Les projets approuvés

Le projet alimente les dossiers réglementaires de substances phytosanitaires, à raison d'environ cinquante études par an sur les produits retenus après criblage en laboratoire. 17 280 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent les substances par la bouche jusqu'à trois fois par jour pendant quatorze jours, par voie intraveineuse jusqu'à six fois en vingt-quatre heures, sur la peau, ou par inhalation pendant une heure vigiles et jusqu'à quatre heures sous anesthésie. Le porteur écrit qu'"aucune altération de l'état de santé des animaux n'est attendue", et justifie le recours aux souris par le fait que les tests sur cellules ne sont pas "pleinement reconnues" pour les produits phytosanitaires.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains produits utilisés pour protéger les plantes (comme les pesticides ou produits phytosanitaires) se comportent dans le corps d’un humain. Ce projet cherche à savoir comment ces substances peuvent entrer dans l’organisme de l’homme (par ingestion, contact avec la peau ou inhalation), combien de temps elles y restent, et comment elles sont transformées. L’objectif est d’estimer de manière réaliste l’exposition humaine, que ce soit par l’alimentation (via des résidus dans les aliments) ou dans un cadre professionnel (par exemple pour les personnes qui manipulent ces produits). Avant d’être étudiées chez la souris, les substances sont d’abord testées et sélectionnées en laboratoire (sans animal). Seules celles qui respectent les exigences réglementaires en matière de sécurité pour l’humain et l’environnement sont ensuite retenues. Le projet prévoit environ 50 études par an. Sur une durée de cinq ans, cela représentera environ 17 280 animaux, répartis entre trois types de procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

À court terme, ces études permettent de mesurer de façon réaliste la quantité de ces substances à laquelle les humains peuvent être exposés, que ce soit par l’alimentation ou par contact avec la peau ou l’air. Elles servent aussi à fixer des limites de sécurité, par exemple la quantité maximale de résidus autorisée dans les aliments, avec une large marge de sécurité pour protéger la santé. Ces travaux permettent également d’identifier les substances ou leurs dérivés qui pourraient être dangereux, notamment ceux qui s’accumulent dans le corps ou restent longtemps dans l’environnement. Cela aide à éviter d’autoriser des produits pouvant provoquer des maladies graves comme des cancers ou des troubles du système nerveux.

Procédures

Dans ce projet, les gestes réalisés sur les souris sont simples et de courte durée. Les animaux sont régulièrement pesés, ce qui prend seulement quelques secondes, afin de suivre leur état de santé. Les substances étudiées peuvent être administrées de différentes façons : • par la bouche (comme prendre un médicament), soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 3 fois par jour pendant 14 jours. La manipulation dure 30s. • par injection dans la circulation sanguine, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 2 min. • par application sur la peau, soit une seule fois ou de façon répétée avec un maximum de 6 fois par jour sur 24h ou au plus 3 fois par jour pendant 3 jours. La manipulation dure au maximum 30s • par application sous la peau, en une seule fois. La manipulation dure 30s • par inhalation sous forme d’air ou de fines gouttelettes en une seule fois. La manipulation peut durer entre une heure sur un animal vigile et quatre heures sur un animal anesthésié. La durée des études va de deux à trois semaines. Des prélèvements de sang nécessitent une manipulation courte sur un animal vigile d’environ 2 min. Le sang collecté permet d’analyser comment le produit s’absorbe, circule et se distribue dans l’organisme ou les organes. Ces prélèvements sont réalisés en petites quantités, avec des limites strictes pour prévenir toute anémie et privilégier un temps de récupération entre chaque prélèvement. Certains prélèvements sont réalisés sous anesthésie en fin d’étude. Les urines et les selles peuvent aussi être collectées ponctuellement sur 23h après administration dans des cages adaptées pour compléter les analyses.

Impact sur les animaux

Aucune altération de l’état de santé des animaux n’est attendue avec les procédures prévues. Toutefois, en raison du caractère exploratoire des études, des effets imprévus peuvent survenir (perte de poids, variations de la température corporelle, modifications du comportement). Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier à l’aide d’une grille de scoring. Des points limites humanitaires sont définis afin d’interrompre l’expérimentation et de mettre en œuvre une prise en charge adaptée, y compris l’euthanasie si nécessaire, afin d’éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir collecter les matrices biologiques ou organes pour évaluer la distribution dans un organisme vivant des substances actives phytosanitaires.

