatives caractérisant la fonction étudiée. Les valeurs des paramètres mesurés à chaque dose de candidat-médicament sont ensuite comparées à celles mesurées en placebo et permettent ainsi d'évaluer l'impact du candidat-médicament sur la fonction étudiée. Pendant la durée de la procédure, de la réception des animaux à leur sortie d'étude, leur état de santé est suivi quotidiennement a minima, leur poids est mesuré périodiquement et l'atteinte de points limites est étroitement surveillée, avec prise de décision vétérinaire rapide et appropriée en cas d'altération du bien-être animal. Des dispositions, compatibles avec l'atteinte des objectifs de l'étude, sont prises pour limiter tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile, par l'utilisation d'habituation à l'environnement expérimental et aux dispositifs d'enregistrement des fonctions physiologiques, de protocoles anesthésiques et analgésiques appropriés, ou par décision vétérinaire d'appliquer des soins, de diminuer les doses de candidat-médicament ou d'arrêter le traitement. En fin de procédure, selon les prérequis du protocole d'étude, les animaux peuvent être gardé en vie ou euthanasiés.

Bénéfices attendus

L'évaluation des effets fonctionnels d'un candidat-médicament en développement par un donneur d'ordre dans les études de pharmacologie de sécurité chez le rongeur est conduite selon des recommandations ("lignes directrices") internationales, et constitue une étape réglementaire avant la conduite d'essais cliniques avec ce candidat-médicament chez des volontaires sains ou des patients. Ces études visent à définir le profil des effets pharmaco-toxicologiques de candidats-médicaments sur certaines fonctions physiologiques (incluant les fonctions vitales) qui surviennent généralement dans les heures à jours suivant leur administration. L'identification des fonctions modifiées par le candidat-médicament - s'il est considéré par le donneur d'ordre comme pouvant progresser dans les phases cliniques - permettra la mise en place de procédures de suivi de ces mêmes fonctions ("monitoring") chez l'Homme (ex.: mesure de l'électrocardiogramme, de la tension artérielle ou de la fréquence respiratoire; examens neurologiques) et donc, de rendre les essais cliniques plus sûrs pour les volontaires ou les patients y participant. En relation avec les données collectées dans les études de toxicologie réglementaire, celles issues des études de pharmacologie de sécurité permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Au final, ce projet contribuera au développement de nouvelles solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques sûres pour les patients. Il est envisagé que, sur une durée de 3 ans, entre 25 et 35 candidats-médicaments pourront être évalués.

Procédures

Ces études consistent généralement en une administration unique du candidat-médicament, pendant une durée de quelques secondes pour des administrations par les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse rapide, ou de quelques minutes pour les administrations par la voie intraveineuse dites en "bolus lent". Certaines administrations par voie intraveineuse peuvent également durer plusieurs dizaines de minutes à quelques heures, et nécessitent l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale gazeuse profonde et avec un protocole analgésique péri-opératoire adapté, d'un cathéter laissé en place de manière permanente dans une veine périphérique. Ce cathéter est relié à un dispositif externe de perfusion adapté aux rongeurs, permettant de connecter la seringue délivrant le candidat-médicament, tout en laissant l'animal libre de ses mouvements. Ce dispositif de perfusion intraveineuse est implanté sous anesthésie générale profonde, à une seule occasion, pendant la période d'acclimatation. Les administrations de candidats-médicaments sont suivies d’évaluation de leurs effets sur les paramètres neurologiques (évalués individuellement pendant un maximum de 15 minutes, à différentes heures après traitement), respiratoires (avec placement de chaque animal dans une enceinte dédiée jusqu'à 7,5 heures), urinaires (avec placement de chaque animal dans une enceinte à diurèse jusqu'à 6 heures). Les animaux dont la fonction cardiovasculaire est évaluée portent une veste avec capteurs intégrés jusqu'à 19 heures. Si requis par le protocole d'étude, un ou plusieurs prélèvements sanguins seront effectués, par ponction d'une veine superficielle chez l'animal vigile, suivant des modalités et un nombre définis par les besoins de l'étude (jusqu'à 2 occasions par étude, avec un maximum de 8 prélèvements par occasion), tout en respectant les recommandations éthiques de l'établissement utilisateur. Si le protocole d'étude requiert un prélèvement sanguin unique d'un volume dépassant ces recommandations, ce prélèvement est effectué chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié. Si requis par le protocole d'étude, une ponction de liquide céphalo rachidien unique est effectuée chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent inclure (variables selon les individus) : Stress, inconfort ou douleur brève (quelques minutes) lors des administrations, prélèvements sanguins ou euthanasie au gaz carbonique. Les injections intraveineuses lentes peuvent nécessiter une contention en tube, après une période d'habituation. Sensation de chaleur et stress lors du placement en enceinte chauffante utilisée pour prélèvements de sang ou injections intraveineuses ne nécessitant pas de pose de cathéter à demeure. Anesthésie de quelques minutes - avec risque d’incoordination motrice au réveil - , pour prélèvements de sang ou autres fluides biologiques. Anesthésie suivie d’une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la pose de cathéters intraveineux à demeure. Port d’un harnais ou d’un bouton métallique permettant la perfusion prolongée par voie intraveineuse sans contention, pouvant provoquer gêne à l'ambulation et au toilettage, grattage et/ou frottements. Connexion à un dispositif de "joint tournant" lors des perfusions intraveineuses de 30 min à 24 heures/jour, pouvant limiter les déplacements dans la cage d'hébergement. Restriction d’espace et absence d’aliment (eau disponible) dans l'enceinte dédiée aux mesures respiratoires jusqu’à 7,5 heures. Restriction d’espace sans accès à l’eau ni à l’aliment dans les enceintes pour collectes urinaires (jusqu’à 6 heures) ou les arènes d’observations comportementales (jusqu’à 10 min). Stress lié à l’hébergement individuel, notamment chez les souris mâles et les animaux porteurs de dispositifs de perfusion intraveineuse implantés à demeure. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés des candidats-médicaments.

