Impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né face à une infection respiratoire virale dans un modèle de primate non-humain.

L’objectif du projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité à la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, notamment face à des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe au cours des premières années par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, soit l’ensemble des micro-organismes peuplant nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via l’allaitement. Il interagit avec le système immunitaire via la production de métabolites et module les composés produits par les cellules immunitaires hôte. Le microbiote, indispensable au rôle de barrière des muqueuses et à l’apprentissage de l’immunité locale, régule la reconnaissance des pathogènes et assure le bon fonctionnement du tissu. La littérature montre qu’une dysbiose altère la capacité du système immunitaire à répondre à une infection. Or, le microbiote peut être fragilisé par l’utilisation d’antibiotiques, pratique fréquente en pédiatrie. Malgré sa reconstitution, les conséquences à court et long terme de cette perturbation passagère restent mal comprises. Notre hypothèse est qu’une telle altération chez le nouveau-né contribue à la sévérité de certaines maladies respiratoires de la petite enfance. La compréhension du rôle du microbiote est donc déterminante pour envisager des stratégies thérapeutiques adaptées. Ce projet vise le virus respiratoire syncytial (VRS), principal agent responsable des bronchiolites aiguës chez l’enfant, dont les symptômes peuvent être très sévères. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire à une infection virale chez le primate non-humain nouveau-né. Une procédure préliminaire sera menée chez des macaques juvéniles et adultes afin d’évaluer la quantité et la présence dans l’organisme des différents antibiotiques utilisés en pédiatrie. Une phase pilote sera ensuite réalisée chez des macaques juvéniles et adultes pour mettre au point le modèle d’infection par le VRS afin de limiter les études préliminaires chez les nouveau-nés. Puis nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie. Enfin, des stratégies thérapeutiques fondées sur la vaccination maternelle ou sur une intervention néonatale (vaccinale ou probiotique) seront évaluées.

Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais également de difficulté d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né. C’est au cours de cette période que se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intacte ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par un déséquilibre du microbiote (dysbiose) précoce. Enfin, l’exploration de stratégies préventives (vaccination maternelle ou administration néonatale de vaccin ou de probiotiques), permettra d’envisager l’ajustement de la prévention et le traitement des nouveau-nés. Au-delà des connaissances fondamentales attendues, ce projet vise également des applications pour la santé humaine. La collaboration avec les pédiatres a pour objectif de transposer ces résultats à l’amélioration des stratégies thérapeutiques lors des dysbioses précoces et à la prévention et la maitrise des infections respiratoires chez les enfants en clinique.

Adultes pour pharmacocinétique : – Anesthésie : 17/animal (entre 30 min et1h) – Traitement antibiotique : 1 administration/jour (10min) jusqu’à 7 jours max/animal. – Prélèvements sanguins : 23/animal (5 min). – Écouvillonnages mucosaux : 9/animal (5 min). – Urines : 10/animal (récupération dans la cage sans intervention sur l’animal) – Imagerie in vivo : jusqu’à 6 sessions/animal (durée < 1 h). - Lavage broncho-alvéolaire (LBA) : 3 prélèvements (20 min). Juvéniles et adultes : - Anesthésie : 11/animal (30min à 1h) - Prélèvement de sang : 10/animal (5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 10 fois par animal (5 min). - LBA : 5 max (20 min) - Exposition virale : 1 exposition, 30 min - Implantation d’une puce de suivi de la température : 1 fois, 30 min - Imagerie in vivo : 4 sessions max (< 1 h). - Suivi de la respiration : 3/animal (10 min) - Hébergement individuel : 1 fois, 4 semaines max Mères : - Anesthésie : jusqu’à 40/ animal (30 min-1h) - Echographies : 2-3 fois (intervalle 1 mois entre, 30 min) - Prélèvement de sang : Jusqu’à 25 fois en moyenne/animal (durée 5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : Jusqu’à 25 fois en moyenne (5min) - Lait maternel : 25 collectes (10 min) - LBA : Jusqu’à 7 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : 5 ponctions (20 min) - Vaccination : 1 injection au cours de la gestation (5min) Nouveau-nés : - Anesthésie : jusqu’à 45/animal (15 et 30min) - Prélèvement de sang : jusqu’à 45/animal (5min par prélèvement) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 45/animal (5min) - LBA : jusqu’à 17 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 (20min) - Exposition virale : 1 exposition (30min) - Traitement antibiotique ou probiotique : 1 administration/jour pendant 1 à 4 semaines (20min) - Imagerie in vivo : 3 sessions (< 1 h)Euthanasie en fin d’étude

Nous distinguons les effets de l’expérimentation des effets liés aux infections et traitements. Chez les nouveau-nés, les juvéniles et les adultes, l’infection par le VRS entraîne, d’après la littérature, des formes le plus souvent asymptomatiques, légères ou modérées. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle et néonatale pourrait être associée à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec rougeur et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. La fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie, sous anesthésie ou vigiles, peuvent engendrer une hypothermie transitoire, un stress, interférer avec la croissance du nouveau-né ou impacter la relation mère/nouveau-né voire un risque de rejet. De même, le sevrage peut entraîner un stress lié à la séparation avec la mère. Les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer des perturbations transitoires du profil hématologique. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères.

Les juvéniles et les adultes seront gardés en vie à la fin de l’étude pilote et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié. Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées sur avis vétérinaire. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.

Ce projet a pour objectif final d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non-humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en termes de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’humain pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. L’étude pharmacocinétique de molécules telles que les antibiotiques, ne nécessite pas d’être faite chez le juvénile ou le nouveau-né et se fera sur l’adulte car leur maturité physiologique permet une caractérisation stable et reproductible des profils d’exposition, ce qui facilite l’optimisation des doses et des modalités d’administration avant leur transposition aux animaux plus jeunes. Des animaux juvéniles et adultes sont également mobilisés pour la mise au point et la validation du modèle d’infection par le RSV, les juvéniles présentant un système immunitaire encore en développement, plus proche de celui des nouveau-nés que celui des adultes, tout en permettant des investigations expérimentales plus robustes et moins contraignantes. Cette étape est nécessaire pour établir les conditions d’infection, évaluer la pertinence immunologique du modèle et sécuriser son transfert ultérieur aux stades néonataux. Enfin, notre étude, qui s’intéresse à des développements in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.