Remplacement

Des tests sur cellules permettent de faire un premier tri des substances, en étudiant leur absorption et leur transformation. Cependant, ces méthodes ne suffisent pas à comprendre entièrement leur comportement dans un organisme vivant et ne sont pas encore pleinement reconnues pour les produits phytosanitaires. À ce jour, l’étude chez l’animal reste nécessaire pour évaluer de manière globale leur devenir dans l’organisme et s’assurer de leur sécurité pour l’humain, les animaux et l’environnement, conformément à la réglementation européenne.

Réduction

Les substances sont d’abord largement testées en laboratoire (sur ordinateur et sur cellules) pour prévoir leur comportement dans l’organisme. Cela permet de ne garder que les plus pertinentes et de réduire fortement le nombre d’animaux utilisés. Grâce à des techniques d’analyse très sensibles, de très petites quantités de sang sont suffisantes. On peut ainsi effectuer plusieurs prélèvements sur un même animal et obtenir toutes les informations nécessaires, tout en limitant leur nombre. Le nombre d’animaux est donc réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables : en général au minimum 3 animaux pour les études de base et au maximum 8 pour certaines analyses spécifiques. Le nombre d’animaux utilisés sur cinq ans est estimé à 17280

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées, avec des éléments d’enrichissement pour leur confort et leur permettre de faire leur nid. Ils sont observés chaque jour pour vérifier leur état de santé. L’environnement et les animaux sont régulièrement contrôlés pour garantir de bonnes conditions sanitaires par des analyses ciblées et appropriées. Si un animal présente un problème, il reçoit des soins adaptés ou est euthanasié si nécessaire, selon des règles précises. Des mesures sont aussi prévues pour réagir rapidement en cas d’événement inattendu. Des critères d’arrêt anticipé sont définis ainsi pour éviter toute souffrance inutile. Tous les gestes pouvant être douloureux ou les situations très contraignantes pour l’animal sont réalisés sous anesthésie, et les manipulations sont limitées au strict nécessaire. Pour limiter les risques, en cas de dose potentiellement toxique, un seul animal est testé en premier. Si des effets indésirables apparaissent, les autres animaux ne sont pas exposés. Enfin, toutes les procédures sont réalisées par du personnel qualifié et formé, avec des formations régulières pour améliorer les pratiques et le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus souvent utilisé pour étudier le devenir et la sécurité des substances. Son fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’humain, ce qui permet de mieux prévoir les effets chez l’homme. Elle est recommandée par les autorités scientifiques pour ce type de projet (lignes directrices OCDE TG 417). Sa petite taille et les techniques de micro échantillonnage permettent de respecter les 3R tout en obtenant des données robustes. Sur le plan scientifique, la souris présente une physiologie et un métabolisme bien caractérisés, permettant une évaluation fiable des processus d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion. Il permet l’identification des métabolites majeurs circulants et l’établissement de relations robustes entre la dose administrée et l’exposition systémique. D’un point de vue technique et éthique, la souris est adaptée aux prélèvements sériés de très petits volumes et aux études de bilan de masse, tout en permettant l’optimisation des designs expérimentaux conformément au principe des 3R. Ce choix assure ainsi la production de données pharmacocinétiques fiables, interprétables et pleinement exploitables sur le plan réglementaire. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique de ces composés phytosanitaire sur des nouveaux nés.

