Evaluation de la gonadotoxicité des traitements de chimiothérapie administrés avant la puberté : impact sur le génome et l’épigénome spermatique et embryonnaire murin

Ce projet permet d’évaluer, chez un modèle murin, l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits. L’architecture de la chromatine ainsi que l’expression des transcrits dans les spermatozoïdes provenant de souris traitées par chimiothérapie sera évalué par une approche de sc-ATAC-seq et de sc-RNA-seq. Avant d’établir ce projet, une étude bibliographique a été réalisée au préalable. Aucune étude n’a évalué l’impact des agents de chimiothérapie sur (i) l’épigénome et la chromatine spermatique et (ii) le développement et l’épigénome de l’embryon précoce. Il apparait donc indispensable de rechercher la présence d’éventuelles épi-mutations dans le noyau des spermatozoïdes produits in vivo ou in vitro et d’évaluer les risques de transmission transgénérationnelle de ces altérations, qui pourraient être à l’origine de défauts du développement embryonnaire ou d’anomalies congénitales.

Il est nécessaire d’évaluer l’impact des traitements de chimiothérapie sur l’intégrité du tissu testiculaire, sur la capacité des spermatogonies à se différencier in vitro et sur la qualité des gamètes produits avant d’envisager une application chez les patients guéris de LAL mais devenus stériles. Les échantillons humains étant rares et précieux, nous utiliserons du tissu testiculaire murin pour attendre les objectifs du projet.

Injections de molécules de chimiothérapie (et sérum physiologique) en intra-péritonéales sur souricaux de 3,5 jpp. 1 injection d’1 seule dose par animal. Acte nécessitant 2 minutes maximum par souriceau. Procédure chirurgicale : vasectomie de souris mâles. 1 acte chirurgical par animal (avec vasectomie bilatérale ; permettant de générer des mâles castrés, utiles pour l’obtention de femelles pseudo-gestantes). Acte nécessitant une procédure de 10-15 minutes par souris. Procédure chirurgicale : réimplantation d’embryon chez des femelles pseudo-gestantes au niveau de l’infundibulum. 1 acte chirurgical par animal. Acte nécessitant une procédure de 20-25 minutes par souris.

Stress lié à l’injection de molécules de chimiothérapie, nuisances liées à l’acte chirurgical et stress lié à la mise à mort. La chirurgie peut entrainer des nuisances telles qu’une infection au niveau de la plaie, notamment suite à une déhiscence (séparation de bords de la plaie) ; des saignements ; une douleur, souvent au niveau de la cicatrice ou un état de fatigue. Lors de la croissance de l’animal, le principal critère sera la perte de poids par rapport à la moyenne du groupe témoin. Ce paramètre intègre non seulement l’éventuelle perte de poids de l’animal, mais aussi le différentiel de gain de poids, pathologique pour les souriceaux et très jeunes souris. Peu après les injections, des diarrhées (spécialement si le signe est prolongé plusieurs jours) seront également considérés comme des points limites. Pour des animaux plus âgés, la perte de poids par rapport au poids initial ou au poids le plus élevé de l’animal sera considérée comme anormale. Enfin, des points critiques classiques tels qu’un poil hérissé, un dos rond, un abdomen distendu, une léthargie ou tout signe clinique jugé par un technicien expérimenté comme indiquant un état moribond sévère seront considérés comme des points limites. Afin de pouvoir suivre le poids des animaux dans le temps, les souriceaux de 3,5 jpp seront marqués avec un stylo chirurgicale en attendant qu’il soit assez grand pour qu’une pose de puces au transpondeur soit possible pour poursuivre le suivie des souris à l’âge adulte.

Les animaux ne pouvant pas vivre après prélèvement chirurgical du tissu testiculaire sans traitement hormonal de substitution, ils seront euthanasiés en amont du prélèvement. Les femelles subissant un prélèvement de leurs ovocytes (post-stimulation ovarienne) seront euthanasiées en amont du prélèvement.

Actuellement, la spermatogenèse in vitro complète par culture organotypique en interphase gaz-liquide n’est réalisable que chez la souris. Nous réaliserons les injections des différents traitements à 3,5 jpp. Nous travaillerons à partir de tissu testiculaire pré pubère issu de souris mâles de 6,5 jpp de façon à pouvoir mettre en culture le tissu avant le début de la première vague de spermatogenèse. Les souris âgées de 6,5 et 36,5 jpp seront utilisées comme contrôles in vivo pour permettre la comparaison avec les tissus testiculaires en culture in vitro d’âges correspondants (tissus prélevés à 6,5 jpp + 30 jours de culture). Les femelles donneuses d’ovocytes seront utilisées à l’âge de 5 à 9 semaines (période à laquelle les souris répondent le mieux aux traitements hormonales de stimulation ovarienne). Les mâles donneurs de spermatozoïdes testiculaires seront utilisés comme témoin à l’âge de 36,5 jpp (âge correspondant aux tissus testiculaires après 30 jours de cultures). Les mâles donneurs de tissus testiculaires seront utilisés à l’âge de 6,5 jpp, de façon à ce que les tissus testiculaires pré pubères soient mis en culture avant le début de la première vague de spermatogenèse qui commence à 8 jpp. Les mâles vasectomisés seront utilisés dès leur puberté (environ 5 semaines). Les femelles Black Swiss pseudo-gestantes seront utilisées dès leur puberté (environ 7 semaines). Nous utiliserons des femelles Black-Swiss afin de s’assurer que l’embryon obtenu est bien le résultat de l’ICSI réalisée au préalable. L’ICSI sera réalisée à partir d’un ovocyte d’un spermatozoïde de souris CD-1 (blanche) afin d’obtenir un embryon qui sera par la suite implanté dans une souris Black Swiss (noire). Lors de la césarienne, si le souriceau obtenu est blanc, cela nous permettra de valider notre ICSI.