Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 07/08/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-694054)
Sectionnées à l’extrémité de la queue entre sept et dix jours pour le génotypage, puis soumises entre deux et cinq mois à une à quatre échographies cardiaques de dix minutes sous anesthésie gazeuse, 137 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d’entre elles et modéré pour 77. Certaines subissent ensuite deux jeûnes de vingt-quatre heures séparés par deux heures d’accès à la nourriture, d’autres un gavage ou une injection intrapéritonéale. Quatre heures après cette injection, elles sont tuées. Le cœur et parfois les muscles des pattes sont alors prélevés, sur des animaux porteurs d’une mutation qui provoque chez eux une insuffisance cardiaque.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La cardiomyopathie dilatée (CMD) humaine est une maladie grave conduisant à l’insuffisance cardiaque (IC) et est la première cause de transplantation cardiaque. Les apports récents de la génétique ont permis l’identification de nombreuses causes génétiques de cette maladie. L’hétérogénéité génétique est très importante avec environ 30 gènes et de multiples mutations essentiellement privées impliqués à ce jour. Ces découvertes n’ont cependant pas été accompagnée, le plus souvent, de l’étude des mécanismes physiopathologiques. Dans cette pathologie à forte composante génétique les traitements restent avant tout symptomatiques, et non curatifs, et la compréhension des voies physiopathologiques apparaît indispensable pour avancer vers l’identification de cibles thérapeutiques potentielles. Nous avons, au laboratoire, identifié un gène portant des mutations responsables de CMD et fait développer par un prestataire un modèle de souris dans lequel nous avons introduit une mutation identifiée chez un patient. Ce modèle reproduit la maladie, avec le développement d’une insuffisance cardiaque dès les premières semaines de vie des animaux pour les cas les plus précoces. Les objectifs du projet visent à caractériser aux niveaux moléculaires et cellulaires les conséquences de la mutation dans ce modèle murin. Cela permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques à l’origine de la maladie et servira à la mise en place de nouvelles thérapies.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La cardiomyopathie dilatée humaine (CMD) est une maladie grave conduisant à l’insuffisance cardiaque et est la première cause de transplantation cardiaque. La prévalence de la CMD est estimée à environ 1 cas pour 2500-3000 personnes, estimation qui peut varier avec l’âge, le sexe, les facteurs environnementaux et la génétique des individus. Ce projet permettra d’avancer dans la compréhension des mécanismes conduisant à la cardiomyopathies dilatée associée à des mutations du gène d’intérêt et ainsi révéler d’éventuelles cibles thérapeutiques appartenant aux voies de régulation de la protéostasie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Selon la procédure: Certains animaux seront soumis à 1 à 4 échographies cardiaques d’une durée de 10 minutes chacune sous anesthésie gazeuse (âges 2 à 5 mois). Les animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à un jeûne de 2 fois 24h séparées par un accès libre pendant 2h à la nourriture (procédure de synchronisation du jeûne) puis à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à une contention et un gavage qui dure au maximum 10 secondes en 1 seule fois ; ou à une contention et l’injection suivies du massage de la zone d’injection qui dure au maximum 20 secondes en 1 seule fois. Les animaux sont génotypé après section instantanée de l’extrémité de la queue à l’age de 7 à 10 jours.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances découlant des procédures sont, 1/ L’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des animaux réalisée par un seul prélèvement à l’extrémité́ caudale ce qui peut être source de stress et d’une douleur de courte durée, 2/ Stress lié à la contention lors de la phase d’anesthésie gazeuse lors de l’échographie ainsi que les risques anesthésiques (stress thermique, détresse respiratoire, etc.) durant les échographies, 3/ Pour les animaux subissant une injection intrapéritonéale, nuisance liée à douleur et au stress de l’injection elle-même 4/ Pour tous les animaux devant être pesés manipulation par l’expérimentateur et contrainte spatiale de courte durée, et enfin 5/Les challenge métaboliques un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures 6/ une nuisance liée au gavage (irritation, stress de manipulation, risque de fausse-route) est possible. 7/ Les animaux utilisés peuvent avoir un phénotype entrainant une insuffisance cardiaque
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
les procédures sont toutes suivies de l’euthanasie des animaux pour pouvoir collecter le tissus d’intérêt (ici le coeur et parfois les muscles des jambes).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex-vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons des procédures d’établissement de Cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme in vitro) et utilisons également ce modèle. Cependant, ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration des signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
2. Réduction
Les modèles cellulaires seront cependant utilisés quand cela sera adapté, pour valider les observations fonctionnelles, moléculaires et cellulaires du modèle murin et cela dans le but de limiter le recours à de plus nombreux animaux. Le nombre d’animaux requis est réduit en limitant la taille des groupes et en utilisant une approche statistique non-paramétrique (indiquée pour les petits effectifs) tout en maintenant une puissance statistique nécessaire. Dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les procédures ne seront réalisées que sur les souris mâles d’un seul génotype quand cela est adapté, qui présentent le phénotype d’insuffisance le plus précoce. Le phénotype des animaux issus d’un croisement de notre lignée, porteuse d’une mutation d’intérêt, avec une lignée porteuse d’une mutation pathologique d’un autre gène n’est pas connu. Ainsi une étude pilote sera effectuée sur quelques animaux afin de déterminer les conditions optimales de l’expérimentation en observant les phénotypes cardiaque et musculaire de la lignée hybride nouvelle ainsi qu’en fixant la variable d’âge d’observation et l’éventuelle atteinte du point limite de fonction cardiaque. 137 animaux seront utilisés au total dans ce projet.
3. Raffinement
Il s’agit de fournir aux animaux un environnement enrichi avec du coton et des caches en carton. Les animaux ne restent pas seuls dans les cages. Les cages sont nettoyées une fois par semaine. Les procédures proposées dans ce projet restent peu douloureuses et parcimonieuses (une seule injection /échocardiographies pour l’étude pilote uniquement). L’injection (solution saline ou chloroquine, insuline) est unique et réalisée par du personnel expérimenté et le jeûne est réalisé avec un accès constant à l’eau. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures et les tissus collectés pour maximiser l’information analysable à partir de chaque animal inclus dans le protocole. La procédure d’échocardiographie est non invasive et le bien-être des animaux, en particulier en relation avec l’éventuelle dégradation de leur fonction cardiaque, sera surveillé. La procédure d’échographie permettant le suivi de la fonction cardiaque est indolore puisque réalisée sous anesthésie légère respiratoire et sur plaque chauffante pour éviter l’hypothermie. L’utilisation des contrôles identiques aux deux protocoles de stimulation sera choisie si les résultats du pilote indiquent cette possibilité. Les points limites entrainants l’arrêt de l’expérimentation sont précisés pour chaque procédure.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris a été choisie dans le cadre de ce projet puisqu’il s’agit de réaliser un croisement de lignées préexistantes pour produire un hybride de deux anomalies génétiques. Le recours à cette espèce est lié au fait que nous possédons déjà des informations sur des lignées développant une cardiomyopathie dilatée en relation avec l’atteinte génétique du gène d’intérêt, qui permettront des comparaisons, un approfondissement des connaissances et d’éventuelles généralisations sur les mécanismes de la pathogénèse. La génétique du modèle souris est bien connue ainsi que la maitrise des techniques de modification des gènes utilisé dans ce projet. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés de 2 mois à 5 mois. A ces âges, le phénotype pathologique est présent mais l’insuffisance cardiaque reste à un stade modéré, ce qui permettra la mise en place des différentes expériences sans souffrance animale anticipée.