Tués au jour 21 de la lactation pour prélever leurs organes, 544 rats vont être utilisés, des femelles accouplées et leur descendance, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Les femelles sont gavées chaque jour à la sonde du sixième jour de gestation jusqu'à trois semaines après la mise bas, soit 38 jours au plus, pour mesurer ce que trois substances connues pour induire des enzymes hépatiques font à leurs hormones thyroïdiennes et au développement nerveux de leur descendance. Les petits sont posés sur le dos dès le quatrième jour pour évaluer s'ils se retournent en moins de deux secondes, puis isolés quelques minutes et soumis à un clic mécanique à partir du dixième jour, chaque jour jusqu'à obtention d'une réponse. Le rat est retenu, indique le porteur, pour sa gestation courte, la disponibilité d'une souche caractérisée et les recommandations des instances réglementaires.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité d'un projet précédent, qui a permis de mieux caractériser les paramètres clés de la toxicité neurodéveloppementale associée à une perturbation des taux d’hormones thyroïdiennes. Ces travaux ont conduit à la publication de trois articles scientifiques. Ce nouveau projet s’attachera à caractériser plus précisément le mécanisme d’action reliant une diminution des concentrations en hormones thyroïdiennes, consécutive à une augmentation de leur métabolisation hépatique, à d’éventuels effets sur le neurodéveloppement. Ce projet visera ainsi à approfondir la compréhension des liens mécanistiques entre induction enzymatique hépatique, déséquilibre de l’homéostasie thyroïdienne et altérations neurodéveloppementales. À cette fin, il s’appuiera à la fois sur des substances décrites dans la littérature scientifique et sur des molécules internes, toutes identifiées comme inducteurs d’enzymes hépatiques impliquées dans la métabolisation des hormones thyroïdiennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques reliant l’induction du métabolisme hépatique des hormones thyroïdiennes à des effets sur le neurodéveloppement. Il contribue à mieux caractériser les conséquences d’une perturbation thyroïdienne secondaire à une action hépatique, en documentant à la fois les modifications hormonales et les marqueurs morphologiques et moléculaires observés chez la ratte et sa descendance. Les résultats attendus permettront également de comparer plusieurs substances partageant des mécanismes d’action proches, afin d’affiner leur caractérisation toxicologique et de mieux identifier les paramètres pertinents pour l’évaluation de leur potentiel de perturbation endocrinienne. À plus long terme, ce projet apportera des connaissances utiles à l’évaluation du risque pour la santé et à l’amélioration des stratégies de développement et de sélection de composés.

Procédures

Les femelles gestantes et allaitantes vigiles seront administrées journalièrement à l’aide d’une sonde souple adaptée à leur taille et âge, pendant maximum 38 jours (du jour 6 de gestation au jour 20 ou 21 après la mise bas). Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes et n’engendre pas de douleur. Durant la période de gestation, un prélèvement sanguin, pourra être réalisé sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Chaque femelle gestante pourra faire l’objet d’un micro-prélèvement à la veine saphène sur animaux vigiles pour un maximum de 200µL ou un prélèvement sanguin plus important, dans la limite des volumes recommandés, pourra être réalisé sous anesthésie à la veine sublinguale ou submentale. Ce prélèvement de sang sera réalisé sur une période d’une durée inférieure à 2 minutes. Au moment du sacrifice terminal (jour 21 de la lactation) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Pendant la lactation des tests de développement seront réalisés sur les rats juvéniles. Pour mesurer le réflexe auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Pour tester la mobilité, le petit sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes à partir de l’âge de 4 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. Des organes seront prélevés après la mise à mort des femelles et leur descendance au jour 21 de la lactation.

Impact sur les animaux

Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des rattes et de leur descendance ainsi que pendant la période d’hébergement isolé des femelles gestantes. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Un échantillon de sang peut être prélevé sur animaux vigiles par ponction à la veine saphène ou un prélèvement peut être fait après anesthésie par ponction à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Le prélèvement de sang peut induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. De plus, au moment du sacrifice terminal (PND21) un prélèvement à l’aorte abdominale sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sans réveil. Afin d’évaluer si le développement des rats juvéniles est normal, pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner en moins de 2 secondes. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les effets toxiques attendus devraient être modérés, car les trois substances étudiées sont des produits connus : les données disponibles dans la littérature et dans les études précédentes, notamment l’étude de toxicocinétique menée en amont de ce projet permet d’évaluer la tolérance aux doses prévues chez des femelles gestantes et allaitantes ainsi que chez leur descendance, indiquent que peu de signes cliniques sont attendus aux doses retenues. Les signes de toxicité pouvant apparaître en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de la salivation, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblements. D’autre part, des signes cliniques liés à la difficulté à mettre bas naturellement incluant un effort expulsif prolongé, agitation, écoulement vaginal inhabituel, respiration laborieuse, ou des signes cliniques liés à une difficulté à téter des petits à la naissance incluant déshydratation, pâleur, retard de croissance peuvent être observés.

