Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-304689)
246 souris porteuses d’une mutation du gène Fmr1, modèle du syndrome de l’X fragile, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des séances de stimulation ultrasonore transcrânienne sous anesthésie puis une perfusion intracardiaque létale, pour évaluer un effet thérapeutique sur des symptômes autistiques. Le porteur qualifie la stimulation de non invasive et indolore et présente les tests comportementaux comme classiques et sans effet indésirable. Il justifie le modèle murin par l’absence de méthode in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de la stimulation transcrânienne ultrasonore focalisée (tFUS) chez la souris KO Fmr1 (dont le gène FMR1 est inactif et produisant un modèle de profil autistique et de syndrome de l’X fragile), d’évaluer les symptômes associés à ce modèle et aux effets de la tFUS. Notre approche expérimentale permettra d’évaluer les effets comportementaux et neurobiologiques de la tFUS et donc d’estimer son potentiel thérapeutique. Le projet comprendra 2 étapes : (a) Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) dans la lignée Fmr1 KO. Cette étape sera réalisée dans le but de trouver les paramètres optimaux de stimulations cérébrales dans la lignée de souris Fmr1 KO. Le laboratoire a déjà l’expérience de cette technique dans d’autres lignées. Toutefois, ces paramètres peuvent varier d’une lignée de souris à l’autre, et il est conseillé de valider l’approche et les paramètres avant d’engager plus d’animaux dans des expériences chroniques. (b) Evaluation du phénotype autistique des souris Fmr1 KO et des potentialités thérapeutiques du tFUS Cette étape correspondra à l’étude du phénotype comportemental induit par modèle en lui-même et à l’évaluation des éventuels effets thérapeutique du traitement tFUS sur les symptômes de type autistique. Pour une caractérisation la plus complète, les souris passeront une batterie de test comportementaux qui permettront d’évaluer les différentes dimensions symptomatiques du trouble du spectre de l’autisme et de déterminer ensuite si les eventuels effets thérapeutiques du tFUS se concentrent plus fortement sur certaines dimensions particulières ou sur la globalité du trouble et cela en fonction de la zone cérébrale ciblée.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet pourra permettre de caractériser précisément les effets de la neurostimulation ultrasonore trancrânienne in vivo. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutique de la neurostimulation ultrasonore transcrânienne et de son utilisation dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques puis chez les sujets humains.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédure 1 : Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) dans la lignée Fmr1 Chaque souris sera soumise à une séance de stimulation transcrânienne ultrasonore (tFUS) sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Procédure 2 : Evaluation du modèle et des effets thérapeutiques du tFUS Chaque souris sera exposée à 5 séances de stimulations ultrasonores réels ou simulées (témoin) de 30 minutes chacune sur 5 jours. Chaque souris sera soumise à 16 tests comportementaux répartis sur 40 jours (et de durée maximum de 30 minutes par session et un seul par jour maximum). Aucun de ces tests n’induit des douleurs ou du stress excessif autre qu’être brièvement exposé à un nouvel environnement, un nouveau congénère ou un nouvel objet. Enfin, chaque souris sera soumise à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipalution et associé à l’installation dans le dispositif. Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration et bien caractérisés dans la littérature. Il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets indésirables.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Procédure 1 : Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure et les cerveaux sont récupérés afin d’effectuer des analyses histologiques et d’expertiser d’eventuels effets des stimulations ultrasonores Procédure 2 : Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure et les cerveaux sont récupérés afin d’effectuer des analyses histologiques et d’expertiser d’eventuels effets des stimulations ultrasonores.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le modèle du syndrôme de l’X fragile et de de l’aurisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
2. Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
3. Raffinement
La neurostimulation ultrasonore est une technologie actuellement en développement dans notre laboratoire, nous possédons donc le matériel le plus récent et le plus adapté pour ce type d’intervention. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux ne reçoivent aucun traitement qui pourrait interférer avec l’étude. Les animaux sont hébergés en cage avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les procédures d’anesthésie seront réalisées sous isoflurane (anesthesie gazeuse) qui représente une méthode optimale et recommandée, le débit et la concentration pouvant être contrôlés en temps réel, réduisant fortement tout risque de complication lié à l’anesthésie et permettant le réveil étant très rapide (quelques secondes ou minutes). Les procédures de ce projet n’induisent pas de douleurs ou d’inconvenance particulière. Toutefois, si une perte de poids ou des signes d’inconfort ou de douleurs apparaissent chez une souris, un traitement d’analgésie (metacam) sera fourni à la souris. Les points limites sont précisément définis : une perte de poids supérieure à 15%, ou une chute de température (diminution de 2°C ou < 35°C). Ces paramètres seront évalués quotidiennement. Dès qu’un problème minime est détecté, la souris est traitée avec un analgesique (metacam 20 mg/kg SC) et on passe à deux évaluations par jour. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration en 48 heures.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l’expérience du laboratoire dans l’évaluation de l’activité cérébrale in vivo ou comportementale des rongeurs, l’implémentation de neurostimulation adaptée aux rongeurs. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le modèle du syndrôme de l’X fragile et de de l’autisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. L’âge des animaux en début d’expérience sera P28 (lors de la détermination des seuils moteurs lors de l’étape 3). Il s’agit d’un stade prépubère ou pubère (début de maturité sexuelle) qui se justifie d’un point de vue translationnel. En effet, l’autisme étant un trouble du développement, il est préférable qu’un potentiel traitement intervienne le plus tôt possible lors du développement pour augmenter les chances de succès et son impact à long-terme. Nous avons donc choisi de soumettre les animaux à la tFUS après une semaine d’habituation postsevrage P28, puis d’évaluer le comportement et différentes dimensions symptomatiques dans les semaines suivantes afin d’évaluer les éventuels effets thérapeutiques du tFUS à court terme et leur maintien (ou non) à plus long terme.