Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth

Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d’utiliser ces souris et de moduler l’expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d’atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l’injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.

Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.

Pour réguler l’expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des AAV) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d’un dynamomètre et la force d’agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d’enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chaude à 52°C et la latence de réaction sera notée avant de sortir l’animal avec un temps limite de 30 secondes. Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l’activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale.

Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux Mtmr KO âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d’expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n’engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l’animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l’animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure.

Nous feront une première étude préliminaire où les animaux seront euthanasiés à 6 mois pour étude histologique du nerf sciatique et vérification des phénotypes décrits dans la littérature scientifique. Nous nous formerons à l’injection intracérébroventriculaire et les animaux utilisés seront mis à mort le premier jour (P1) après formation. Nous nous formerons à l’injection intrathécale et les animaux seront euthanasiés 15 minutes après formation. Pour l’évaluation de phénotype dommageable et étude histologique à six mois après modulation de l’expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d’AAV, les animaux seront mis à mort entre 8 et 11 semaines, 2 mois après injection d’AAV pour étude histologique du nerf sciatique (signal GFP). Pour la caractérisation comportementale des animaux après modulation de l’expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d’AAV, les animaux seront mis à mort à 1 an après caractérisation comportementale pour étude histologique du nerf sciatique.

Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D’autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l’expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d’administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l’apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s’aggravent avec l’âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d’une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.