Devenir

Si le protocole d'étude prévoit des prélèvements de tissus et d'organes pour analyses métaboliques, de biologie moléculaire, d'évaluations histopathologiques ou de prélèvements terminaux de fluides biologiques, une fraction ou la totalité des animaux nécessaire à ces analyses sera euthanasiée. Si le protocole d'étude ne prévoit pas de prélèvements nécessitant l'euthanasie des animaux, ceux-ci pourront être gardé en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la nature et l'amplitude des effets pharmacologiques de candidats-médicaments sur un organisme entier. Dans les études de pharmacologie de sécurité visant essentiellement à évaluer les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques interdépendantes (en particulier, les fonctions vitales (neurologique, respiratoire et cardiovasculaire), il est nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices édictées dans des recommandations réglementaires internationales.

Réduction

Lorsque la pharmacocinétique et/ou le mécanisme d'action du candidat-médicament le permet, les mêmes animaux peuvent être utilisés dans une même étude, dans le but d'évaluer, soit simultanément, soit séquentiellement, plusieurs fonctions physiologiques. Dans le cadre d'application de procédures de manière séquentielles, l'inclusion des animaux dans la seconde procédure suivant la première sera effectuée après un temps d'élimination du candidat-médicament de l'organisme suite à l'administration au cours de la première procédure, et après un examen clinique confirmant la capacité des animaux inclus dans la première procédure, à être inclus dans la seconde. Si l'étude requiert des prélèvements sanguins sur animal vigile et que la méthode analytique le permet, des microprélèvements de quelques dizaines de microlitres seront effectués chez les animaux en exploration fonctionnelle, évitant ainsi l'utilisation d'animaux satellites. S'il n'est pas attendu de différences pharmacologiques ou pharmacocinétiques notable entre mâles et femelles, et sauf avis contraire du protocole d'étude, ou justification d'une indication thérapeutique limitée à un seul sexe chez l'Homme, les études de pharmacologie de sécurité sont effectuées chez des mâles.

