Amélioration de la réponse à la stimulation ovarienne chez la ratte Wistar par immunothérapie

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d’ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l’avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n’a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d’injection ce qui augmenterait le nombre d’animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d’anomalies biologiques, les animaux concernés feront l’objet d’une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.