Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/10/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-542776)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l’impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l’établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes molécules thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour tous les gestes techniques, les animaux seront anesthésiés. Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Les animaux seront analysés par microscopie d’imagerie en direct (10 minutes d’imagerie par point de temps) avec une coloration in vivo pour les tissus calcifiés (45 minutes de coloration et de lavage). Chaque animal sera soumis à cette procédure au maximum 7 fois (à 5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 jours post fertilisation) sur les 30 jours de l’expérience. Une échocardiographie (10 minutes d’imagerie par point de temps) sera réalisée au maximum 4 fois par animal sur une durée maximale de l’expérience de 60 jours. Certains poissons recevront 2 fois par jours une alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux sur une durée pouvant aller de 90 jours, voire plus. En ce qui concerne les traitements médicamenteux, si l’administration se fait dans un bain, l’incubation varie de 3 à 6h ; si l’administration du médicament se fait par injection, le temps d’anesthésie est inférieur à 2 minutes et l’injection est très rapide (quelques secondes). Les poissons seront traités pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. Les médicaments seront administrés en doses uniques ou répétées en fonction de leur durée de vie et des périodes d’absorption. Une autre intervention consistera en un choc thermique local d’une durée inférieure à une minute suivi de 10 minutes d’imagerie par point de temps. L’expérience pourra durer jusqu’à 90 jours, ou plus. Concernant le génotypage des poissons, les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) pour une biopsie (quelques secondes). Les poissons seront isolés jusqu’au résultat de la biopsie (2 à 7 jours).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux adultes seront soumis, lors de l’administration des médicaments ou des composés destinés au traçage et au marquage des cellules, à une injection d’une durée inférieure à 30 secondes, douleur légère. L’effet du médicament ou du traitement peut entraîner des phénotypes spécifiques d’une durée de 1 à 14 jours dont les douleurs seront de classe légère à modérée. Les études échographiques pourront engendrer une douleur légère de courte durée (5 minutes maximum). Pour les besoins expérimentaux, les animaux pourront être hébergés de manière isolée pouvant durer jusqu’à 14 jours (sévérité légère à modérée selon la durée). Les phénotypes dommageables potentiellement observés sur les lignées mutantes incluent des modifications de la morphologie (déformations squelettiques, variations de taille ou de l’opercule), des atteintes oculaires ou des nageoires, ainsi que des changements d’aspect ou de vitalité liés au vieillissement. Les niveaux de sévérité peuvent varier de léger à modéré sur une durée de 6 mois maximum. Une surveillance accrue sera effectuée afin de prévenir et limiter la souffrance des animaux. Tout individu présentant des effets indésirables entraînant une souffrance significative sera mis à mort.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organe et analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro pour comprendre la calcification cardiovasculaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques complexes de ces maladies, puisqu’elles résultent de l’action de multiples facteurs et types de cellules. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture. L’utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
2. Réduction
La diversité entre les individus, particulièrement prononcée chez les jeunes poissons zèbres (à leurs stades larvaires), explique pourquoi il est nécessaire d’utiliser un plus grand nombre d’animaux afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour valider nos résultats. De même, la calcification cardiovasculaire, qui évolue progressivement et de manière très variable, requiert également un nombre accru d’animaux pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que chaque fond génétique peut présenter une variabilité différente, nous prévoyons de réaliser nos expériences en plusieurs étapes, augmentant progressivement notre effectif, afin d’éviter d’utiliser un surplus d’animaux si la puissance statistique est atteinte avec un effectif moindre. Par conséquent, le nombre d’animaux requis correspond au maximum que nous pouvons utiliser. Étant donné la nature dynamique et hétérogène de la calcification cardiovasculaire, nous suggérons d’exploiter et de créer un grand nombre de lignées génétiques. Ceci permettra d’explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à l’établissement et à l’aggravation du phénotype de calcification. En utilisant des techniques d’imagerie en direct, nous serons en mesure de suivre la progression individuelle de la calcification chez les mêmes animaux, réduisant ainsi le recours habituel à un grand nombre d’animaux pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem ainsi que les coupes histologiques de tissus.
3. Raffinement
Tout au long de notre projet, les animaux seront maintenus dans des conditions optimisées pour assurer leur bien-être. Les paramètres de l’eau (température, conductivité et pH) ainsi que le cycle lumineux seront contrôlés. Un enrichissement sera assuré par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Des points limites sont fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. De plus, nous utiliserons des procédures non invasives (imagerie, échocardiographie) afin de caractériser le processus de calcification cardiovasculaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre est un modèle idéal pour la recherche en raison de ses caractéristiques uniques. Sa transparence durant les premières semaines après la fécondation permet des techniques d’imagerie exceptionnelles, impossibles avec d’autres modèles. Sa petite taille et sa grande progéniture facilitent son hébergement et sa manipulation, favorisant les études à haut débit. De plus, ses techniques avancées de transgenèse et de mutation offrent diverses méthodes pour étudier spécifiquement les gènes et les voies de signalisation. La similitude marquée entre le poisson zèbre et les mammifères renforce sa valeur en tant qu’organisme modèle. Sa remarquable capacité de régénération tissulaire tout au long de sa vie le rend particulièrement intéressant d’un point de vue d’application clinique. Pour notre projet, le poisson zèbre offre la possibilité d’acquérir des images en temps réel à différents stades de développement et de cibler des cellules spécifiques grâce à des techniques d’ablation génétique. Cela en fait l’organisme idéal pour notre étude sur l’établissement de la calcification cardiovasculaire, aussi bien au cours du développement que chez les adultes. Nous examinerons les stades larvaires et juvéniles (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 jours post-fécondation) pour comprendre les étapes clés du développement cardiovasculaire, ainsi que les stades adultes (60, 90 et >90 jours post-fécondation) pour observer les tissus sains et malades chez les jeunes et les animaux plus âgés.