Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/03/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-213960)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
2. Réduction
Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.
3. Raffinement
Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.