Raffinement

Rats mâles et femelles et souris femelles sont hébergés en groupes sociaux (sauf incompatibilité comportementale ou avec la procédure expérimentale) en cage sur litière, avec enrichissement adapté, augmenté en cas d’hébergement individuel. Les techniques limitant stress et inconfort seront privilégiées; les actes pouvant les engendrer seront réduits en nombre et durée au minimum nécessaire et réalisés sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Les rongeurs sont observés au moins une fois par jour pour rapidement détecter des signes cliniques et limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas d'atteinte du bien-être, un vétérinaire prendra des mesures rapides et appropriées (soins, arrêt momentané ou définitif du traitement…). Le stress de la manipulation est réduit par la procédure de gestion de faible stress. Etudes d'évaluation de la respiration par pléthysmographie: une habituation à l'enceinte de mesure en Plexiglas transparent (permettant aux animaux de voir et d'entendre leurs congénères et leur environnement) est effectuée par placement des animaux pendant 1 à 2 heures avant traitement (et en période de prétraitement, si requis au protocole d'étude). Etudes d'évaluation cardiovasculaire par veste connectée: en prétraitement, un fragment du tissu de la veste est déposé dans la cage d'hébergement pendant au moins 24 heures, puis les rats sont équipés de la veste seule (sans capteurs) jusqu'à 5 heures. Administration IV lente > 5 minutes: l'habituation au tube de contention est faite au moins 2 fois avant le premier traitement. Administration par voie orale et prélèvement sanguin en veine jugulaire chez rongeurs âgés ou peu manipulés: l'habituation à la manipulation est mise en place avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Si compatibles avec les objectifs de l'étude, des microprélèvements sanguins seront effectués, limitant ainsi le stress et facilitant la récupération. Le design de chaque étude sera détaillé dans le protocole d’étude et une évaluation éthique sera réalisée avant le démarrage. Le pH et l'osmolarité seront mesurés (ou communiqués par le donneur d'ordre) avant toute première administration par voie parentérale. Enfin, les volumes d'administration et de prélèvement de sang ont été établis selon des recommandations internes, elles-mêmes basées sur des recommandations éthiques (Diehl et al. (2001); J. Appl. Toxicol.).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animale dans les études visant à étudier les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques est basé sur les recommandations réglementaires édictées dans des lignes directrices internationales, les informations concernant la distribution et l'élimination des candidats-médicaments dans l'organisme, leur mécanisme d'action après liaison à leur cible biologique, les données de la bibliographie scientifique, et les analogies des fonctions physiologiques entre l’animal et l'Homme. Selon les fonctions physiologiques susceptibles d'être modifiées par le candidat-médicament et de la population concernée par celui-ci, l’âge le plus adéquat sera sélectionné, cet âge pouvant varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge de maturité sexuelle. Ce choix de l'âge répond à l’ensemble des études réglementaires conduites chez l'animal et nécessaires à la conduite des essais cliniques avec un candidat-médicament chez l’Homme.

Pour tester un gel lubrifiant censé prévenir la transmission sexuelle du VIH, 25 macaques à longue queue femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à huit applications du gel, 25 anesthésies, 25 prélèvements sanguins, trois biopsies de tissus et trois colposcopies vaginales. Seize d'entre elles au maximum sont exposées au virus une fois par semaine pendant huit semaines, avec fièvre, diarrhées persistantes et perte de poids attendues en phase aiguë. Celles du test de tolérance sont réintégrées dans l'étude d'exposition, les animales infectées étant tuées pour mesurer la charge virale dans leurs tissus.

Objectifs

Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent un problème majeur de santé publique, avec plus de 1 million de nouveaux cas recensés chaque jour dans le monde, particulièrement chez les femmes. Malgré les efforts déployés à l’échelle mondiale, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un pathogène majeur à l’échelle mondiale. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant de réduire et de prévenir ces infections. Le préservatif reste aujourd’hui le moyen de protection le plus efficace contre ces infections. Toutefois, son usage reste insuffisant dans certaines populations, pour des raisons sociales, culturelles ou liées à l’impossibilité de négociation au sein du couple. Dans plusieurs régions à forte incidence, notamment en Afrique subsaharienne, les jeunes femmes représentent 80 % des nouveaux cas de VIH. Le développement de moyens de protection autonomes, en particulier pour les femmes, ne nécessitant pas de négociation préalable avec le partenaire, représente ainsi un enjeu important de santé publique. Dans ce contexte, le projet vise au développement et à l’évaluation préclinique de gels lubrifiants microbicides pour prévenir de l’infection au VIH, conçus pour reproduire les propriétés protectrices du mucus naturel au niveau des muqueuses génitales. Dans un premier temps, la compatibilité du gel avec les tissus muqueux et les paramètres biologiques généraux de l’organisme au gel seront évalués après administration dans le vagin . Dans un second temps, la protection du gel contre l’infection sera évaluée par l’analyse des paramètres virologiques et immunologiques. Le modèle retenu est le macaque cynomolgus femelle, référence pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH, en raison de la proximité de son système immunitaire avec celui de l’être humain, de la proximité anatomique et physiologique de son appareil reproducteur, de son cycle menstruel et de sa sensibilité à l’infection par un virus simien reproduisant les caractéristiques de l’infection HIV.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de nouvelles approches pour la confection de gel lubrifiant microbicide contre les infections sexuellement transmissibles (IST). Tout d’abord contre l’infection VIH chez la femme, et à long terme dans le développement d’un produit à plus large spectre contre les IST pour les femmes et les hommes.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : • Administration du gel lubrifiant candidat ou contrôle (jusqu’à 8 administrations, sur 25 animaux, 1x par semaine, 2min) • Anesthésie des animaux (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 30min) • Prélèvements sanguins (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 5 min) • Biopsie de tissus (maximum 3, sur 25 animaux, 30min). • Suivi de l’environnement vaginal (récolte de fluides vaginaux, jusqu’à 25x, sur 25 animaux 2min) • Infection de 16 animaux maximum, (jusqu’à 8 infections à une fréquence d’une exposition par semaine, 2min) • Colposcopie vaginale, (3x maximum sur 25 animaux, 10min)

Impact sur les animaux

Nuisance liée au traitement Suite au traitement, une réaction locale d’inflammation peut apparaitre : démangeaison, douleur de façon transitoire. Nuisances liées aux prélèvements sanguins et biopsies tissulaires -Une réaction locale après prélèvement sanguin -Une réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur peuvent apparaitre après une biopsie tissulaire de façon transitoire. Nuisance liée à l’anesthésie Les anesthésies répétées peuvent entrainer une baisse de l’alimentation et par conséquent une perte de poids. Nuisance liée à l’infection sexuellement transmissible Les animaux infectés peuvent développer de la fièvre, des diarrhées persistantes, une perte de poids et une baisse du niveau de lymphocytes T de façon transitoire en phase aigüe (durée : quelques semaines). Nuisances liées aux colposcopies La colposcopie n'est pas un examen douloureux mais des crampes peuvent être ressenties après l’examen.

Devenir

Les animaux issus du test de tolérance seront gardés en vie et ils pourront être inclus dans l’ étude de protection afin de réduire le nombre d’animaux utilisés après avis du vétérinaire. Les animaux exposés au virus seront euthanasiés pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus.

Remplacement

L es études de tolérance et de l’efficacité d’un produit prophylactique contre des virus aussi critiques que VIH, ne peuvent pas être testées directement chez l’ être humain mais doivent montrer une efficacité dans des conditions proches de ce qui ce qui passe chez l’être humain. L’étude de tolérance et d’efficacité d’un produit au niveau vaginal implique un modèle proche de l’humain au niveau anatomique, du système immunitaire et de sa capacité à être infecté par le VIH. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’évaluer simultanément : • La tolérance locale sur une muqueuse génitale fonctionnelle ; • La protection induite dans un modèle d’exposition répétée au virus reproduisant les conditions de la transmission sexuelle.

Réduction

La taille des groupes a été réduite au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés pour pouvoir conclure de la tolérance et de l’efficacité de traitements prophylactiques candidats tout en prenant en compte une certaine variabilité individuelle.

Raffinement

Hébergement Les animaux seront hébergés en groupes avant le début des expérimentations et pendant le test de tolérance. Pendant la phase d’infection, les animaux seront en hébergements individuels proches afin d’éviter la surexposition virale tout en permettant des interactions sociales entre eux. L’enrichissement sera renforcé pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou de sachet surprise au lieu d’1). En plus, du raffinement (nourriture plus variée, compléments alimentaires) sera mis en place quotidiennement. Anesthésie Les interventions (administrations, prélèvements de tissus, colposcopies) et les prélèvements de fluides seront regroupés autant que possible et réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter le stress et d’éventuelles douleurs. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une baisse de l’alimentation, une diversification et complémentation de celle-ci pourront être instaurées. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Prélèvements sanguins et tissulaires En cas de signes cliniques liés aux biopsies tissulaires => signalement au vétérinaire, afin de mettre en place un traitement symptomatique en local. Traitement intravaginal Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques (rougeurs, démangeaisons) afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Infection lors du test d’efficacité Les animaux seront observés quotidiennement. Les expositions virales seront interrompues dès confirmation de l’infection. En cas de modifications majeures des paramètres biologiques après analyses des prélèvement sanguins (, associées à l’apparition de signes cliniques, un avis vétérinaire sera demandé. Examens colposcopiques Des colposcopies permettront de déterminer l’intégrité de la muqueuse vaginale et des signes d’inflammation avant et après traitements. Les colposcopies seront effectuées sous anesthésie pour éviter le stress, aucune douleur n’est attendue lors de cet examen.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus femelle de plus de 3 ans a été choisi en raison de la pertinence scientifique de ce modèle pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH retrouvé chez la femme. L’environnement vaginal et le système immunitaire varie au cours de développement et de l’âge de l’animal et ont donc un impact sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les effets d’un traitement prophylactique. Ces études seront donc réalisées chez des macaques cynomolgus femelles de plus de 3 ans possédant un système immunitaire « mature ». Le macaque Cynomolgus partage à la fois une grande similarité avec l’être humain au niveau anatomique et morphologique du système reproducteur féminin, mais aussi au niveau de son système hormonal, et de son cycle menstruel. De plus le macaque cynomolgus possède un système et une réponse immunitaire proche de l’ être humain. Ce modèle est susceptible à l’infection par le virus simien, et développe une physiopathologie proche de celle observée chez l’humain atteint du VIH. Aucun autre modèle animal ne permet d’évaluer simultanément la tolérance au niveau de la muqueuse, l’impact hormonal et l’efficacité prophylactique dans un contexte d’exposition virale répétée.

