Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 19/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-769990)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’hippocampe est une structure cérébrale impliquée dans la mémorisation. Les patients atteints d’une mutation affectant certains gènes présentent des déficits cognitifs sévères et des épilepsies résistantes aux traitements. Les souris portant une mutation sur ces gènes sont un modèle de choix pour mimer la pathologie humaine et présentent des défauts de développement de l’hippocampe et également une propension à l’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre l’origine de ces défauts et de tenter de les corriger. En effet, les cellules progénitrices se divisent et génèrent des neurones qui vont migrer jusqu’à leur destination finale dans l’hippocampe. Cette migration des neurones est très finement régulée. Une des pistes de recherche nouvelle consiste à comprendre comment la régulation du métabolisme énergétique par ces gènes et les composantes des microtubules contrôle cette migration.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les malformations au niveau du cortex cérébral sont des maladies rares (incidence 1:100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une chirurgie est réalisée sur des femelles gestantes sous anesthésie générale avec analgésie pendant une durée d’environ 45 minutes. Une injection, soit en aiguë (injection unique sur animal vigile d’une durée de 30 secondes), soit en chronique (une injection par jour pendant 5 jours) d’agents pharmacologiques est administré à des femelles gestantes. Les embryons traités in utero sont euthanasiés à l’âge adulte au cours d’une chirurgie réalisée sous anesthésie générale, avec administration préalable d’un traitement analgésique. La procédure dure environ 10 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le phénotype dommageable se manifeste par une hyperactivité persistante et, dans environ 50 pour cent des cas, par des crises d’épilepsie légères survenant au repos ou pendant le sommeil lent. Ces troubles entraînent fatigue, stress et perturbation du sommeil . Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. L’injection d’agents pharmacologiques peut induire une péritonite au niveau du site d’injection.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses histologiques. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont subi une chirurgie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d’étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes. Des données préliminaires in vitro de notre équipe, ont montré un rôle du gène étudié dans la régulation du transport axonal au niveau cellulaire. Nous étudierons son rôle sur des cultures de tranches de cerveau, ex vivo.et in vivo.
2. Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. Pour les études d’immunohistochimie après électroporation, 10 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Dans le cas du protocole d’électroporation, en moyenne, 4 embryons sont correctement électroporés dans l’hippocampe par souris gestante sur 6 embryons électroporés. Ces considérations permettent de limiter le nombre de souris nécessaires. Le nombre total d’animaux utilisé est de 4860.
3. Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois par jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s’occupe bien d’eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin de limiter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées (points limites définis). Les souris sont placées dans les cages avec de la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont anesthésiées et placées sur une plaque chauffante, et reçoivent des injections sous-cutanées d’analgésiques, une analgésie locale sur le site d’incision. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (points limites définis et traitement des plaies). Une échelle de grimace est utilisée pour déterminer le niveau de douleur, ainsi que des comportements anormaux comme le manque de toilettage. L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique de chirurgie d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 16,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu’à l’organisation des couches corticales (stades juvéniles à la naissance, 7 et 15 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d’apprécier l’impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype ou de son atténuation/correction.