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la gestation, la lactation et le développement de la descendance, tous les rats seront mis à mort au terme de la procédure pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Avant la réalisation de l’étude in vivo, des essais in vitro, notamment sur cultures d’hépatocytes et de thyréocytes en 3D, sont utilisés pour évaluer le potentiel toxique hépatique et thyroïdien des substances. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, en particulier les interactions entre organes et les conditions physiologiques propres à la gestation et à la lactation. Elles ne permettent donc pas, à elles seules, de prédire de manière complète les effets chez la femelle gestante et sa descendance. L’étude chez l’animal reste ainsi nécessaire pour mesurer de façon intégrée les effets sur la mère, les modifications hormonales, l’exposition de la descendance et les conséquences potentielles sur le neurodéveloppement. Les résultats obtenus seront comparés aux données in vitro et utilisés pour alimenter des modèles mathématiques, afin d’améliorer à terme la prédiction des effets sur les hormones thyroïdiennes et le neurodéveloppement, tout en renforçant progressivement le remplacement des études animales.

Réduction

Ce projet est conçu dans le respect du principe de Réduction, en veillant à utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec l’obtention de résultats scientifiquement robustes. Le nombre d’animaux retenu, fondé sur l’expérience du laboratoire, est limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude, notamment pour garantir une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des paramètres hormonaux. Ainsi, un effectif restreint de 8 femelles accouplées par groupe sera utilisé. Par ailleurs, plusieurs substances seront étudiées au sein d’une même étude, permettant le recours à un groupe témoin unique et contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux. En outre, seules des molécules préalablement sélectionnées au moyen de méthodes alternatives et considérées comme non dangereuses à ce stade seront évaluées in vivo, afin de restreindre le recours à l’animal au cours du processus de recherche et développement. Enfin, ce projet contribuera également au développement et à la validation d’approches alternatives susceptibles, à terme, de réduire plus largement le nombre d’animaux utilisés en toxicologie.

Raffinement

Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux rattes gestantes et allaitantes (matériel de nidification), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière le 1er jour de traitement (au moins 2 observations dans la journée) ainsi qu’au moment de la mise bas théorique à partir de GD 21. Ils sont pesés à intervalles réguliers pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptés aux femelles gestantes et allaitantes ainsi qu’aux rats juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort (sauf pour les rats juvéniles à PND 4), les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle d’autopsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Ce projet est réalisé avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal.

Choix des espèces

Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de sa courte durée de gestation, de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisies. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Des jeunes femelles rats accouplées, âgées de 8 à 12 semaines au début de l’étude, seront utilisées dans ce projet, conformément aux pratiques en toxicologie du développement et aux recommandations internationales. Leur descendance sera suivie jusqu’à l’âge de 21 jours après la naissance, ce stade de développement étant particulièrement adapté à l’évaluation des effets des substances administrées à la femelle gestante et allaitante sur le développement embryonnaire, fœtal et postnatal précoce, après exposition in utero puis au cours de la lactation via le lait maternel. En effet, la période allant de la naissance jusqu’à la fin de la lactation, est reconnue comme une fenêtre de sensibilité particulière aux expositions susceptibles d’affecter le neurodéveloppement.

Un abord chirurgical de trente minutes sous anesthésie gazeuse pour injecter un produit directement dans les ventricules du cerveau, puis six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures sur souris vigiles, chacune maintenue en contention deux minutes. 324 souris mâles jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le produit dit positif est choisi parce qu'il détruit les cellules de Purkinje du cervelet, et le porteur écrit pourtant que les produits de référence "ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués", les signes neuro-locomoteurs n'apparaissant selon lui que lors d'évaluations dédiées. Toutes les souris ayant reçu une injection sont tuées pour prélever leurs organes et chercher des marqueurs précoces de cette toxicité, seules celles écartées avant la chirurgie pouvant être transférées vers d'autres projets.

Objectifs

Les troubles neurologiques constituent la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Humain. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau par la voie intra-cérébroventriculaire dite ICV. Cependant, l’administration de certains ASOs par voie ICV chez la souris peut provoquer des effets indésirables structurels, notamment la perte de cellules de Purkinje (type de neurones du cervelet, crucial pour le contrôle moteur fin). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie ICV de produits de référence (provoquant une perte des cellules de Purkinje) chez la souris. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel cet effet indésirable a déjà été observé. Un suivi de deux semaines maximum post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que la perte de cellules de Purkinje et l’apparition de signes cliniques. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permettra de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme il permettra la détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) des produits de référence. L’exploitation des résultats de ce projet pourra ensuite être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments en développement (à moyen terme) pour renforcer leur profil de sécurité dans le cadre d’un autre projet. A plus long terme, le bénéfice sera de sécuriser l’utilisation de ces thérapies chez les patients

Procédures

• injection unique du produit de référence/véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • injection d’analgésique en pré, péri et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et avant l’euthanasie (moins de 10 sec) • prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de moins de 30 sec.

