Étude des fonctions génétiques et des caractéristiques épigénomiques des noyaux musculaires à la jonction neuromusculaire et à la jonction myotendineuse à l’aide d’AAV.

Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l’intérieur d’une seule cellule. Un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées. Les noyaux situés dans la partie centrale des cellules musculaires sont en contact avec les motoneurones. Cette région est appelée la jonction neuromusculaire (JNM). La contraction de nos muscles commence au niveau de la JNM lorsque les motoneurones stimulent les cellules musculaires. Une JNM défectueuse est observée dans diverses maladies musculaires et peut entraîner de nombreux symptômes dévastateurs. Les noyaux situés aux extrémités des cellules musculaires sont en contact avec les tendons. Cette région est appelée jonction myotendineuse (JMT). Elle est responsable de l’amortissement de la force contractile du muscle. La JMT est la partie la plus touchée par les blessures lorsque nous faisons de l’exercice et revêt donc une grande importance pour la régénération et la réadaptation musculaires. Ces régions sont toutes les deux essentielles au bon fonctionnement du muscle squelettique, et il est nécessaire de mieux comprendre leur fonctionnement. Récemment, mon équipe a identifié de nombreux gènes qui ne sont exprimés que dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Cette découverte nous offre une nouvelle opportunité d’étudier la biologie de ces deux jonctions. Sur la base de ce contexte, nous avons deux objectifs dans ce projet. 1) Nous allons étudier les fonctions des gènes spécifiques de la JNM ou de la JMT que nous avons découverts. Nous injecterons dans le muscle des virus porteurs de petites séquences d’ARN ciblant les gènes d’intérêts qui réduiront leur expression lorsqu’ils sont présents dans une cellule. Si ces gènes jouent un rôle important dans la fonction de la JNM ou de la JMT, la perte de son expression entraînera des symptômes liés à une déficience de l’une ou l’autre de ces jonctions. 2) Nous isolerons des noyaux au niveau de la JNM ou de la JMT pour étudier plus en détail l’organisation des structures dans ces noyaux. Cela nous permettra de comprendre comment ils se spécialisent alors qu’ils se trouvent à l’intérieur de la même cellule. Pour ce faire, nous injecterons des virus exprimant des protéines fluorescentes uniquement dans les noyaux de l’une ou de l’autre de ces jonctions. La fluorescence nous permettra d’isoler ces noyaux.

Notre projet permettra d’identifier de nouveaux gènes qui sont essentiels à la fonction de la JNM ou de la JMT et fournira également des informations sur la façon dont ces domaines musculaires sont formés. Cela présente de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l’exercice et des maladies qui provoquent des défaillances d’une de ces deux jonctions. La conception de notre projet a également pour avantage de réduire le nombre d’animaux utilisés. À terme, l’analyse complète de la fonction d’un gène nécessite la génération de lignées de souris génétiquement modifiées. Cependant, la modification génétique des souris est très longue et coûteuse, et il est donc difficile d’étudier tous les gènes par cette méthode. Dans notre étude, nous utilisons des virus pour réduire l’expression des gènes recherchés. Cela nous permet de tester rapidement la fonction d’un grand nombre de gènes candidats et d’identifier les gènes à privilégier pour une étude plus approfondie à l’avenir. Par conséquent, notre conception a l’avantage de réduire considérablement le nombre d’animaux par rapport à l’étude de chaque gène individuel par modification génétique.

1. Injection intramusculaire ou intrapéritonéale : Il s’agit d’interventions très rapides dont seule l’introduction de l’aiguille provoque une douleur. L’injection ne dure que quelques secondes et l’intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, les elles retourneront dans leur cage d’origine. 2. Mesure de la force de préhension (String, Grip et Hanging) et entraînement à l’exercice (Rotarod et Treadmill) : Il s’agit de procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Les souris feront les 3 mesures de la force de préhension (lot 1 et 2 de la procédure 3) et un des 2 entrainement à l’exercice (uniquement lot 2 de la procédure 3) 3 fois par jours, 1 fois par semaine chacun des tests sur une période de 7 semaines après l’injection d’AAV. Elles retourneront ensuite dans leur cage d’origine. 3. Mesure de la force contractile in situ : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.

Les procédures d’injection ou les tests de phénotypage musculaire eux-mêmes ne causeront pas d’effets indésirables. Cependant, comme la délivrance systémique de virus adéno-associés peut également diminuer l’expression des gènes candidats dans d’autres tissus que les muscles ciblés, des effets indésirables inattendus, en raison de leur faible musculature, pourraient être observés. La mesure de la force contractile in situ est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant la fin des effets de l’anesthésie afin d’éviter toute douleur ou effet indésirable.

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d’animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques par injection de virus adéno-associés sont mieux établies dans ce modèle. Ces facteurs nous permettent d’obtenir un maximum de résultats par animal et de minimiser le nombre total d’animaux utilisés. En outre, le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir des gènes exprimés dans les noyaux de la JNM ou de la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet.