Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 17/04/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-586571)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans les testicules, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez le male médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins de spermatozoïdes et moins fécondant. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse de la capacité de reproduction du male a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les males mutants ont aussi une baisse la qualité et de la quantité spermatique, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les miARN, dont celui de l’étude, sont très bien conservés au cours de l’évolution, et il est généralement admis que leurs cibles le sont également. Pourtant, à ce jour, aucun modèle expérimental n’a permis de démontrer clairement une conservation évolutive des cibles de ces microARN, ni une conservation des phénotypes associés à la régulation d’un miARN sur un gène cible. Dans notre cas, le miARN travaillé, chez le médaka et le zebrafish, un impact similaire sur les phénotypes de reproduction, la mise en évidence d’une conservation évolutive des phénotypes et de leurs cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies d’étude des défauts de fertilité humaine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Ce projet concerne la création d’une lignée mutante. Pour valider une lignée mutante un génotypage par fin clip (section d’un fragment de nageoire caudale) sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Cette procédure est très rapide : moins de 2 minutes par animal, anesthésie et récupération incluses. Les animaux de première génération seront isolés jusqu’à 8 jours maximum, le temps de recevoir les résultats de séquençage du prestataire. Afin d’identifier les poissons, ceux-ci resteront dans des bacs individuels à paroi transparente, permettant un contact visuel avec leurs congénères. Les animaux mutants et sauvages de troisième génération subiront un prélèvement de sperme sur animal anesthésié.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car ce microARN est surtout exprimé dans les gonades. Le gène cible sera modifié pour empêcher la fixation du microARN et donc sa régulation. Nous anticipons principalement une diminution de la fertilité. Dans une lignée déjà présente au laboratoire où le microARN est désactivé, aucun phénotype délétère n’a été observé, nous ne nous attendons donc pas à des effets graves. Cependant, chez le médaka, un blocage des pontes peut survenir (arrêt de ponte par manque de stimulation mâle), caractérisé par l’absence d’œufs et un gonflement abdominal de la femelle, d’où un suivi spécifique des femelles zébrafish. Le génotypage est invasif (petit fragment de nageoire) mais réalisé sous anesthésie pour minimiser les nuisances, pouvant causer une réduction temporaire de l’activité locomotrice. La récolte de sperme est bien maîtrisée et n’entraîne pas d’inconfort notable. Les anesthésies pour prélèvements peuvent modifier temporairement le comportement alimentaire le jour même.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 75 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre un micro ARN et un gène sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour le microARN et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.
2. Réduction
In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur au moins 12 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en 2ème génération) et au moins 12 individus de génotype sauvage (non mutés) soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus fondateurs porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en 1ère génération lorsque les individus fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype sauvage. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la 1ère génération produira une 2ème génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de cette 2ème génération ). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse des testis d’au moins 24 animaux.
3. Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau,densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Le génotypage ainsi que la récolte de sperme se feront sous anesthésie. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l’interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d’œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d’édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Le testicule est accessible à l’analyse histologique et l’analyse de l’expression des gènes. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, les testicules permettant une étude au stade de maturité de développement de l’organe.