Impact sur les animaux

• injection unique du produit de référence ou du véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ), la phase d’induction de l’anesthésie gazeuse peut générer un stress léger et de courte durée. La phase de réveil post-opératoire peut générer une douleur modérée • Injection de l’analgésique pré et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et lors de l’euthanasie (moins de 10 sec) douleur légère et de courte durée à l’injection • A des prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, générant une douleur légère au moment de la ponction de moins de 30sec et stress lié à la contention nécessaire. - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : • Les produits de référence administrés pourraient induire une perte de cellules de Purkinje débutante (produit positif) mais ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués. Toutefois des signes neuro-locomoteurs légers peuvent déjà être observées précocement et uniquement lors d’évaluations comportementales et neuro-locomotrices dédiées pouvant provoquer un inconfort léger pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence ou d’un véhicule seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour examen de leur structure (analyse histologique) ou analyse de l’activité des gènes (transcriptomique) et des protéines produites dans ces tissus (protéomique)selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les souris pour lesquelles au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée et qui n’ont pas été opérées et n’ont donc pas reçu de produit de référence ou véhicule. Ce cas peut se produire dans de rares cas suite à une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre animal traité du même groupe par exemple. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable une injection d’analgésique avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres projets.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une perte de cellules de Purkinje. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de cette toxicité pouvant être observée avec les ASOs administrés dans le système nerveux. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (toxicité observée dans cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).

Réduction

Les produits de référence sont sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et des études vivo de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 9 par temps de prélèvement (3 temps envisagés au total par produit de référence/véhicule). Ce choix est dicté par la nécessité de garantir la robustesse des données face à plusieurs sources de variabilité. Par groupe, 5 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques, analyse de l’activité des gènes et de la synthèse des protéines et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats robustes pour les analyses complexes ex vivo envisagées et permet de compenser l’hétérogénéité liée à l’injection intra-cérébroventriculaire (diffusion du produit variant d’un sujet à l’autre) et les variabilités interindividuelles. Ainsi le nombre d’échantillons produit permettra d’assurer des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) qui prédisent une toxicité retardée, garantissant ainsi la robustesse de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez la souris et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (produit positif induisant des anomalies cérébrales, produite négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleures conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Le jour de la chirurgie, l’ensemble des animaux sera suivi grâce à une grille de scoring comportemental effectué 1h/3h et 24h (si applicable) post-opératoire. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base sur le score d’une grille éthique de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. L’utilisation des produits de référence dans ce projet ne devrait pas induire de signes cliniques modérés ni marqués sur la durée de l’étude. Cependant, des signes légers ont déjà pu être observés précocement avec ces produits de référence lors des évaluations hebdomadaires comportementales et neuro-locomotrices dédiées. Par mesure de précaution, la grille éthique dédiée à ce projet pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie ICV est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Les administrations ICV se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir, bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. - La perte des cellules de Purkinje, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs dans le système nerveux, a été observée dans cette espèce (et dans l’espèce Primate également) et doit être investiguée afin d’éviter que cet effet indésirable ne survienne chez l’humain en clinique. Les souris utilisées sont des jeunes adultes mâles et correspondent au sexe et à l’âge des animaux utilisés chez lesquels cette toxicité retardée a été observée avec les produits de référence.

Jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures, répétés deux fois, et une chirurgie de trente minutes pour injecter un produit dans le liquide céphalo-rachidien: 405 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 365 tués à l'issue et 40 réutilisables ailleurs s'ils n'ont reçu aucun produit. Les produits injectés sont choisis parce qu'ils provoquent une hydrocéphalie, une accumulation de liquide dans les ventricules cérébraux, que le porteur décrit comme survenant sans signes cliniques visibles chez le rat. L'objet du projet est de repérer des marqueurs précoces de cette toxicité, pour sécuriser plus tard l'évaluation de candidats médicaments dans un autre projet. Le rat est retenu parce que la voie intrathécale y est réalisable, contrairement à la souris, parce que l'hydrocéphalie s'y observe comme chez l'être humain, et parce que les études réglementaires ultérieures utiliseront la même espèce.

