Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/02/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-037451)
Une biopsie de la queue est pratiquée sur chaque raton âgé de huit à dix jours, sous anesthésie locale, pour lire son génotype. 1 250 rats issus de ce programme de reproduction vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 250 étant gardés comme reproducteurs et les autres tués dès les résultats connus s’ils n’entrent dans aucun projet. Maintenir cette lignée porteuse de la mutation de la maladie de Stargardt, qu’aucun fournisseur ne propose, permet de la mettre à disposition d’équipes académiques et privées. Le porteur qualifie la biopsie d’indolore à cet âge, tout en décrivant des vocalisations possibles, un défaut de reptation, un isolement du reste de la portée et un retard à la tétée dans les jours qui suivent.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Stargardt (STGD1) est une maladie des yeux qui touche environ 1 personne sur 8 000 à 10 000, affectant surtout la macula, la partie de l’œil responsable de la vision de jour. La perte des cellules visuelles appelées cônes dans cette région peut mener à la cécité. Les photopigments, formés par la vitamine A et une protéine appelée opsine, rendent les photorécepteurs sensibles à la lumière. Cependant, le processus de détection de la lumière crée des sous-produits toxiques. La protéine ABCA4 aide à transporter ces toxines pour qu’elles soient éliminées. Des mutations dans le gène ABCA4 empêchent ce transport, causant l’accumulation de toxines et la mort des photorécepteurs et d’autres cellules oculaires. Actuellement, il n’existe pas de traitement pour cette maladie. Les modèles animaux actuels pour la STGD1 sont principalement des souris modifiées génétiquement, mais elles ne montrent que peu de symptômes de la maladie. Pour cette raison, nous avons décidé de créer un rat transgénique portant la mutation la plus fréquente dans la maladie de Stargardt. Utiliser des rats présente plusieurs avantages par rapport aux souris. Lors des injections dans l’œil des souris, il est difficile de contrôler la quantité de liquide injecté sans qu’il s’échappe vers d’autres parties de l’œil. Les rats ont des membranes oculaires plus robustes, ce qui permet un meilleur contrôle des injections et réduit le risque de fuite. De plus, lors de longues anesthésies, les souris peuvent développer une opacité du cristallin (semblable à une cataracte) qui complique les examens oculaires. Ce problème est beaucoup moins fréquent chez les rats. Le modèle de rat que nous avons créé reflète bien la maladie humaine sans affecter significativement le rat lui-même. Les changements observés chez ces rats sont similaires à ceux de la maladie STGD1 chez l’humain. Notre projet consiste à maintenir une colonie de rats STGD en utilisant des mâles et des femelles porteurs de la mutation (hétérozygotes, HE, ou homozygotes, KO). Les rats STGD et les rats sains issus de la même portée (appelés WT) seront utilisés pour de futures études de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique. Certains rats HE et KO seront également utilisés pour la reproduction.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif principal de ce projet est la caractérisation génétique, par une méthode invasive, d’animaux génétiquement modifiés représentant un modèle de la dégénérescence maculaire ou de la maladie de Stargardt (rats STGD) dont la physiopathologie est similaire à celle observée en humaine. Cette caractérisation permettra d’optimiser la gestion d’élevage de cette colonie. Ce projet assurera ainsi le maintien de cette lignée, qui n’est proposée par aucun fournisseur à ce jour, et mettra à la disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la STGD1. Ce modèle animal servira de support pour les futures études et projets scientifiques associées.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une biopsie de queue sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions. L’acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, afin de déterminer son génotypage, c’est à dire identifier si l’animal est atteint de la maladie de Stargardt (STGD) ou bien s’il s’agit d’un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Un génotypage sera effectué par biopsie de la queue chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, une procédure considérée comme modérée. Une anesthésie locale est prévue lors de l’intervention. Bien que peu fréquents, certains signes de douleur pourraient apparaître dans les heures ou jours suivants, tels qu’un défaut de reptation, des vocalisations, un isolement du reste de la portée ou un retard dans la reprise de la tétée après le retour au nid.