Privés de nourriture et d'eau jusqu'à huit heures dans des chambres d'enregistrement respiratoire, parfois placés seize heures en cage à collecte d'urine et de fèces, 2 560 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ces études de pharmacologie de sécurité mesurent les effets de candidats médicaments sur la respiration et le système nerveux, étape que la réglementation impose avant toute première administration à un être humain. Le porteur justifie la mise à mort systématique par la volonté d'éviter qu'un même animal reçoive plusieurs composés, et décrit ces animaux comme "naïfs", sélectionnés sur des critères d'âge et de poids stricts pour rester comparables aux données historiques. Il annonce une observation fine du comportement lors des tests sur le système nerveux, sans nommer un seul des tests employés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’évaluer de potentiels effets liés aux médicaments sur les systèmes vitaux de l’organisme tels le système respiratoire et le système nerveux. Les effets potentiellement indésirables d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques sont évalués après administration unique ou répétée chez le rat ou la souris. Ces études de pharmacologie de sécurité entrent dans le cadre réglementaire du développement de médicament et sont exigées avant la première administration chez l’Homme. Le présent projet comprend 2 procédures de pharmacologie de sécurité chez le rongeur et couvre l’évaluation de la fonction respiratoire (procédure 1) et du système nerveux (procédure 2).

Bénéfices attendus

Le projet est réalisé dans un cadre réglementaire, conformément aux lignes directrices. Il s’agit d’un prérequis indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme conformément aux lignes directrices et aux recommandations ICH (éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH)). Les bénéfices escomptés sont la détermination de marge de sécurité dans les doses de médicaments lors de la première administration chez l’Homme. Le but est d’assurer la sécurité des futurs médicaments. Les doses à administrer aux volontaires sont déterminées grâce à ces études et permettent d’assurer l’absence d’effets secondaires sur les fonctions vitales telles que la fonction respiratoire et le système nerveux.

Procédures

Les animaux sont généralement traités par une voie d’administration identique à celle envisagée chez l’Homme (orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse…). Il s’agit, le plus souvent, d’une administration unique. Parfois, l’administration peut être répétée. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre au maximum 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée totale des études est de maximum 7 jours. Des prélèvements de sang, de fèces ou d’urine pourront être réalisés au cours du temps et analysés afin d’établir des bilans de santé et de déterminer les taux de médicaments chez les animaux. Ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique pourrait être réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. Une mise dans des cages permettant de récupérer les fèces et les urines est parfois nécessaire, au maximum pendant 16h. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage mais, dans ce cas, leur environnement est amélioré. Il ne s’agit pas d’isolement : les contacts visuels, auditifs, olfactifs entre animaux sont maintenus. Lors des tests sur la fonction respiratoire, les animaux sont hébergés dans les chambres permettant l’enregistrement des paramètres respiratoires. Ils n’ont pas accès à la nourriture ni à l’eau pendant une période de 8h maximum. Lors des tests sur le système nerveux, le comportement des animaux est finement observé, avec une manipulation et une contrainte très limitée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau de la respiration ou du comportement), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (ex : manipulation et contention des animaux, administration en dose unique ou répétée). Une perte de poids peut être observée par exemple. En particulier, la mesure des paramètres respiratoires se fait alors que les animaux n’ont pas accès à la nourriture ni à l’eau. La durée maximum des enregistrements est de 8h.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de la pharmacologie de sécurité sont des animaux naïfs n’ayant reçu aucun traitement au préalable. Ces animaux sont généralement acceptés dans ces études en fonction de critères d’âges et de poids très strictes, facilitant une comparaison avec les données historiques obtenus conformément à ces critères. Enfin, pour éviter toute interaction entre plusieurs composés évalués sur un même animal, tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets indésirables de futurs médicaments sur les fonctions vitales de l’organisme, notamment la fonction respiratoire et le système nerveux. Cette évaluation doit être réalisée sur un organisme entier car les études in vitro ne sont pas une alternative. Seule l’observation sur un organisme entier permet de tenir compte de la complexité des interactions entre les différentes fonctions de l’organisme (ex : système respiratoire et système nerveux).