Objectifs

Les troubles neurologiques constituent désormais la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour garantir que le médicament atteigne les cellules cibles dans le cerveau il est nécessaire de l'administrer par voie intrathécale (IT au niveau des lombaires) directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Cependant, l’administration de certains ASOs par voie IT pendant le développement clinique chez l’Homme peut provoquer des effets indésirables structurels détectables par imagerie par résonance magnétique (IRM), notamment l’hydrocéphalie, caractérisée par une accumulation de LCR dans les ventricules cérébraux (et en conséquence une augmentation de leur taille). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie IT de produits de référence (provoquant une hydrocéphalie) chez le rat. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel la voie IT est réalisable (au contraire de la souris). Un suivi de deux semaines post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que l’hydrocéphalie. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permet de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. L’objectif de ce projet est d’identifier des marqueurs précoces de la toxicité retardée (hydrocéphalie) observée suite à l’administration au niveau des lombaires de thérapies d’ores et déjà connues en clinique ciblant les pathologies du système nerveux central. Ce projet permettra également de pouvoir corréler les résultats des analyses histologiques et protéiques aux modifications cérébrales pouvant être observées par IRM. La détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) de ces produits de référence permettra in fine de renforcer le profil de sécurité des candidats médicaments en développement dans des études ultérieures. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments, dans le cadre d’un autre projet afin de sécuriser à terme l’utilisation de ces thérapies chez les patients

Procédures

Chirurgie : - A l’administration unique de produits de référence par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique –durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire et lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang de faible volume : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum durant l’étude sur animal vigile, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de quelques secondes - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec) - A une administration terminale d’une dose létale d’euthanasiant sous sédation (durée 10 sec) - Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie (durée 10 min)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Les produits de référence administrés peuvent induire une hydrocéphalie sans apparition de signes cliniques (contrôle positif) et peuvent provoquer une nuisance légère pour l’animal. Conséquences directes des actes expérimentaux : • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR), ou préalable à l’euthanasie) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du produit de référence (d’une durée d’environ 30 minutes) et de la phase post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et une douleur liée à l’administration (moins de 10s) (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang : la contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) • Prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien sous anesthésie générale avant l’euthanasie (durée 30 sec, degré de sévérité sans réveil)

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour analyse histologique ou pour l’analyse de l’expression des gènes et des protéines selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée dans le cadre du projet et qui n’ont pas reçu de produit de référence /véhicule du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du même groupe par exemple.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une hydrocéphalie. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de l’hydrocéphalie pouvant être observée avec les ASOs administrés par voie intrathécale (IT). Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).