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats KO et WT seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des rats (environ un à deux par portée) obtenus seront conservés en vue d’intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de modèles animaux constitue, à ce jour, l’unique approche pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine, une structure complexe formée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières, avant de passer à des études précliniques ou cliniques chez l’homme. Cette lignée de rats permettra, dans le cadre de futurs projets, d’évaluer l’effet d’un traitement à la fois dans un contexte malade (rats KO) et dans un contexte sain (rats WT), justifiant ainsi la nécessité du génotypage. Actuellement, le génotypage invasif reste une méthode simple, rapide, bien maîtrisée et capable de fournir des résultats fiables pour la caractérisation génétique des rats. Réalisée chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, cette technique est indolore. À l’inverse, le génotypage par prélèvement salivaire, bien que moins invasif, n’est pas recommandé en raison de la complexité de sa mise en œuvre (taille inadaptée des swabs par rapport à la petite bouche des ratons à cet âge) et de la faible fiabilité des résultats obtenus. Un génotypage basé sur la collecte de bulbes pileux est actuellement en cours de validation. Cette méthode, non invasive, sera adoptée au sein de notre centre une fois sa mise en œuvre finalisée, incluant la formation du personnel à cette technique et la mise au point du génotypage à partir de bulbes de poils dans notre laboratoire.
2. Réduction
La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l’expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat STGD. Dans ce projet, afin de générer au maximum 200 rats STGD KO et 50 rats WT par an, nous estimons qu’il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 50 couples par an, soit un total de 250 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 1250 rats STGD et WT. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard (Cf. schéma d’accouplement en Annexe). Les accouplements seront optimisés afin de maximiser le nombre de rats KO et d’éviter les portées de rats WT uniquement. Cette optimisation privilégiera les reproductions suivantes : KO x KOet HE x HE. Une reproduction KO x KO nous permettra d’obtenir 100% d’animaux KO, une reproduction HE x HE nous permettra d’obtenir théoriquement 50% d’animaux HE, 25% d’animaux KO et 25% d’animaux WT. Il est important de noter que cette lignée a déjà été cryopréservée. Elle est conservée tant que des projets sont en cours de planification, mais son maintien sera interrompu en l’absence de nouveaux projets.
3. Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d’hébergement selon la réglementation et un suivi régulier des animaux, assuré par les techniciens animaliers (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 2. Les biopsies de la queue destinées au génotypage seront effectuées par des techniciens compétents et spécialement formés à ces procédures rigoureuses. Cette méthode de génotypage, bien établie, rapide et standardisée dans notre centre, permet de minimiser le stress des animaux. Une analgésie sera assurée à l’aide d’un anesthésique local (comme le TRONOTHANE ou l’EMLA). La cicatrisation sera également surveillée dans les jours suivant l’intervention afin de garantir une bonne cicatrisation. En cas de besoin, une injection sous-cutanée de Buprénorphine peut être administrée à une raison de 0.05 mg/kg. 3. Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s’avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe de la saisine).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat est un bon modèle pour tester les traitements de thérapie génique des yeux. Son œil est assez grand pour permettre une distribution uniforme des fluides sous la rétine, avec moins de risque de fuite par rapport à la souris. De plus, lors de longues anesthésies, les rats ont moins de problèmes d’opacité du cristallin, qui peut compliquer les examens oculaires. Ce problème, qui ressemble à une cataracte, est courant chez les souris et est causé par le dessèchement de la cornée. La lignée de rats que nous avons développée imite bien la maladie de Stargardt chez l’humain sans nuire aux rats eux-mêmes. Les changements observés chez ces rats reflètent fidèlement ceux de la maladie humaine. Pour nos expériences, nous aurons besoin de jeunes rats adultes âgés de 2.5 mois pour la reproduction, ainsi que de rats adultes. Les rats modifiés génétiquement (KO) et les rats normaux (WT) seront généralement utilisés dans les expériences dès le sevrage. Selon les projets, les rats seront utilisés à différents âges, avec des justifications spécifiques pour chaque étude.