Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-044006)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’ADN, qui contient l’ensemble des informations nécessaires au fonctionnement de nos cellules, est organisé sous une forme compacte appelée chromatine. Cette structure doit être souple et adaptable pour permettre aux cellules de fonctionner correctement. Lorsque cet équilibre est perturbé, cela peut entraîner des maladies, notamment des maladies dites « épigénétiques », qui affectent l’expression des gènes sans modifier directement l’ADN. Le syndrome de Rett est un exemple de maladie épigénétique rare qui touche presque exclusivement les filles. Il se manifeste par des troubles du développement neurologique entraînant un polyhandicap sévère, incluant une déficience intellectuelle, des troubles du spectre autistique et des complications respiratoires et cardiovasculaires pouvant réduire l’espérance de vie. Cette maladie est liée, dans la majorité des cas, à une mutation du gène MeCP2, situé sur le chromosome X. Les recherches sur le syndrome de Rett reposent en grande partie sur des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’étudier la fonction de MeCP2 dans le cerveau. Il a ainsi été démontré que cette protéine joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. Nos travaux récents suggèrent que le syndrome de Rett pourrait être une maladie de la chromatine : la mutation de MeCP2 empêcherait son rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine des neurones, en perturbant son interaction avec certaines séquences répétées d’ADN. Pour mieux comprendre cette hypothèse, nous étudierons la fonction de MeCP2 dans le développement du cortex chez un modèle murin du syndrome de Rett.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet associera différentes approches fonctionnelles à l’échelle du génome novatrices et complémentaires. Il permettra une meilleure compréhension de la fonction neuronale de MeCP2, et clarifia l’étiologie moléculaire du syndrome de Rett. Les données obtenues pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie neuro-développementale sévère et incurable. De plus, nos travaux contribuent à la compréhension du rôle des courtes séquences d’ADN répétées sur l’organisation tridimentionnelle du génome et l’expression des gènes au cours du développement du cerveau, et peuvent avoir un impact plus large, notamment sur l’identification des mécanismes moléculaires impliqués dans les troubles du spectre autistique et dans les maladies neurodégénératives.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Nous envisageons d’effectuer nos expériences sur des cortex prélévés sur des souris agées de 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. Mais le déficit neurologique des mâles dépourvus en MeCP2 débute entre 4 et 5 semaines, entrainant une létalité de 50% à 6 semaines et de 90% à 8 semaines. Les souris agées de 6 ou 8 semaines seront donc probablement difficile à obtenir. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal pour ces souris, nous avons choisi une application stricte de point limite dès les premiers signes de souffrance (diminution importante de l’activité motrice ou prostration, difficulté respiratoire majeure ou perte de poids supérieure à 20% au poids attendu). Les souris seront observées quotidiennement, l’une de ces observations suffira à mettre en œuvre le point limite et les animaux seront mis à mort.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les troubles neurologiques décris chez les souris où MeCP2 a été inactivée spécifiquement dans le cerveau à un stade embryonnaire précoce sont bien décris. Ils apparaisent vers la 5ème semaine et associent de l’ataxie, une hypoactivité, des tremblements, de la nervosité, une respiration diffcile et une perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem du cortex.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
En associant des données biochimiques, structurales obtenues in vitro à des données génomiques obtenues à partir de cellules en culture, nous avons accumulé beaucoup de résultats préliminaires qui suggèrent que MeCP2 puisse agir comme un facteur de transcription pionnier dans les neurones, capable d’envahir la chromatine en se liant aux répétitions CA. Le syndrome de Rett pourrait ainsi être considéré comme une « maladie de la chromatine » provenant de l’incapacité qu’a MeCP2, lorsqu’elle est mutée, à moduler l’organisation de la chromatine. Nous souhaitons dans ce projet valider définitivement notre hypothèse de travail par des expériences effectuées sur l’animal, étape indispensable pour le développement d’approches thérapeutiques.
2. Réduction
Nous ne travaillerons que sur des souris mâles pour lesquelles l’expression de MeCP2 aura été supprimée dans le cerveau, car les femelles équivalentes ne sont pas viables. L’objectif est ensuite de minimiser le nombre d’animaux utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives des données issues des analyses par séquençage haut-débit et atteindre l’objectif scientifique du projet. Nous estimons que de 3 à 5 réplicats biologiques seront nécessaires par expérience et par âge, soit un total de 240 souris en tenant compte de leur mortalité précoce.
3. Raffinement
Les mâles KO pour MeCP2 présentent une régression neurologique importante conduisant à une mort prématurée typiquement entre 6 et 8 semaines. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal, nous avons choisi une application stricte de point limite. Les souris seront observées quotidiennement et notées selon une grille de scoring de la douleur appliquée à l’animalerie qui repose sur l’aspect général (poids corporel, apparence physique, signes cliniques mesurables) et le comportement (modifications du comportement non provoqué, et après stimulation) : -Un score de niveau zéro n’entrainera aucune intervention particulière. -Un score de niveau 1 entrainera des soins spécifiques comme l’utilisation d’aliments gélifiés à même la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture des animaux présentant une hypoactivité ou de l’ataxie, l’utilisation de tunnels de transfert pour la manipulation des souris présentant un phénotype de nervosité, l’utilisation d’analgésiques complémentaires, un contrôle biquotidien, une pesée régulière, une consultation éventuelle avec la Structure du Bien-Etre Animal et le vétérinaire. -Un score de niveau 2 sera le point limite et nécessitera une décision de mise à mort par la méthode de dislocation cervicale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La lignée de souris crée est le modèle murin idoine puisqu’il développe des symptômes cliniques similaires au syndrome de Rett, avec un déficit neurologique sévère qui apparait vers la 5ème semaine et une létalité de 50% à 6 semaines. Pour ces raisons, nos expériences seront limitées aux 8 premières semaines de vie mais à différentes étapes du développement du cortex : 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. La multiplication des points de cinétique est essentielle à notre étude puisqu’elle permettra de vérifier si la fonction chromatinienne de MeCP2 lors du développement post-natal, est concommitante à l’apparition des troubles neurologiques dans les neurones en maturation dépourvus de MeCP2.