Réduction

Les produits de référence ont été sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et étudiés via des études vivo de sécurité en imagerie IRM de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 12 par temps de prélèvement (3 points envisagés au total par produit de référence ou véhicule).. Ce choix est dicté pour assurer la fiabilité des données face à diverses sources de variabilité. Par groupe, 8 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre d'animaux a été déterminé empiriquement, s'appuyant sur l'expérience interne des équipes pour la réalisation des analyses ex vivo complexes envisagées. Il est indispensable pour obtenir des résultats robustes et compenser l'hétérogénéité liée à l'injection intrathécale (diffusion du produit de référence variant d'un sujet à l'autre) ainsi que les variabilités interindividuelles. Ainsi, le nombre d'échantillons produit permettra de garantir des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) prédictifs d'une toxicité retardée, assurant ainsi la solidité de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez le rat et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement de LCR et d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (contrôle positif induisant des anomalies cérébrales, contrôle négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleurs conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. Bien que l’utilisation de produits de référence dans ce projet n’induisent pas de signes cliniques, l’utilisation de la grille éthique pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. De plus, un suivi post injection à 1h et 3h sera assuré dès le réveil de l’animal utilisant une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les administrations IT se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les études d’une durée supérieure à 1 semaine, une puce électronique d’identification couplée à un capteur de température pourra permettre le suivi de la température corporelle de manière non invasive. Tous les animaux sont hébergés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé chez le rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des produits de référence de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - L’hydrocéphalie, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs en intrathécale, est observée à la fois chez le rat et chez l’humain - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent le rat. De plus, les résultats obtenus pourront être corrélés aux études de sécurité réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Cent-dix études réglementaires en trois ans, exigées avant tout essai clinique ou toute mise sur le marché : 2 000 macaques à longue queue vont être utilisés, 1 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 432 en gravité légère. Ils reçoivent des produits par voie orale ou par injection, parfois placés jusqu'à deux heures sur une chaise de contention, isolés en cage individuelle jusqu'à 72 heures pour la collecte d'urine, équipés d'un gilet portant une pompe, d'électrodes, de cathéters permanents ou d'implants de télémétrie posés sous anesthésie. La plupart sont tués pour l'examen des organes exigé par la réglementation, 150 sont réutilisés dans d'autres études, six retournent en élevage et trois sont placés. Le porteur rappelle que la réglementation réserve les primates aux pathologies humaines invalidantes ou mortelles et aux cas sans autre espèce possible, tout en couvrant par ce seul projet médicaments et dispositifs médicaux de commanditaires variés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale ou des études préliminaires (recherche de doses, dose maximale tolérée, étude de pharmacocinétique, pharmacologie et pharmacodynamie) ou des études d’immunogénicité chez le primate non humain. Ces études consistent en l’administration unique ou répétée du produit à tester (médicament ou dispositif médical) suivie par des observations régulières des animaux, pesées corporelles, suivi de la consommation alimentaire, examen ophtalmologique, évaluation des effets sur la tolérance locale (si applicable), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires, évaluation des effets neurocomportementaux ou sur les fonctions respiratoires, cardiovasculaires et immunologiques, analyse macroscopique et/ou histopathologique, évaluation de la pharmacocinétique et pharmacodynamie du produit. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché (dispositif médical). Le nombre d’études pouvant être réalisées au total sur ce projet est de 110 sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains à court terme et sur les patients à moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché pour les dispositifs médicaux. Elles visent à définir le profil de toxicité ou de tolérabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sûrs pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Elles permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques (préventives) ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’Homme.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sur animal vigile, en accord avec les recommandations du comité d’éthique et de la structure du bien-être animal. Des récoltes d’urines et de fécès pourront être réalisées en plaçant les animaux dans des cages spécifiques. Les animaux recevront les produits à tester par différentes voies, orale ou injections, avec si nécessaire mise sur siège à contention pour des administrations intraveineuses lentes ou des voies orales sur animaux matures. Les animaux pourront être équipés d’un gilet contenant une pompe ou avec des capteurs pour enregistrer les paramètres ECG. Les animaux pourront être anesthésiés pour tout acte nécessitant une immobilisation de l’animal pour une durée limitée à quelques minutes, comme les examens ophtalmologiques ou les examens physiques détaillés. Pour des examens plus longs ou pour des prélèvements (tels que la moelle ossseuse, liquide céphalorachidien ou biopsies diverses) ou pour des chirurgies telles que les implantations de cathéter ou d’implant de télémétrie, l’anesthésie sera plus longue et plus profonde avec un protocole adapté. Le nombre d’anesthésies et de prélèvements sera réduit au maximum de ce qui est nécessaire pour diminuer au maximum l’inconfort des animaux. Les animaux pourront être isolés pendant 24h en post-opératoire des chirurgies de cathétérisme intrathécal pour éviter que les congénères touchent la plaie et qu'on ait des infections. - La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine) - La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes pour les voies orale et administrations, sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire. Les administrations par perfusion continue peuvent durer de plusieurs heures par jour ou être en continu. - Des prélèvements seront réalisés pour évaluer les effets sur les paramètres sanguins et urinaires ; généralement 2 à 4 fois par étude. L'évaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique et mesure des biomarqueurs dans le sang sont réalisés plusieurs fois par étude (généralement 2 à 6 occasions). - Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration et de prélèvement de sang. Dans le cas d’administration intraveineuse lente la procédure d’administration peut être plus longue (maximum 2h) avec placement de l’animal en chaise à contention. Pour des prélèvements sanguins, l’animal peut être isolé (maximum 1h) dans un compartiment individuel. - Hébergement dans une cage individuelle pour collecte d’urines pendant 72h maximum - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie avec éventuellement désorientation/perte d’équilibre ou hypothermie lors des examens physiques détaillés ou des examens ophtalmologiques ou tout autre acte nécessitant une sédation légère. - Anesthésie et douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques. - Stress, inconfort lié au port d’un gilet avec une pompe pour les animaux implantés avec un cathéter en permanence depuis la chirurgie jusqu’à la fin de période de traitement. - Stress, inconfort lors de la mise en place d’électrodes ou d’un brassard avec mise en siège à contention pour une évaluation des fonctions vitales telles que ECG ou pression artérielle, pour une durée maximale telle que décrite pour les administrations. - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise à jeun avec isolement dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16h pour recueil d’urines/feces. - Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) devant se faire pendant la période nocturne. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques ou effets locaux (sites d’administration) légers à modérés dus à l’administration des médicaments à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse de la consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…).