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe correspond toujours au minimum requis pour permettre une analyse statistique fiable, conformément à la règlementation en vigueur. D’autre part, en fonction du composé testé et de son indication thérapeutique, seul le sexe ciblé ou potentiellement sensible au composé testé est utilisé. En revanche, le plus souvent, le recours aux deux sexes s’avère nécessaire pour une évaluation d’un effet sexe sur les paramètres considérés. Ces caractéristiques sont spécifiques au produit et auront été déterminées au préalable grâce à des études préliminaires.

Raffinement

Les doses utilisées sont généralement similaires à celles envisagées chez l'Homme. En conséquence, des effets toxiques ne sont pas généralement pas attendus à ces doses physiologiques. Une habituation préalable à l’utilisation du pléthysmographe (et du cylindre de contention en cas d’administration intraveineuse) est mise en place avant le traitement. Des enrichissements sont proposés pour les animaux groupés et des enrichissements supplémentaires avec maintien du contact visuel auditif et olfactif sont proposés aux animaux hébergés individuellement, ainsi que la mise à disposition de matériaux de nidification.

Choix des espèces

Les espèces rat et souris sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées lors du développement de nouveaux médicaments. Ce sont des modèles acceptés par les autorités assurant la protection de la santé publique en évaluant les bénéfices et les risques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration et parfois sur la base des données historiques sur de médicaments similaires. De façon standard, les rats et les souris seront âgés de 6 à 10 semaines et 6 à 8 semaines, respectivement, correspondant à un développement « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations (capacité fonctionnelle des organes, volume circulant, etc.).

Pour vérifier qu'un candidat médicament ne perturbe pas la respiration avant son administration à des personnes, 1 200 rats, 400 souris et 200 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe six heures, jusqu'à dix, enfermé dans une chambre de plexiglas de dix-neuf centimètres de diamètre, et certains subissent d'abord une chirurgie de quinze à trente minutes pour l'implantation d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis restent isolés jusqu'à soixante-douze heures pour que leurs congénères n'abîment pas le dispositif. Les administrations peuvent se répéter deux fois par jour pendant un mois. 270 animaux pourront être réutilisés dans d'autres projets, notamment de formation, si la souffrance réelle est restée légère ou modérée, les autres seront tués pour des prélèvements terminaux ou après des effets marqués du produit testé.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidat-médicaments sur les paramètres respiratoires en utilisant la pléthysmographie de corps entier chez le rongeur vigile. Cette technique permet d'évaluer la fonction respiratoire des animaux sans les contraindre (pas d'anesthésie ni contention pendant la réalisation des mesures). Dans la majorité des cas, ce test sera utilisé dans le cadre de la pharmacologie de sécurité pour vérifier que les candidats-médicaments n'ont pas d'impact sur la fonction respiratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Si le candidat médicament doit être administré par voie intraveineuse, les animaux subiront au préalable une chirugie sous anesthésie générale afin d'implanter un cathéter dans la veine jugulaire (durée 15-30min). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Et ces animaux seront ensuite hebergés seuls après la chirurgie afin que leur congénère ne puisse pas altérer le cathéter (maximum 72h). Dans tous les cas, les animaux de ce projet devront séjourner plusieurs heures (généralement 6h, maximum 10h) dans un pléthysmographe (c'est à dire une chambre en plexiglass transparent, de 19cm de diamètre pour 11cm de hauteur) afin de mesurer leurs paramètres respiratoires. Le candidat médicament et le placebo seront administrés aux animaux par différentes voies. Dans la grande majorité des cas, le candidat médicament sera administré une seule fois. S'il doit être administré plusieurs fois, l'administration aura lieu au maximum 2 fois par jour pendant 1 mois. Cette administration nécessitera une contention légère d'environ 1 minutes (non-nécessaire en cas d'administration iv via le cathéter). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min, maximum 2 prélèvements par 24h, sur 5 jours d'affilée maximum).

