Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 01/04/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-260634)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, pour Plasmodium falciparum, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du mérozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins contre Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L’exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l’adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les souris et tous les rats ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l’hôte. Il existe aujourd’hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d’ADN ou d’ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d’anticorps de Plasmodium n’a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium. De plus, l’utilisation de souris préalablement infectées par du Plasmodium berghei permet de valider les préparations vaccinales avant d’envisager de futur développement de ces vaccins.
2. Réduction
LE NOMBRE DE SOURIS ET DE RATS POUR CHAQUE EXPERIMENTATION A ETE CALCULE AU PLUS JUSTE POUR PERMETTRE L’UTILISATION D’UN NOMBRE MINIMUM D’ANIMAUX. CETTE ESTIMATION A ETE REALISEE EN CONCERTATION AVEC UN BIOSTATISTICIEN. AINSI, NOUS AVONS CHOISI DES GROUPES DE 7 SOURIS ET 5 RATS DONT LES SERUMS SERONT POOLÉS AFIN D’AVOIR UNE QUANTITE DE SERUMS SUFFISANTE POUR UNE ETUDE APPROFONDIE ET REPETEE. IL N’EXISTE PAS ACTUELLEMENT DE SYSTEME QUI PERMETTE DE REPRODUIRE LE CYCLE DE VIE COMPLET DE PLASMODIUM IN VITRO. PAR CONSEQUENT, POUR REALISER CE PROJET, DES INFECTIONS HEBDOMADAIRES DE RONGEURS ET DE MOUSTIQUES SONT NECESSAIRES. LES PROTOCOLES UTILISES ONT ETE MIS AU POINT DANS DIFFERENTS LABORATOIRES Y COMPRIS LE NOTRE ET TOUTES LES ETAPES SONT BIEN MAITRISEES NOUS UTILISONS LE NOMBRE MINIMAL POSSIBLE D’ANIMAUX POUR NOS EXPERIENCES. POUR LES PROCEDURES 1, 2 ET 3, EVALUATION DES CANDIDATS VACCINS A ARNM, NOUS UTILISERONS DES SOURIS ET DES RATS POUR TESTER LA REPONSE IMMUNITAIRE. POUR LA PROCEDURE 4, PREPARATION DE STOCKS DE SANG INFECTE POUR P. BERGHEI, NOUS UTILISONS DES RATS CAR LEUR VOLUME SANGUIN EST PLUS IMPORTANT QUE CELUI DES SOURIS. AINSI NOUS REDUISONS LE NOMBRE D’ANIMAUX UTILISES.
3. Raffinement
Si signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation. 1) Les souris ET LES RATS sont hébergés dans des animaleries agrées de l’Institut Pasteur dans des conditions optimales répondant aux normes européennes, avec une surveillance quotidienne. La température, l’hygrométrie et la photopériodicité sont très rigoureusement contrôlées par le système d’alarmes informatisé. L’accès est strictement contrôlé (badge) et les animaux sont manipulés par des techniciens qualifiés et par des expérimentateurs formés. 2) Les souris ET LES RATS sont inoculés avec P. berghei, espèce adaptée aux rongeurs de laboratoire, par voie intrapéritonéale ou intra-veineuse. Il s’agit de gestes rapides. Le niveau de parasitémie durant la phase sanguine est suivi quotidiennement à partir du jour 3. De plus et si nécessaire, nous utiliserons la grille standard comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l’état de santé des animaux. Les critères principaux évalués seront les suivant : poils hérissés, motricité lente, prostration, pâleur des pattes (anémie). LES ANIMAUX OBTENANT UN SCORE DE 2 POURRONT BENEFICIER DE MESURES D’AMELIORATION DES CONDITIONS D’HEBERGEMENT (ENRICHISSEMENT, CHAUFFERETTE) ET DE L’ALIMENTATION (GEL DIETETIQUE). POUR UN SCORE SUPERIEUR A 2, ILS SERONT MIS A MORT. 3) POUR EVITER LA DOULEUR ET LA SOUFFRANCE PENDANT CERTAINES MANIPULATIONS, LES SOURIS SONT ANESTHESIEES..
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi de produire nos anticorps ET D’EVALUER NOS CANDIDATS VACCINS chez la souris ET LE RAT car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes CHEZ CES ANIMAUX. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris ET DES RATS avant de continuer leurs développements. LES HOTES NATURELS DES PARASITES P. BERGHEI SONT DES ESPECES DE RONGEURS SAUVAGES D’AFRIQUE CENTRALE. DES ISOLATS DE CE PARASITE ONT ETE TRANSMIS ET ADAPTES AUX SOURIS ET RATS DE LABORATOIRE DEPUIS DE NOMBREUSES ANNEES PAR PLUSIEURS EQUIPES. IL EST RECONNU DANS LA COMMUNAUTE SCIENTIFIQUE QUE L’INFECTION DES RONGEURS AVEC CES PARASITES EST UN MODELE BIOLOGIQUEMENT PERTINENT POUR ETUDIER PLUSIEURS ASPECTS DU PALUDISME CHEZ L’HOMME. Les souris ET LES RATS utilisés pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.