Devenir

En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et/ou microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas encore d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour évaluer la toxicité de substances dans leur globalité sur un corps entier avec une connectitivé de tous les organes et tissus. Pour le moment, les approches alternatives (NAMs) ne permettent pas elles seules de déterminer la toxicité de substances suite à une expoxition systémique. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes nécessitant d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables (notamment ICH) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produits testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits ; il est précisé dans le plan d’étude. Le plan d’étude est évalué par le comité d’éthique avant le démarrage de l’étude. Dans la mesure du possible, notamment pour les études préliminaires, il n’est pas nécessaire d’avoir un lot contrôle puisque l’on dispose de données prétest ou de données historiques relevantes pour les interprétations. Le développement d’études avec un Virtual Control Groupe (basé sur une banque de données des paramètres principaux de toxicologie obtenue à partir d’études avec le même design et sur le même modèle animal) permettra de limiter également l’utilisation d’animaux contrôles, y compris dans les études réglementaires. Dans les études de télémétrie, le design est en carré latin, l'animal est son propre contrôle et recoit chaque dose produit à tester tour à tour. Ce type de design permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Dès que cela est possible, les paramètres de pharmacologie de sécurité sont évalués dans les études de toxicologie ce qui évite la réalisation d'études de pharmacologie de sécurité standalone et réduit le nombre d’animaux utilisés. Lors que cela est possible, les animaux contrôles réverses peuvent retourner en stock au sein de l’établissement utilisateur, après accord vétérinaire. Lorsqu’aucun effet du genre de l’animal n’est attendu, un seul sexe pourra être utilisé dans l’étude.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans la mesure du possible et auront au moins 15 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant la première administration. Pour limiter le stress des animaux, des séances d'habituation au transfert en compartiment de procédure seront réalisées avec la distribution de récompenses. Les animaux bénéficient également de divers enrichissements tels que des jouets (en rotation sur la semaine), des bâtonnets de bois à ronger, des graines de tournesol/raisins secs, des tunnels en carton et de fruits et légumes en plus de l’alimentation classique. L’hébergement en volière sera privilégié (au moins pour les primates juvéniles) car il comporte des tubes en PVC, des perchoirs, des barrières visuelles et des balançoires. La musique sera présente dans l’ensemble des hébergements. Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Les animaux seront progressivement habitués aux administrations orales, au placement sur siège lors d'administration IV longue, ... Les techniques engendrant le moins de stress ou d’inconfort sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Pour les études préliminaires de recherche de doses, le choix de la dose ultérieure est raffiné et adapté en fonction des effets cliniques observés à la dose précédente, sous supervision éthique. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un protocole d’analgésie adapté (cf section anesthésie/analgésie de chaque procédure). Pour les candidats médicaments biologiques, un prétraitement pourra être réalisé avec des anti-histaminiques ou corticoïdes pour limiter le risque de réaction immunogène.

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain se justifie d’un point de vue réglementaire car c’est une des espèces non-rongeurs acceptée pour la réalisation d’études précliniques. Le choix du primate non humain est basé sur la réglementation qui réserve l’utilisation de primates non humains aux études précliniques sur des candidats médicaments destinés à traiter des pathologies humaines invalidantes ou mortelles et sous réserve qu’il existe des éléments scientifiques indiquant que la finalité de la procédure ne peut pas être atteinte en utilisant d’autres espèces. Ces données scientifiques peuvent être des données pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamie et/ou des analogies entre l'Homme et l'animal. L’âge des animaux sera déterminé en fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, cela peut varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge adulte, correspondant à la maturité sexuelle. Ce choix est fait en prenant en considération l’ensemble des études réglementaires précliniques qui pourraient être nécessaires pour les essais cliniques chez l’Homme et l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau médicament.