Impact sur les animaux

Certains animaux pourront subir une chirurgie d'implantation de cathéter veineux qui peut induire des douleurs, qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie et un traitement analgésique. Le séjour dans un espace restraint pendant plusieurs heures peut engendrer un stress léger, qui sera réduit par une habituation préalable aux conditions expérimentales. Par ailleurs, les contentions des animaux vigiles pour administrer le candidat-médicament peuvent engendrer un stress mineur. Enfin, peuvent être envisagés en cours d'expérience des prélèvements de sang, qui induisent chez l'animal une douleur de l'ordre d'une piqure d'aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non-utilisés pour d’autres projets. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la respiration; ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact sur la fonction respiratoire, ce qu'il n’est pas possible de faire sur des cellules en culture ou organes isolés et qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces rongeur qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (i.e. 8 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu principalement pas le recours à une procédure non-invasive sans contrainte de l'animal (pléthysmographie corps-entier). De plus, les animaux sont habitués préalablement aux conditions expérimentales. En cas de chirurgie (nécessaire pour une administration intraveineuse), le raffinement sera mis en place par un protocole anesthésique et analgésique adapté. Des points limites adpatés sont définis et le recours à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans le modèle animal de pléthysmographie sur corps entier. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Jusqu'à 23 injections et des prélèvements de sang atteignant 80 millilitres par animal : 150 chevaux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le protocole immunise les animaux pour produire du plasma riche en anticorps, revendu comme traitement par une société de bio-défense, l'adjuvant employé pouvant provoquer nodules, abcès et granulomes douloureux au point d'injection. Le projet cherche justement un adjuvant moins réactif, tout en maintenant des taux d'anticorps élevés. Les chevaux ne sont pas tués : 100 sont réutilisés et 50 placés à l'adoption, selon les besoins de la structure.

Objectifs

La société impliquée est spécialisée dans les traitements contre des pathogènes (dont les maladies infectieuses émergentes et sévères) et les intoxications. Elle a déposé récemment une demande d’autorisation de mise sur le marché pour un produit dans le domaine de la bio-défense/menaces NRBC (Nucléaire Radiologique Biologique et Chimique). La société capitalise sur une plateforme technologique de développement et de production à base d’anticorps polyclonaux. Cette plateforme est issue de procédés développés à l’origine par une autre entreprise et licenciés à la société actuellement dépositaire du brevet. Elle s’appuie sur une technologie éprouvée, avec des produits enregistrés et administrés dans le monde entier depuis des décennies. Elle permet à partir d’un antigène d’immuniser des chevaux et de produire du plasma. Ce plasma est ensuite hautement purifié en anticorps. Le protocole d’immunisation comprend une série d’injections selon un calendrier qui optimise la production d’anticorps spécifiques de l’antigène, avec des titres les plus élevés possibles. Lorsque les titres maximaux sont obtenus (phase dite de « plateau »), le sang est prélevé dans des poches de grand volume contenant un anticoagulant, et il est ensuite traité pour obtenir du plasma. Les plasmas individuels sont poolés et utilisés pour purifier les immunoglobulines équines et obtenir les fragments qui constituent le produit thérapeutique final. Le projet vise à optimiser le protocole d’immunisation en identifiant un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant d’améliorer l’innocuité tout en maintenant l’efficacité (fort taux d’anticorps). Cette optimisation du protocole s’accompagne de la recherche de marqueurs biologiques pertinents permettant de quantifier voire prédire la réaction inflammatoire potentiellement induite par le protocole d’immunisation.

Bénéfices attendus

Les fragments d’anticorps hautement purifiés apportent une solution thérapeutique sûre à des problématiques majeures de santé publique pour lesquelles il n’existe pas d’autre solution. Il est crucial d’assurer la pérennité de la production et le raffinement des procédures permettant de les produire. Les antigènes correspondant aux cibles thérapeutiques doivent être administrés avec un adjuvant afin de stimuler la production d’anticorps spécifiques. L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection. Le projet vise à identifier un adjuvant et un schéma d’immunisation permettant de réduire ces réactions et d’améliorer le bien-être des animaux intervenant dans la production des traitements actuels et futurs. Le projet vise en parallèle à identifier un marqueur biologique prédicitf de la réaction inflammatoire induite par le protocole d’immunisation et utilisable en tant que point limite quantitatif dans toutes les procédures d’hyperimmunisation en cours et à venir.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront des injections selon plusieurs modalités (sous-cutanée ou intra-musculaire). Les injections ne nécessiteront pas d’anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées maximum 23 fois par animal. Chaque injection durera environ 30 secondes. Au cours du suivi 10 prises de sang maximum par individus seront réalisées sans nécessité d’anesthésie. Les volumes prélevés allant de 10 à 80 mL (2 prélèvements de 10 mL et 8 prélèvements de 80mL) la durée de l’intervention pourra donc varier d’une minute 30 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’adjuvant utilisé dans la technologie d’origine peut provoquer des réactions inflammatoires parfois douloureuses au site d'injection (nodules, abcès, granulomes) pouvant altérer l’état général. Tous les adjuvants et protocoles d’immunisation qui seront testés sont définis afin de réduire significativement ces effets. Les adjuvants à tester ont été choisis sur base de leur innocuité démontrée. Tout adjuvant ou protocole ne permettant pas d’améliorer significativement l’innocuité seront arrêtés.

Devenir

Le projet comporte une seule procédure de classe modérée. Les animaux maintenus en vie pourront être réutilisés dans le cadre de procédures légères ou replacés. La réutilisation ou l’adoption seront décidées en fonction des besoins en animaux de la structure en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) dont le vétérinaire référent de la structure d'accueil des chevaux fait partie.

Remplacement

L’immunothérapie passive utilisant des immunoglobulines polyclonales spécifiques et purifiées a largement démontré son efficacité dans le domaine des maladies infectieuses, intoxications et envenimations. Le cheval est l’animal producteur de référence dans le cadre de ces produits. La production en grand volume d’anticorps polyclonaux n’est possible que par des moyens in vivo (et plus particulièrement avec des animaux de grande taille : bovins ou chevaux). Aucune méthode alternative n’est aujourd’hui connue.

Réduction

Un maximum de 6 animaux sera utilisé pour chaque protocole d’immunisation à tester. Cet effectif est jugé suffisant pour établir une comparaison entre les réactions locales et générales induites par chaque adjuvant, l’évolution des paramètres biologiques ainsi que la quantité d’anticorps produits. Seule la première année exposera des animaux à l’adjuvant actuel connu pour créer des effets indésirables. Cette étape permettra d’avoir une référence et sa répétition non-nécessaire. Cet effectif permet également de limiter le volume de plasma à prélever sur chaque animal afin d’atteindre le volume minimal utilisable dans le procédé de purification Fab’entech.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe et observés bi-quotidiennement. Les animaux seront habitués dès le plus jeune âge au couloir de contention. Un enrichissement adapté est mis en place (hébergement en groupe, au pré dès que les conditions le permettent ou avec accès à une aire d’exercice). En cas de problème de santé, un vétérinaire diagnostique la maladie et prescrit un traitement. Le suivi santé des animaux se fait via des pesées régulières (a minima 1 fois toutes les deux semaines) et une grille d’observation et de suivi du bien-être animal est à disposition des équipes. Cette dernière leur permet d’identifier des signes d’inconfort, même en dehors des moments dédiés aux expérimentations (distribution d’alimentation par exemple). Les suivis et prélèvements sont réalisés par du personnel formé (habilitation à l’expérimentation animale de niveau 2) et connu des animaux. Ce projet met en œuvre des procédures maîtrisées qui ont déjà fait la preuve de leur efficacité pour la production d’immunoglobulines polyclonales équines.

Choix des espèces

Le cheval est un animal de grande taille permettant de récolter une importante quantité importante de plasma (en respectant un maximum de 1% du poids vif). Les pathologies équines présentent très peu de risques zoonotiques, ce qui limite fortement les problématiques de biosécurité virale dans les plasmas. Le cheval est l’espèce décrite dans la technologie d’origine. La production d’anticorps polyclonaux tels que nécessaires dans la thérapeutiques humaines finales ne peuvent pas être produits in vitro. Seuls des animaux de plus de 2 ans seront inclus dans l’étude afin de travailler sur des individus dont l’immunité est pleinement acquise.